甘油脱水酶gldC基因克隆、表达与鉴定

目的：表达及纯化甘油脱水酶γ亚基蛋白。方法：使用PCR及DNA重组技术,将甘油脱水酶7亚基基因gldC重组到含麦芽糖结合蛋白(MBP)的融合蛋白表达载体pMAL—c2x中,在大肠杆菌中进行表达。结果：转化重组质粒pMAL/gldC的大肠杆菌经IPTG诱导,SDS—PAGE分析显示表达出的MBP—gldC融合蛋白相对分子质量约66kD,与预期大小一致,并经Western blot分析证实。用直链淀粉树脂亲和层析纯化得到电泳均一的融合蛋白。结论：成功地获得甘油脱水酶γ亚基融合蛋白,以便进一步研究其生物学性能。     

MBP-gldABC融合蛋白基因的原核表达载体的构建

目的：构建可高效生产甘油脱水酶的大肠杆菌工程菌,方法：将编码甘油脱水酶的三个基因gldA、gldB、gldC,分别克隆至克隆载体pMD18-T和pSIM-T中,经测序正确后,再亚克隆至表达融合蛋白的高效表达载体pMAL-c2X上,构建成表达质粒pMAL-gldABC,并转化大肠杆菌E.coli DH5α。结果：成功地将甘油脱水酶基因gldABC以同向串联方式克隆到大肠杆菌融合表达载体pMAL-c2X中,结论：得到了含gldABC基因的MBP融合蛋白表达载体,为研究甘油脱水酶基因（gldABC）的在原核表达载体中的串联表达奠定了基础。     

重组依赖辅酶B12的甘油脱水酶基因表达系统构建

采用PCR方法从肺炎克雷伯氏杆菌基因组中分别扩增得到了编码依赖辅酶B12的甘油脱水酶α、β、γ三个亚基的基因gldA、gldB、gld将gldBC基因克隆至pSIM—T载体上,经测序正确后亚克隆至pGEX-4T-1载体中。将gldA进行T-A克隆后测定核苷酸序列正确,亚克隆至连有gldBC基因的pGEX-4T-1载体中。从而成功的构建了gldABC基因的同向串联原核融合表达载体pGEX—gldABC。     

重组人CK2β亚基的原核表达、纯化与鉴定

将构建成功的人蛋白激酶CK2β亚基cDNA的重组质粒, 转化大肠杆菌BL21 (DE3), 在IPTG诱导下表达. 表达蛋白大多数以不溶形式存在. 6L(约10.2 g)表达菌抽提得到约20 mg的可溶性表达产物, 通过P11磷酸纤维素一步层析分离, 得到6.8 mg纯化蛋白. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示纯化的蛋白为一分子质量26 ku的单一蛋白带.蛋白质印迹结果证明：纯化的表达产物与抗人CK2β抗体可发生特异性免疫反应. CK2β亚基对CK2α有激活作用, 纯化的CK2α和β亚基在等摩尔混合时即可组成有最大生物活性的全酶. 实验结果有力地证明了克隆表达与纯化的重组蛋白是人蛋白激酶CK2β亚基.     

甘油脱水酶再激活酶的克隆表达及活性鉴定

运用PCR技术从克雷伯氏菌的基因组中分别扩增得到了编码甘油脱水酶再激活酶α、β两个亚基的基因gdrA、gdrB。将gdrA、gdrB克隆至pMD-18T载体上,构建克隆载体pMD-gdrAB。经测序正确后,将gdrAB亚克隆至表达载体pET-28a( )上构建表达质粒pET-28gdrAB。利用双抗生素筛选法,将pET-28gdrAB与连有甘油脱水酶基因的表达载体pET-32gldABC在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中共表达,鉴定了甘油脱水酶再激活酶的活性。     

甘油脱水酶和二醇脱水酶β亚基生物信息学分析

依赖辅酶B12的甘油脱水酶和二醇脱水酶是同工酶。它们不仅氨基酸序列和蛋白质折叠方式非常相似,而且有着相同的催化机制。该文在同一菌株中将编码甘油脱水酶β亚基基因和编码二醇脱水酶β亚基基因片段分别克隆至T载体,从而获得两段核苷酸片段序列,将pddB序列提交Genbank数据库,获登陆号为DQ483052。同时结合PDB数据库中甘油脱水酶和二醇脱水酶的晶体结构,该文用生物信息学方法对所测序列进行了初步分析,并对两种同工酶的β亚基对脱水酶与辅酶的亲和力进行了比较。     

酮古龙酸菌细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ的融合表达及纯化

目的:利用大肠杆菌融合表达酮古龙酸菌细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ(CcoⅡ)与谷胱甘肽S-转移酶(GST)并纯化。方法:根据酮古龙酸菌Y25基因组序列设计引物,通过PCR扩增CcoⅡ基因,酶切后连接pGEX-KG表达载体,转化至大肠杆菌获得重组菌,经IPTG诱导表达融合蛋白GST-CcoⅡ,用谷胱甘肽-Sepharose 4B树脂亲和纯化融合蛋白,并利用Western印迹及质谱对表达蛋白进行鉴定。结果:扩增得到867 bp的CcoⅡ基因,构建了pGEX-KG-CcoⅡ融合表达载体,重组菌经0.4 mmol/L IPTG于20℃诱导16 h,SDS-PAGE分析显示有可溶性表达条带,相对分子质量约为59×103;Western印迹及质谱分析表明,利用亲和层析方法纯化到了目的蛋白。结论:表达并纯化了GST-CcoⅡ融合蛋白,为酮古龙酸菌电子传递链的研究奠定了基础。     

重组人βNGF在大肠杆菌中的可溶表达、纯化及活性鉴定

旨在大肠杆菌中可溶表达重组人神经生长因子(Recombinant humanβnerve growth factor,rhβNGF),并对表达产物进行分离纯化和生物学活性鉴定。成功扩增h NGFβ亚基基因,将其克隆入pMAL-c2X表达载体,构建了hβNGF-MBP的大肠杆菌表达体系并进行诱导表达,表达产物经纯化后以Factor Xa酶切去除麦牙糖结合蛋白(MBP),Western blot鉴定后以TF-1细胞法检测生物学活性。结果显示,pMAL-c2X-hβNGF经酶切和测序证实构建正确,25℃、180 r/min、0.5 mmol/L IPTG诱导下可溶表达hβNGF-MBP融合蛋白。hβNGF-MBP经Factor Xa酶切后可去除MBP标签,SDS-PAGE分析纯化的hβNGF位于13 k D左右,纯度可达95%。Western blot鉴定为hβNGF,结果表明,比活约为1×10~6 U/mg。在大肠杆菌中成功可溶表达hβNGF,并具有较高的生物学活性。     

PSCA-HSP70融合蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化

旨在大肠杆菌中表达PSCA-HSPT0融合蛋白,并对其进行纯化.克隆人PSCA基因及HSP70基因,构建表达PSCA-HSP融合蛋白的工程菌,优化表达及纯化条件,对重组蛋白进行纯化.结果表明,成功构建重组表达质粒PSCA-HSP,重组蛋白得到可溶性表达,优化纯化条件后获得90%以上纯度的重组蛋白.本研究成功实现了PSCA与HSP的融合表达,为下一步肿瘤疫苗的研制奠定基础.     

重组人神经生长因子β亚基的原核优势表达及纯化

目的:在原核系统内表达SUMO融合重组人神经生长因子β亚基(h NGF-β),并对其纯化。方法:将5'端引入了羟胺切割位点的h NGF-β基因克隆到表达载体p ET-SUMO中,IPTG诱导表达后,对表达的融合蛋白SUMO-h NGF-β包涵体进行亲和纯化,然后在变性条件下加入羟胺进行裂解,利用SUMO分子伴侣的功能与h NGF-β进行共复性,最后利用阳离子交换层析纯化获得重组h NGF-β。结果:融合蛋白SUMO-h NGF-β相对分子质量为39×103,表达量占细菌总蛋白的35%;在变性条件下经羟胺切割、共复性和阳离子纯化后,相对分子质量为14×103的重组h NGF-β复性率和纯度分别为30%和80%以上,Western印迹显示其具有良好的抗原特性。结论:h NGF-β与SUMO融合可以在原核表达系统中实现优势表达。     

乙肝PreS2抗原决定簇和霍乱毒素B亚基基因的融合与表达

通过全化学法按大肠杆菌密码偏性合成了乙肝炎病毒前Ｓ２抗原抗原决定簇基因,与霍乱毒素Ｂ亚基基因的３＇端融合,重组质粒转化大肠杆菌后融合基因得到高效表达,表达量达３０μｇｍＬ,表达产物９５％以上分泌到胞外,表达的融合蛋白能与神经节苷脂ＧＭ１结合,说明融合蛋白保持了霍乱霉素Ｂ亚基的基本高级结构和生物学功能;酶联免疫吸附实验证明融合蛋白具有ＣＴＢ和ＨＢＶＰｒｅＳ２的抗原性;应用亲和层析纯化后得到了电泳纯融     

pET28a-TAT-LacZ重组子的构建

为了构建高表达pET28a-TAT-LacZ重组子,观察表达的融合蛋白TAT-β-Gal能否穿过生物膜,使用人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a组氨酸编码区后再连接lacZ基因,组成pET28a-TAT-LacZ重组表达子,转化大肠杆菌,利用组氨酸亲和层析柱纯化TAT-β-Gal融合蛋白,将融合蛋白加入培养的平滑肌细胞。得到高度纯化的、有活性的TAT-β-Gal融合蛋白, TAT-β-Gal在短时间内进入体外培养平滑肌细胞,成功地构建了高表达pET28a-TAT-LacZ重组子,并在体外培养的细胞中证实TAT-β-Gal融合蛋白穿透生物膜的能力,为肽类、生物大分子药物进入组织细胞内发挥治疗作用提供了理论基础。     

重组人蛋白激酶CK 2α亚基的原核表达、纯化与鉴定

将构建成功的人蛋白激酶 CK2 α亚基 c DNA的重组质粒 ,转化大肠杆菌 BL2 1 ( DE3) ,IPTG诱导后获特异高效表达 ,表达蛋白占菌体总蛋白的 30 % ,但大多数重组蛋白以不溶形式存在 .表达产物依次进行 DE- 5 2、P1 1磷酸纤维素和肝素 - Sepharose柱层析分离 ,最后从 30 9mg可溶性蛋白质中得到 6.1 mg纯化蛋白 . SDS- PAGE显示纯化的蛋白质为一分子量 4 2 k D的单一蛋白带 .Western- blot的结果证明 :纯化的表达产物与抗人 CK2α抗体可发生特异性免疫反应 . CK2α和β亚基等摩尔分子混合可组成有完全活性的全酶 .重组的 CK2全酶的性质和功能与该酶的已知特性一致 .这些结果证明重组蛋白是人蛋白激酶 CK2 α亚基     

弗氏柠檬酸菌甘油脱水酶激活因子基因的克隆、表达与功能鉴定

1,3-丙二醇是一种重要的化工原料,其生物法生产的研究逐渐受到的关注。研究以弗氏柠檬酸菌的总DNA为模板,通过PCR分别扩增出约1.8kb（dhaF）和0.4kb（dhaG）的两个基因片段分别编码甘油脱水酶激活因子大、小亚基, 连接于pMD-18T载体,测序分析显示与GenBank中相关基因的相似性最高为86%。将两基因以多顺反子的方式与pSE380连接构建表达载体,并在大肠杆菌中进行高效表达,表达量占总蛋白的30%。将高效表达的激活因子用金属亲合层析和分子筛进行了纯化,得到电泳纯级的甘油脱水酶激活因子,SDS-PAGE分析显示：大、小亚基分子量约为63kDa和12kDa;非变性胶分析显示：全酶的分子量约为150kDa,经扫描分析推测甘油脱水酶激活因子很有可能是以α2β2方式结合的。以弗氏柠檬酸菌甘油脱水酶为研究对象,进行激活实验,结果证实该激活因子具备甘油脱水酶激活因子的功能,为进一步阐明甘油脱水酶的激活机制及1,3-丙二醇的高效生产奠定了基础。     

GST-HRB融合蛋白的表达与纯化

构建GST-HRB重组质粒,进行融合蛋白的表达、纯化及鉴定.利用PCR扩增及基因重组技术,以pcDNA-3.1-HRB为模板扩增出HRB全基因序列,并将其插入带有GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签的原核表达载体pGEX-6P-1中,构建GST-HRB融合蛋白表达质粒.然后,将重组质粒GST-HRB转化至大肠杆菌Rosseta进行融合蛋白的表达.利用GST琼脂糖珠进行融合蛋白的纯化,最后应用SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定纯化的融合蛋白.结果表明,成功构建pGEX-6P-1-HRB原核表达载体,表达及纯化了GST-HRB融合蛋白.     

重组人LIF融合蛋白表达纯化及其活性鉴定

目的:原核表达重组hLIF融合蛋白并进行诱导表达、纯化及活性鉴定.方法:将hLIF基因克隆至pThioHisA载体,构建融合表达载体pThioHisA-hLIF,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达.表达产物经亲和层析后,Western blot检测目的蛋白的特异性.用小鼠胚胎干细胞脱饲养层培养对纯化后的重组hLIF融合蛋白进行生物活性的鉴定.结果:降低诱导温度和延长诱导时间能增加hLIF融合蛋白的可溶性表达,纯化后的重组蛋白纯度大于95％,Western blot检测显示了良好的特异性.在脱饲养层细胞培养条件下,添加纯化的hLIF融合蛋白能够有效的维持小鼠胚胎干细胞的未分化状态.结论:重组hLIF融合蛋白可在大肠杆菌中高效表达,具有良好的特异性,为干细胞研究及hLIF蛋白的其他功能研究奠定了基础.     

人β肌动蛋白基因原核表达载体的构建及其表达和纯化

目的:构建带GST标签的人β肌动蛋白(β-actin)基因的原核表达产物,纯化出GST-β-actin融合蛋白,为探究β-actin的各项生理功能做准备。方法:以人乳腺文库为模板,利用PCR技术扩增β-actin基因,将其连接到带有GST标签的载体上,经鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌Rossate感受态细胞,小量诱导表达后,利用GST-Sepha-rose 4B亲和珠纯化GST-β-actin融合蛋白,经SDS-PAGE和Western印迹检测。结果:目的基因经PCR技术得以扩增,将其与带GST标签的载体连接后再经双酶切鉴定及测序后确认构建成功;转化大肠杆菌Rossate感受态后获得小量诱导表达,纯化出GST-β-actin融合蛋白,并证实其有生物活性。结论:构建了人β-actin的原核表达载体,并获得了GST-β-actin融合蛋白。     

中国南海石头鱼毒素NeoVTX的分离纯化、基因克隆及表达

目的:分离并鉴定石头鱼粗毒液毒性成分,克隆其序列并进行原核表达。方法:利用SDS-PAGE及凝胶过滤HPLC分离石头鱼粗毒液,质谱鉴定其序列;利用RACE技术钓取毒素基因;将获得的毒素cDNA连入pET-22b(+)载体,转化宿主细胞大肠杆菌,经IPTG诱导表达,用亲和层析纯化目的蛋白。结果:从石头鱼粗毒液中分离到NeoVTX等多种蛋白质,克隆了NeoVTXα和β亚基的cDNA序列,获得了纯度为95%以上的重组α亚基蛋白。结论:中国南海石头鱼粗毒液的主要成分为NeoVTX,其α、β亚基序列与日本冲绳海域石头鱼NeoVTX的α和β亚基具有很高的同源性;大肠杆菌菌株可稳定表达α亚基。该工作为NeoVTX抗体制备奠定了基础。     

大肠杆菌表达的重组猪β2微球蛋白二级结构的圆二色谱分析

摘要：【目的】研究巴马小型猪β2微球蛋白（β2m）的结构和功能。【方法】亚克隆巴马小型猪β2m的成熟肽部分,并构建与pMAL-p2X的重组质粒,转化大肠杆菌TB1并诱导后,融合表达蛋白分别经过 Western-blot、纯化及Factor Xa切割,分离纯化单体蛋白。圆二色谱(circular dichroism spectrum, CD)测定蛋白的二级结构。【结果】重组表达的融合蛋白MBP-β2m大小为52.1 kDa。切割后去除MBP的单体蛋白大小为10.6 kDa。圆二色谱分析单体蛋白β2m二级结构     

小鼠β-防御素30的原核表达和纯化

目的:在原核细胞中表达小鼠β-防御素30(DEFB30),并对表达产物进行鉴定和纯化。方法:用RT-PCR方法扩增小鼠Defb30的cDNA序列,将2个拷贝的cDNA序列串联连入原核表达载体pET28(a),构建重组表达载体pET28(a)-Defb30,并将重组表达载体转化至大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达,以Western印迹分析表达产物His-DEFB30,用Ni-NTA亲和柱纯化融合蛋白。结果:构建了Defb30基因的原核表达载体,经IPTG诱导,相对分子质量约15×103的融合蛋白获得表达,Western印迹分析证实此蛋白即为目的蛋白,经Ni-NTA柱亲和纯化,获得了高纯度的融合蛋白His-DEFB30。结论:获得了在大肠杆菌中表达的DEFB30,为研究该蛋白的免疫避孕效果、抗菌活性奠定了基础。