柯萨奇病毒B3 cDNA生物素探针的制备研究

本文将柯萨奇B组3型病毒(CVB3)cDNA的重组质粒DNA(pGP51B)转化到E.coli HB101菌株中.筛选转化阳性菌株,经培养扩增后,提取重组质粒DNA,用缺口求移法制备生物素标记探针,通过原位杂交技术检测CVB1.CVB3感染的Hela细胞及正常Hela细胞对照.结果该探针只与CVB杂交,而不与细胞对照杂交,且可检测出病毒感染5h尚未出现病变细胞中的病毒核酸.表明该探针具有良好的特异性和敏感性.     

HBV─C基因探针的制备及应用

应用ＰＣＲ技术扩增出ＨＢＶＤＮＡＣ基因片段并与ｐＡＴ１５３质粒重组,转化到Ｅ．ｃｏｌｉＲＲＩ中,经体内扩增,提纯,用光生物素标记,制备了Ｃ基因的重组质粒探针。该探针检测灵敏度在Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹中达１ｐｇ,在点印迹中为５ｐｇ。用此探针以Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹方式配合ＰＣＲ技术检测乙肝病人血清中的ＨＢＶＤＮＡ,在５３例ＰＣＲ产物电泳检测阴性的样品中,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交又检出１８例阳性。     

生物素标记GFV—cDNA探针的制备及在检测葡萄扇叶病毒上的应用

以整合到质粒中的ＧＦＶ－ｃＤＮＡ为模板经ＰＣＲ合成了生物素标记的ＧＦＶ单、双链探针。用合成的探针对提纯的ＧＦＶ－ＲＮＡ２、感染ＧＦＶ的昆诺藜叶及１８株葡萄进行ＤＮＡ－ＲＮＡ杂交检测表明：检测提纯病毒ＲＮＡ２的灵敏度为１．５ｐｇ／斑点,感染ＣＦＶ的昆诺提取液最高稀释度可达４０９６０倍;１１株显示典型扇叶症状的样品均为阳性,且汁液稀４００～８００倍仍能测出,７株不显示典型扇叶症状的葡萄中３株受到ＧＦＶ     

SYBR Green Ⅰ荧光RT-PCR法检测贝类中的诺如病毒

针对诺如病毒II型的保守区域设计引物,建立了SYBR Green I实时荧光RT-PCR检测诺如病毒II型的反应体系。此方法的病毒检测下限达到102拷贝,标准曲线的线形范围为102~106拷贝,相关系数为0.9952,斜率为?2.982,截距为35.84。对诺如病毒II型检测特异,与轮状病毒、腺病毒、甲肝病毒、星状病毒无交叉反应。针对质粒标准品检测的批内试验变异系数(CV)为0.95%~1.69%(n=5),批间试验CV为0.87%~1.24%(n=3)。运用此方法随机检测30份贝类水产品,检测出2份阳性样品。结果表明,SYBR Green I荧光RT-PCR检测诺如病毒II型的方法灵敏、特异、重复性好,可应用于贝类水产品的快速检测。     

SYBR Green I荧光RT-PCR法检测贝类中的诺如病毒

针对诺如病毒II型的保守区域设计引物,建立了SYBR Green I实时荧光RT-PCR检测诺如病毒II型的反应体系。此方法的病毒检测下限达到102拷贝,标准曲线的线形范围为102~106拷贝,相关系数为0.9952,斜率为?2.982,截距为35.84。对诺如病毒II型检测特异,与轮状病毒、腺病毒、甲肝病毒、星状病毒无交叉反应。针对质粒标准品检测的批内试验变异系数 (CV) 为0.95％~1.69％ (n=5),批间试验CV为0.87％~1.24％ (n=3)。运用此方法随机检测30份贝类水产品,检测出2份阳性样品。结果表明,SYBR Green I荧光RT-PCR检测诺如病毒II型的方法灵敏、特异、重复性好,可应用于贝类水产品的快速检测。     

应用聚合酶链式反应扩增和光敏生物素标记的cDNA探针检测马铃薯纺锤块茎类病毒

以含马铃薯纺锤块茎类病毒(potato spindle tuber viroid,PSTV)RNA的总核酸为模板,加入人工合成的互补DNA引物,用反转录酶合成PSTV cDNA;在聚合酶链式反应系统中,用两个PSTV特异性引物进行cDNA扩增,用以制备光敏生物素标记的PSTV cDNA探针。用此探针进行斑点杂交检测含PSTV的马铃薯核酸提取液和汁液均出现阳性杂交信号,而健康马铃薯的核酸提取液和汁液的结果均为阴性。光敏生物素标记探针检测纯化PSTV的灵敏度可达5pg;检测感染PSTV的马铃薯块茎汁液的可测出最高稀释度为1:400。     

生物素标记GFV－cDNA探针的制备及在检测葡萄扇叶病毒上的应用

以整合到质粒中的ＧＦＶ－ｃＤＮＡ为模板经ＰＣＲ合成了生物素标记的ＧＦＶ单、双链探针。用合成的探针对提纯的ｃＦＶ－ＲＮＡ＿２、感染ＣＦＶ的昆诺藜叶及１８株而萄进行ＤＮＡ－ＲＮＡ杂交检测表明：检测提纯病毒ＲＮＡ＿２的灵敏度为１．５ｐｇ／斑点,感染ＧＦＶ的昆诺藜提取液最高稀释度可达４０９６０倍;１１株显示典型扇叶症状的样品杂交结果均为阳性,且汁液稀释４００～８００倍仍能测出,７株不显示典型扇叶症状的葡萄中３株受到ＧＦＶ的侵染。单、双链探针最适使用浓度分别为１／２００及１／１００。     

光敏生物素和DIG标记Orf病毒DNA探针的研究

目的：是用于Orf病毒病的诊断和相应重组菌的检测,将HCE DNAHindⅢ/A,B片断及重组质粒pGRL-4A中消化的A片断用光敏生物素和地高辛进行标记,对不同病毒分离株DNA进行检测,并对不同重组质粒进行了Dot-blotting和Southem-blotting检测。结果：用光敏生物素标记的探针最低可检出12pg的DNA,地高辛标记的探针最低可检出0.1pg的DNA,且有极强的特异性。     

AIV血凝素亚型同步检测基因芯片技术研究

对流感病毒14个血凝素亚型的基因芯片检测技术进行了初步研究。通过RT-PCR克隆禽流感病毒血凝素基因片段,获得重组质粒。从重组质粒扩增大约500bp的DNA片段,浓缩后点到氨基化玻璃载体上,制成芯片。待检病毒样品用TRIzolLS提取RNA,反转录过程中用Cy5标记样品cDNAs。将标记样品与芯片杂交,扫描芯片上待检样品与芯片上捕捉探针的结合位点,杂交信号与预期设想一致。结果显示,DNA芯片技术可以提供一种有效的AIV血凝素亚型鉴别诊断方法。     

湖州市GⅡ.P16-GⅡ.2型诺如病毒胃肠炎疫情的病原分子特征分析

鉴定湖州市2017年11月3起急性胃肠炎疫情的病原,并对病原进行基因特征研究。收集3起疫情中采集的患者粪便标本,采用荧光定量RT-PCR方法对其进行诺如病毒核酸检测,并对核酸阳性标本进行多聚酶和衣壳蛋白部分区域的RT-PCR扩增。选取阳性扩增产物进行序列测定和分子特征分析。同时收集疫情的相关流行病学资料。3起暴发疫情中15份标本经荧光PCR检测为GII型诺如病毒核酸阳性,其中9份标本成功测序。在线分型、系统进化和重组分析判定3起均是GII.P16-GII.2型重组株引起的诺如病毒感染聚集性疫情。系统进化分析显示,本研究中检出的GII.P16-GII.2与2016年底中国各地以及德国、法国检出的GII.P16-GII.2相聚在一起并区别于2016年以前的GII.P16-GII.2形成了一个相对独立的进化分支。提示2016年新出现的GII.P16-GII.2在多聚酶区和衣壳蛋白区都各自经历了一定进化获得了在人群中广泛流行的能力,具体机制有待进一步的研究。这也是首次在本地的诺如病毒胃肠炎疫情中检出GII.P16-GII.2重组株。     

大鼠大麻素Ⅰ型受体绿色荧光融合蛋白真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建大鼠大麻素型Ⅰ受体绿色荧光融合蛋白真核表达载体并观察其在细胞中的表达。方法:大鼠CB1基因序列设计引物,以大鼠脑组织为模板扩增CB1基因编码区片段,克隆至增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N3中,构建重组融合蛋白表达载体pCB1-EGFP。将pCB1-EGFP质粒转染HeLa细胞,通过观察EGFP报告基因的表达以及免疫荧光,Western Blot方法鉴定CB1可在真核细胞中过表达情况。结果:构建重组融合蛋白表达载体pCB1-EGFP,单双酶切和测序验证正确。将pCB1-EGFP质粒转染HeLa细胞,荧光显微镜下观察到融合表达的绿色荧光蛋白,且呈胞膜表达。免疫荧光试验也证明重组载体转染后,CB1基因和GFP共同定位于胞膜部分。Western Blot实验证明表达CB1蛋白。结论:成功构建了高表达的CB1-EGFP融合蛋白真核表达载体。     

东方鲎C因子的分段克隆及表达

东方鲎C因子 (factorCfromTachypleustridentatus)是鲎血细胞中的一种对内毒素敏感的丝氨酸蛋白酶原 ,它与内毒素特异结合的特性 ,使之具有很大的应用价值。根据报道的C因子序列 ,设计了两对引物 ,以中国福建沿海的东方鲎 (Tachypleustridentatus)为材料抽提其血细胞总RNA ,首次用RT PCR的方法分两段扩增了鲎血中编码C因子蛋白的基因全序列。序列分析表明 ,得到的FC基因与文献报道的来自日本的东方鲎的FC有很高的同源性。将分段克隆得到的两段FC片段经相应酶切后 ,与含T7启动子的质粒 pET 2 8a( )在一个体系中作连接反应 ,构建表达质粒pET2 8a FC ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,筛选表达菌株。表达菌株经 1mmol/LIPTG诱导表达 2 .5h后 ,收集菌体并超声破菌。经SDS PAGE分析表明 ,在 110kD左右处有明显的表达条带 ,大小与FC的计算分子量相吻合。但表达产物以包涵体形式存在。经洗涤与变复性后 ,重组FC在体外表现出明显的抑菌活性。同时蛋白质印迹实验也提示了在大肠杆菌中FC的单基因表达物可能发生部分自剪切反应 ,而形成了额外的免疫印迹条带     

C反应蛋白真核表达质粒的构建、表达及其对小鼠血管平滑肌细胞TNF-α表达的影响

目的构建小鼠C-反应蛋白基因重组质粒pIRES-CRP,观测其对血管平滑肌细胞TNF-α表达的影响。方法用RT-PCR法,以小鼠肝组织RNA为模板,扩增获得编码C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)的全长基因。将CRP基因克隆入真核表达质粒pIRES中,构建重组真核表达质粒pIRES-CRP。将重组质粒转染HeLa细胞,通过RT-PCR法检测CRPmRNA的表达,Western blot检测CRP蛋白的表达。将阳性质粒转染小鼠血管平滑肌细胞,通过Western blot检测CRP对TNF-α表达的影响。结果经酶切鉴定、PCR和测序分析结果表明,所克隆的CRP基因与报道结果完全一致,重组体的连接方向正确,阅读框与预期完全一致,真核表达质粒pIRES-CRP构建成功。将重组质粒pIRES-CRP瞬时转染Hela细胞,通过RT-PCR和Western blot证实CRP基因得到表达。将阳性质粒转染小鼠血管平滑肌细胞,TNF-α的表达明显高于空白对照组和空载体组(P<0.01)。结论成功构建小鼠CRP基因重组质粒pIRES-CRP,CRP基因能在人子宫颈癌Hela细胞中正常转录和翻译,表达的蛋白能与CRP的特异抗体反应。CRP能明显上调小鼠血管平滑肌细胞TNF-α的表达,这为解释CRP在冠状动脉的形成过程中起着促炎作用提供了新的实验依据。     

可溶性55kD人肿瘤坏死因子受体(shTNFR55)在变铅青链霉菌中的分泌表达

从 Ｈｅ Ｌａ 细胞中提取总 Ｒ Ｎ Ａ,采用反转录 Ｐ Ｃ Ｒ 技术,从该总 Ｒ Ｎ Ａ 中扩增了约 ５３０ ｂｐ 的ｓｈ Ｔ Ｎ Ｆ Ｒ５５ 基因的 ｃ Ｄ Ｎ Ａ,并克隆至质粒 ｐ Ｕ Ｃ ｍ ｅｌ中酪蛋白酶 ｍ ｅｌ Ｃｌ 分泌信号肽编码序列的下游,构建成含融合基因 ｍ ｅｌ／ Ｔ Ｎ Ｆ Ｒ 的重组质粒 ｐ Ｕ Ｃ ｍ ｅｌ／ Ｔ Ｎ Ｆ Ｒ．把融合基因 ｍ ｅｌ／ Ｔ Ｎ Ｆ Ｒ 插入链霉菌表达质粒 ｐ Ｉ Ｊ４５９ 的多克隆位点,使之位于 ｅｒｍ 强启动子的下游,得到重组表达质粒 ｐ Ｉ Ｊ４５９ ｍ ｅｌ／ｓ Ｔ Ｎ Ｆ Ｒ．经 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交证明重组质粒 ｐ Ｉ Ｊ４５９ ｍ ｅｌ／ｓ Ｔ Ｎ Ｆ Ｒ 插入了 ｓ Ｔ Ｎ Ｆ Ｒ５５ 基因片段．对重组菌株 Ｓｔｒｅｐｔｏｍ ｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ（ｐ Ｉ Ｊ４５９ ｍ ｅｌ／ｓ Ｔ Ｎ Ｆ Ｒ）的发酵液进行 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ、受体配基杂交（ Ｌｉｇａｎｄ ｂｌｏｔ）分析、对 Ｔ Ｎ Ｆ 敏感的 Ｌ９２９ 细胞的细胞毒性中和试验表明,可溶性肿瘤坏死因子受体 ｓ Ｔ Ｎ Ｆ Ｒ５５ 在链霉菌中得到了分泌表达,表达产物具有生物学活性．表达产物的分子量约在 ２６～２８ ｋ Ｄ 之间．     

以杆状病毒为载体表达可溶性55kD人肿瘤坏死因子受体

从培养的HeLa细胞中提取总RNA,通过反转录PCR技术, 从该总RNA中扩增了约530 bp的shTNFR55基因的cDNA,将cDNA克隆至转移载体pAcGp67B的多角 体蛋白基因启动子的下游与转移载体构建成重组转移质粒pAcTNFR。pAcTNFR与杆状病毒AcNP V的DNA共转染昆虫细胞sf9,通过同源重组形成含有shTNFR55基因的重组病毒。经空斑分析 和DNA斑点杂交获得了纯化的重组病毒AcNPVTNFR。采用肿瘤坏死因子(TNF)敏感的L929细 胞检测表达产物的生物学活性。结果表明表达产物可以中和TNF对L929的细胞毒性。蛋白配 基印迹(Ligand blot)分析表明表达产物分子量约在20～25kD之间,有三条带。     

APC11基因真核表达质粒构建及鉴定

目的克隆扩增APC11开放阅读框基因片段,构建其真核表达重组质粒,为后续研究其功能做准备。方法按照GenBank中人APC11序列设计引物,以HeLa细胞cDNA为模板,扩增出基因片段。该片段与真核表达载体pEGFP-C1连接,得到的重组质粒经双酶切和测序鉴定后用Western印迹检验表达。结果扩增片段长度为285bp,重组真核表达质粒经双酶切鉴定后测序鉴定正确。Western印迹证实pEGFP—C1-APC11在真核细胞内表达。结论成功克隆了APC11基因并构建了pEGFP—C1-APC11真核表达重组质粒,Western印迹证实其表达良好,对该基因功能的深入研究打下了坚实基础。     

HGF基因真核表达质粒的构建及其细胞表达

目的:构建真核表达质粒p EGFP-N1-HGF并观察干细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)在人皮肤成纤维中的表达。方法:从扩增人的间充质干细胞中提取全长RNA为模板,设计合成引物,用RT-PCR法扩增出HGF基因片段,然后将HGF基因片段连接于真核表达质粒p EGFP-N1中。双酶切鉴定及测序分析后,用脂质体包裹转染体外培养的人的皮肤成纤维细胞,通过荧光显微镜观察其转染效果,酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测HGF蛋白的表达。结果:经酶切鉴定及测序验证p EGFP-N1-HGF构建正确,经转染的人皮肤纤维细胞中观察到较强的绿色荧光并且可以表达一定量的HGF。结论:成功构建了真核表达质粒p EGFP-N1-HGF,为基因治疗脱发疾病提供实验基础。     

应用载体介导的RNAi技术抑制胰腺癌细胞K-RASAsn12的表达

为了研究载体介导的RNAi（RNAinterference）技术特异地抑制K-RASAsn12。（K-RAS第12位密码子突变形式为GAT）在胰腺癌细胞中的表达,合成两条编码针对K-RASAsn12。突变特异性短发夹RNA（shorthairpinRNA,shRNA）序列的单链DNA,并将其克隆到pSilenCircle栽体中,构建含目的基因片段的重组质粒pSC-K-RASAsn12。同法构建含GFP基因片断的重组质粒pSC-GFP做为对照。用其分别瞬时转染人胰腺癌AsPC-1细胞和BxPC-3细胞后,经半定量RT-PCR和Westernblot检测K-RAS的表达水平。结果表明构建的针对K-RASAsn12的编码突变特异性shRNA的质粒表达载体可特异的抑制胰腺癌细胞的K-RASAsn12。表达,但对野生型的K-RAS（K-RASwT）表达无影响。     

KLF4siRNA慢病毒载体构建和鉴定

目的:构建上皮锌指蛋白4(Krüppel-like factor 4,KLF4)siRNA慢病毒载体并进行初步鉴定,为研究KLF4在宫颈细胞癌中的分子机制奠定基础。方法:利用公用网站中提供的RNA干扰序列设计原则,设计4个RNA干扰靶点序列,合成含干扰序列的单链DNA oligo,然后退火配对产生双链,再通过其两端所含酶切位点直接连入酶切后的RNAi慢病毒载体上;将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞,PCR鉴定阳性重组子后,送测序验证,测序结果经比对确认正确的克隆,制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其两种辅助包装原件载体质粒,共转染293T细胞,收集富含慢病毒颗粒上清液,对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液,在293T细胞中测定并标定病毒滴度。收集上清液感染宫颈癌He La细胞,通过q RT-PCR及Western Blot鉴定KLF4 siRNA慢病毒干扰效果。结果:成功构建KLF4 siRNA慢病毒载体。KLF4 siRNA慢病毒感染He La细胞后,q RT-PCR及Western Blot测定结果显示,KLF4表达明显降低。结论:KLF4 siRNA慢病毒载体构建及包装成功,可有效抑制KLF4表达,为研究KLF4生物学功能奠定基础。