幽门螺杆菌空泡毒素研究进展

空泡毒素是让螺杆菌产生的一种分泌性蛋白,在体外可引起真核细胞引起真核细胞形成空泡,在体内可损害胃上皮细胞进而导致办上皮发生溃疡化病变。近几年,尤其是１９９４年以来,对空泡毒结构、毒性及其基因的研究进展很快。本文即对空泡毒素的结构和毒性的研究进展作一综述。     

幽门螺杆菌空泡毒素研究进展

幽门螺杆菌空泡毒素是该菌产生的已知其它细菌毒素无明显源性的唯一蛋白毒素。该毒素是幽门螺杆菌重要的毒力致病因子,它的产生与感染胃肠上皮损伤和溃疡形成密切相关。本就幽门螺杆菌空泡毒素的结构与功能研究进展以及在未来免疫预防与免疫治疗中的作用进行了阐述。     

幽门螺杆菌空泡毒素及编码基因的研究

幽门螺杆菌是胃部疾病的主要病原菌。近几年,它已成为研究热点之一,发展很快。本文就幽门螺杆菌空泡毒素及其编码基因的结构特性与胃部疾病的关系作了较为全面的介绍。     

幽门螺杆菌重要致病物质——空泡毒素的研究进展

细胞空泡毒素作为幽门螺杆菌的重要毒力因子已得到确认,但其致病机制尚不明确。目前细胞空泡毒素致机制已成为研究热点,主要集中于毒素的分子结构、基因特点,分泌释放机制以及同敏感主细胞之间的相互作用,本文针对上述几方面的研究进展做一简要、综合介绍。     

和厚朴酚对幽门螺杆菌生长和空泡毒素A表达及活性的影响

【目的】幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)是胃炎和消化性溃疡的病原体, 但其具有潜在的正常菌群的特性。本研究通过评价临床常用中药厚朴的活性成分和厚朴酚对H. pylori的抑制作用及对其空泡毒素A表达和活性的影响, 以反映其对H. pylori具有的潜在去除毒性的作用。【方法】使用平皿稀释固体法和脑心浸液液体法测定和厚朴酚对H. pylori的最低抑菌浓度, 进一步通过中性红摄入法评价经无抑菌效果的低浓度和厚朴酚干预后, H. pylori培养上清中空泡毒素A (Vacuolating cytotoxin A, VacA)的毒性作用; 并通过RT-PCR和Western blot方法检测经低浓度和厚朴酚处理后, H. pylori菌体及分泌上清中VacA mRNA和蛋白的表达水平。【结果】发现高浓度(0.75 g/L)和厚朴酚对H. pylori 具有抑制作用; 而在远低于最低抑菌浓度时, 和厚朴酚可有效抑制H. pylori VacA的形成和分泌。【结论】和厚朴酚具有下调H. pylori毒性的潜在作用, 这为基于“致病性H. pylori的非致病性转变”这一机理的干预性治疗提供了有希望的研究前景。     

幽门螺杆菌VacA真核表达载体的构建及其诱导细胞空泡化和凋亡

目的：研究幽门螺杆菌空泡毒素作为单一毒力决定簇对真核细胞的作用。方法：用PCR扩增VacA基因片段,克隆入真核表达载体pEGFP—N1,构建重组质粒pEGFP—VacA,转染HeLa细胞,通过相差显微镜和电子显微镜观察细胞形态与结构的变化。结果：重组质粒转染HeLa细胞24h,10％一20％细胞的胞质内出现明显空泡,其中少数细胞发生凋亡改变。结论：成功构建了用于真核表达的重组VacA质粒,转染真核细胞后,观察VacA作用导致的细胞形态结构的变化,为研究VacA作为单一毒力决定簇对真核细胞的作用奠定了基础。     

VacA在幽门螺杆菌BCF中的表达及其与空泡毒作用的关系

目的 :研究幽门螺杆菌 (H elicobacter pylori,H .pylori)临床分离株的空泡毒作用及其与空泡毒素抗原 (Vacuolated cytotoxin antigen,Vac A)的关系。方法 :用细胞毒试验、SDS- PAGE结合薄层扫描研究H.pylori临床分离株空泡毒作用及其与 Vac A的关系。结果 :6 2株 H.pylori临床分离株 ,43株为空泡毒作用阳性 H .pylori(Toxin+) ,其余为空泡毒作用阴性的 H .pylori(Toxin- )。 30 .2 3% (13/ 43) H .pylori(Toxin+)临床分离株的肉汤培养滤液 (broth culture filter,BCF)含有分子量为 87k Da的 Vac A,而所有H .pylori(Toxin- )的 BCF不含有这种蛋白 ,二者之间差异有显著性 (P<0 .0 5 ) ;Vac A含量与 H .pylori(Toxin+) BCF的空泡毒作用滴度明显相关 (r=0 .6 7,P<0 .0 5 )。结论 :H.pylori(Toxin+)空泡毒作用是由 Vac A引起的。     

幽门螺杆菌细胞空泡毒素与胃上皮细胞的表皮生长因子信号转导

细胞空泡毒素是幽门螺杆菌的一种重要的外分泌毒素,但其确定的致病机制尚不清楚。近年来研究发现,细胞空泡毒素不仅直接导致细胞的空泡毒性,还可能通过干扰胃黏膜上皮细胞内及细胞间的信息传递,尤其是与表皮生长因子有关的信号转导过程,影响上皮细胞的生长、增殖及组织的修复,是幽门螺杆菌致病机制的重要环节之一。     

幽门螺杆菌毒素及相关疾病的研究进展

幽门螺杆菌是引起胃炎,消化性溃疡等多种胃肠疾病的重要病原体。目前认为该菌的主要致病因子是细胞空泡毒素和细胞毒相关蛋白。本文综述这两种毒素的基因特征,基因分型方法,致病机制和临床相关疾病的国内外最新研究成果。     

幽门螺杆菌重组vacA-ctxB蛋白的基因克隆与表达

目的构建幽门螺杆菌(H.pylori)vacA毒性片段与霍乱毒素B亚单位(ctxB)基因的原核表达载体,并诱导表达VCTB重组蛋白,为制备防治H.pylori感染的口服疫苗奠定基础。方法以H.pylori基因组DNA为模板,PCR扩增vacA毒性片段基因,克隆至质粒pQE30中,获得重组质粒pQE30-vacA。再以pET32(a) -ctxB质粒为模板PCR扩增ctxB目的基因并插入pQE30-vacA中,构建含双基因的表达质粒pQE-vctB。克隆至大肠埃希菌Top10,并在DH5α中诱导表达。SDS-PAGE分析表达结果,Ni-NTA柱纯化后Western blot鉴定其抗原性,免疫家兔后ELISA法检测血清中VacA和CtxB抗体鉴定其免疫原性。结果vacA的DNA片段为723 bp左右。ctxB基因的DNA片段为372 bp左右,与预计长度相符合。测序结果vctB融合基因由1092 bp组成,编码364个氨基酸残基的多肽,与基因文库相符。表达蛋白VCTB经SDS-PAGE分析,相对分子量为40 000,与预期的一致;表达量约占菌体总蛋白的20%,提纯后SDS-PAGE分析可见单一条带,纯度可达92%以上。Western blot鉴定能与抗VacA人血清发生特异性反应,ELISA测定能与抗ctxB兔血清发生特异性反应。结论含vctA和ctxB融合基因的表达载体构建成功,并在大肠埃希菌DH5α中表达了重组蛋白质VCTB,表达蛋白具有良好的抗原性和免疫原性,可用于制备口服疫苗。     

Optimized conditions for the fermentation of Helicobacter pylori and production of vacuolating cytotoxin

Abstract We report here improvements to the growth media and fermentation conditions which result in a substantial increase of Helicobacter pylori growth and in the enhanced production of vacuolating cytotoxin. Addition of glucose to the medium resulted in the increase of cell yield, cell viability and a significant improvement in the production of vacuolating cytotoxin.     

Brefeldin A enhances Helicobacter pylori vacuolating cytotoxin-induced vacuolation of epithelial cells

Intracellular VacA localises to the vacuolar (late endosome/lysosome) membrane, but little is known about the trafficking of the toxin beyond this region. We show that the Golgi-disturbing agent brefeldin A (BFA) enhances VacA-induced vacuolation of epithelial cells by Helicobacter pylori co-culture and, importantly, BFA treatment induces vacuolation by less toxic forms of VacA. The effect is BFA dose-dependent and occurs within 2.5 h. These data suggest that VacA may be routed deeper within the cell than the vacuole, and that vacuolation is minimised when this occurs efficiently. This may explain why some forms of VacA do not cause vacuolation and why vacuolation is minimal at the low bacteria:cell ratios observed in vivo.     

幽门螺杆菌flaA基因表达载体的构建和产物免疫性的鉴定

采用高保真PCR从幽门螺杆菌Y0 6株DNA中扩增全长flaA基因片段 ,T A克隆后测定核苷酸序列 ,构建 pET32a的flaA表达载体 ,在E .coliBL2 1DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达 ,采用Hp全菌抗体的westernblot和兔抗融合蛋白血清的免疫扩散试验鉴定其免疫性。所克隆的flaA基因核苷酸和氨基酸序列与文献报道的同源性分别为 96 .2 8%～ 97.13%和 99.4 1%～ 10 0 %。pET32a flaA BL2 1DE3系统表达的FlaA融合蛋白量高达细菌总蛋白的 4 0 %～ 5 0 %。FlaA融合蛋白能与Hp全菌抗体及家兔免疫血清发生结合反应。     

幽门螺杆菌热休克蛋白70基因的克隆与表达

从幽门螺杆菌染色体ＤＮＡ,用ＰＣＲ方法扩增得到了热休克蛋白７０基因。序列分析表明,我国Ｈｐ临床分离株Ｙ２的热休克蛋白７０基因与经全基因组序列测定的两株幽门螺杆菌２６６９５和ｊ９９有高度同源性。将该基因克性到融合分泌表达载体ｐＭＡＬ－ｐ２中,转化大肠杆菌,在ＩＰＴＧ诱导下表达出与预期大小相符的１１３ｋＤ的融合表达蛋白。该蛋白质３０℃诱导表达５ｈ后,可达到细菌周质总蛋白质的１９．４％。用免疫印迹分析表     

幽门螺杆菌热休克蛋白A基因的克隆、表达及免疫原性研究

幽门螺杆菌的感染可诱发人体产生胃炎和消化性溃疡,其组成成分热休克蛋白Ａ（ＨｓｐＡ）可刺激机体产生保护性的免疫反应。用ＰＣＲ方法从幽门螺杆菌的染色体ＤＮＡ上扩增出ＨｓｐＡ基因片段,将其插入原核表达载体ｐＥＴ２２ｂ（＋）中,并在ＢＬ２１（ＤＥ３）大肠杆菌表达。经测序ＨｓｐＡ基因片段有３５４ｂｐ组成,可编码１１８个氨基酸残基的多肽。ＳＤＳＰＡＧＥ和免疫印迹分析检测发现,ＨｓｐＡ基因表达的蛋白质分子量约为１５ｋＤ,并证实该重组蛋白质可以被幽门螺杆菌感染阳性患者的血清所识别,同时将其免疫小鼠可刺激机体产生抗该重组蛋白质的抗体。ＨｓｐＡ有可能作为一种有效的蛋白质疫苗用于幽门螺杆菌感染的预防和治疗。     

利用杆状病毒表达幽门螺杆菌cagA基因

幽门螺杆菌cagA基因克隆到杆状病毒表达系统的pBlueBacHis2A转移载体中,将重组质粒pBlueBacHis2A-CagA与亲本病毒Bac-N-blue DNA共转染Sf9细胞,以空斑法纯化获得的重组杆状病毒.经PCR法鉴定后进行扩增培养,SDS-PAGE和Western bolt检测结果证实所表达的蛋白为CagA蛋白,间接ELISA分析表明,表达产物可与Hp感染者血清发生特异性的免疫反应.     

Infection with cagA- and vacA-positive and -negative strains of Helicobacter pylori in a mouse model

To study the role of cytotoxin-associated protein (cagA) and vacuolating cytotoxin (vacA) in Helicobacter pylori infection in an experimental murine model, mice were infected with seven strains with different cagA and vacA status. Groups of 10 NMRI mice were challenged and were killed 5 weeks later. In a second study, 20 mice were challenged with a mixture of the same seven strains and killed 1, 3, 15 and 17 weeks post-inoculation. All seven strains were found to colonize the mice for the 5-week experimental period. Animals infected with vacA-positive strains, regardless of cagA status, showed an elevation of antibody titers. Two cagA-negative and vacA-positive strains and one cagA- and vacA-positive strain were found to 'take over' in the mixed infection as analyzed by the randomly amplified polymorphic DNA-polymerase chain reaction technique and in one mouse stomach we found coexistence of two of the strains. We found no evidence of the different strains colonizing different parts of the stomach.