水牛瘤胃宏基因组的一个新的b-葡萄糖苷酶基因umcel3G的克隆、表达及其表达产物的酶学特性

以木质纤维素为原料、应用同步糖化共发酵工艺发酵生产酒精时需要酸性中低温高活力纤维素酶包括b-葡萄糖苷酶。本工作分6次构建了水牛瘤胃未培养微生物宏基因组文库, 获得1.26×105个克隆, 文库含外源DNA的总长度 约为4.8×106 kb。从文库中筛选到118个表达b-葡萄糖苷酶活性的独立克隆。发现其中8个克隆表达的b-葡萄糖苷酶在pH5.0、37oC条件下活性较强。对其中一个克隆进行了亚克隆, 序列分析发现一个2223 bp的潜在的编码b-葡萄糖苷酶基因(umcel3G)的开放阅读框(ORF), 其编码产物的氨基酸序列与来自于 Bacillus sp.的一个b-葡萄糖苷酶同源性最高, 具有60%的一致性和73%的相似性。该ORF在E.coli中的表达产物Umcel3G的分子量与预测大小相似, 酶谱分析表明该表达产物具有b-葡萄糖苷酶活性, 证实该基因为一个b-葡萄糖苷酶基因。测定了用Ni-NTA纯化的Umcel3G的酶学特性, 其最适pH和最适温度分别为6.0~6.5和45oC。一些金属离子如Ca2+、Zn2+能显著提高该酶的酶活, 而另外一些金属离子如Fe3+、Cu2+能抑制Umcel3G的活性。在pH4.5、35oC和5 mmol/L的 Ca2+存在的条件下, 用Ni-NTA纯化的重组酶的比活为22.8 IU/mg, 说明该酶在用SSCF工艺发酵生产酒精中有潜在的应用价值。     

水牛瘤胃宏基因组的一个新的b-葡萄糖苷酶基因umcel3G的克隆、表达及其表达产物的酶学特性

以木质纤维素为原料、应用同步糖化共发酵工艺发酵生产酒精时需要酸性中低温高活力纤维素酶包括b-葡萄糖苷酶。本工作分6次构建了水牛瘤胃未培养微生物宏基因组文库, 获得1.26×105个克隆, 文库含外源DNA的总长度 约为4.8×106 kb。从文库中筛选到118个表达b-葡萄糖苷酶活性的独立克隆。发现其中8个克隆表达的b-葡萄糖苷酶在pH5.0、37oC条件下活性较强。对其中一个克隆进行了亚克隆, 序列分析发现一个2223 bp的潜在的编码b-葡萄糖苷酶基因(umcel3G)的开放阅读框(ORF), 其编码产物的氨基酸序列与来自于 Bacillus sp.的一个b-葡萄糖苷酶同源性最高, 具有60%的一致性和73%的相似性。该ORF在E.coli中的表达产物Umcel3G的分子量与预测大小相似, 酶谱分析表明该表达产物具有b-葡萄糖苷酶活性, 证实该基因为一个b-葡萄糖苷酶基因。测定了用Ni-NTA纯化的Umcel3G的酶学特性, 其最适pH和最适温度分别为6.0~6.5和45oC。一些金属离子如Ca2+、Zn2+能显著提高该酶的酶活, 而另外一些金属离子如Fe3+、Cu2+能抑制Umcel3G的活性。在pH4.5、35oC和5 mmol/L的 Ca2+存在的条件下, 用Ni-NTA纯化的重组酶的比活为22.8 IU/mg, 说明该酶在用SSCF工艺发酵生产酒精中有潜在的应用价值。     

烟曲霉β-葡萄糖苷酶的基因克隆、表达及酶学性质分析

探索获得优良的β-葡萄糖苷酶基因,对实现其工业化生产具有重要意义。烟曲霉Aspergillus fumigatus基因组中含有一个bgl基因(1 752 bp),编码的蛋白约65 kDa,推测为属于糖苷水解酶家族的β-葡萄糖苷酶。将bgl基因克隆并构建了重组表达载体pGEX-bgl,转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3),经IPTG诱导获得表达。重组蛋白经亲和层析纯化后,以七叶苷为底物进行了酶学分析,结果表明该酶的最适温度是45℃,最适pH在5.5~6.0之间,对七叶苷的Km值为17.7 mmol/L。该酶在pH 4~7范围内稳定;70℃保温2 h后仍能保持60%的活性。金属离子和化学试剂对酶活性有不同程度的影响,Ca2+对重组酶有轻微的激活作用,而SDS可强烈抑制其活性。由于其相对于真菌来源的其他葡萄糖苷酶稳定性较高,为进一步的研究与应用奠定了基础。     

新型海洋微生物β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及重组酶性质

通过功能筛选方法,从中国南海海洋表层海水微生物元基因组文库筛选得到了6个β-葡萄糖苷酶阳性克隆。对其中的一个阳性克隆pSB47B2进一步亚克隆和序列分析,获得一新型β-葡萄糖苷酶基因(命名为bgl1B)开放阅读框。以pET22b(+)为载体、Escherichia coli BL21(DE3)为宿主菌,bgl1B被高效活性重组表达。通过Ni-NTA亲和层析柱纯化了重组Bgl1B(rBgl1B)。纯化的rBgl1B催化pNPG水解反应的最适pH为6.5,最适温度为40oC。在最适反应条件下,rBgl1B水解pNPG的活性达到39.7U/mg,Km和Vmax分别为0.288mmol/L、36.9μmol/min。纤维二糖是rBgl1B的有效作用底物,其Km和Vmax分别为0.173mmol/L、35μmol/min。但rBgl1B不能催化转化蔗糖、乳糖、麦芽糖以及CMC。rBgl1B催化pNPG的水解反应对高浓度的Na+有较好的耐受性,而低浓度的Ca2+、Mn2+对该酶活有一定促进作用。不同于许多来源于真菌的酸性β-葡萄糖苷酶,rBgl1B在pH7.0～9.0范围内具有比较高的酶活力并具有较好的稳定性。     

嗜热脱氮土壤芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶的克隆与重组表达及其酶学性质研究

【目的】克隆嗜热脱氮土壤芽孢杆菌中的β-葡萄糖苷酶基因bglB,在E.coli中异源表达,纯化并研究其酶学性质。【方法】利用PCR技术从嗜热脱氮土壤芽孢杆菌的基因组DNA中克隆得到bglB基因,将该基因克隆到表达载体pGEX-2TL上并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,对纯化后的β-葡萄糖苷酶的酶学性质及寡聚状态进行分析。【结果】重组表达的β-葡萄糖苷酶最适温度为65°C,最适pH为7.0,能在pH 5-10、60°C下稳定存在4 h,并能在较高的离子强度(880 mmol/L K+)下发挥其功能。Al3+离子对其有强烈的激活作用,Co2+有一定的抑制作用。最适反应条件下该酶比活力为0.043 IU/mg。该酶具有多种寡聚体形式,这些寡聚体均有β-葡萄糖苷酶活性。【结论】获得一个耐热耐盐的中性β-葡萄糖苷酶,为进一步研究β-葡萄糖苷酶的催化作用机理,提高其热稳定性提供一定的帮助。     

耐热型α-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的克隆及表达

应用PCR法从火山口嗜热菌中克隆出了α-葡萄糖苷酶基因,并将该基因导入大肠杆菌,获得了稳定表达的大肠杆菌菌株。同时对其表达产物进行了酶学性质分析。结果表明：该基因长1587bp,编码501个氨基酸,为新舡葡萄糖苷酶同源基因,已将该序列在Genbank中登记;其表达产物经SDS-PAGE分析表明,相对分子质量约为66kD;该α-葡萄糖苷酶的最适温度为90℃,最适pH值为7．0,在80℃放置3h,酶活仍能达到94％以上。结果表明该酶具有优良的耐热性,将有广泛的工业应用前景。     

多粘芽孢杆菌 (Bacillus polymyxa)β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达、纯化及酶学性质分析

从多粘芽孢杆菌 (Bacilluspolymyxa 1794 )中克隆得到 β-葡萄糖苷酶基因bglA。将其构建在大肠杆菌 (Es-cherichiacoli)表达载体pET28a(+)上 ,转化E .coliBL21,获得重组工程菌BL1979。重组表达的 β-葡萄糖苷酶的酶活力达到 247IU mL ,经镍柱纯化后的β-葡萄糖苷酶最适温度为 37℃ ,最适pH值为70 ,该酶经纯化后纯度可达92.7%。用非变性梯度聚丙烯凝胶电泳发现该酶具有多种寡聚体形式 ,经荧光底物活性染色表明这些寡聚体均具有β-葡萄糖苷酶活性.     

深海沉积物微生物元基因组文库来源的新的酯酶基因的克隆、表达及酶学性质

【目的】从深海沉积物微生物元基因组文库中克隆新的酯酶基因,并进行酶学性质研究。【方法】利用含有三丁酸甘油酯的酯酶选择性筛选培养基,从深海沉积物微生物元基因组文库中筛选得到酯酶阳性Fosmid克隆。对筛选得到的fosmid FL10进行部分酶切构建亚克隆文库,筛选得到酯酶阳性亚克隆pFLS10。PCR扩增目的片段后与pET28a连接构建酯酶基因原核表达质粒,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21。纯化表达产物并对其进行活性测定及酶学性质研究。【结果】序列分析显示该pFLS10亚克隆质粒含有一段924bp的ORF(Open Reading Frame),与一海洋元基因组文库中筛选出的酯酶ADA70030序列一致性为71%。该酶为一新的低温酯酶,对C4底物(对硝基苯丁酸酯)水解能力最强。该酶最适作用温度为20℃,最适作用pH为7.5,20℃时较为稳定,pH8-10的范围内有良好的pH稳定性,K+、Mg2+对该酶具有一定的激活作用,Mn2+等对其具有不同程度的抑制作用。【结论】应用元基因组技术筛选到了新的酯酶基因fls10并进行了克隆表达,该酶在低温及碱性条件下较为稳定且活力较高,对于工业化生产具有一定的应用潜力。关键词:深海沉积物;元基因组文库;低温酯酶;酶学特征     

红树林土壤微生物宏基因组文库的构建及两种新颖的β-葡萄糖苷酶基因的鉴定

宏基因组技术是挖掘微生物新酶的重要途径。通过构建红树林土壤微生物Fosmid文库,共获得了约100 000个阳性克隆,该文库外源插入片段平均长度约为30 kb,文库容量达3 Gb。通过对文库中10 000个克隆进行功能筛选,获得了17个具有β-葡萄糖苷酶活性的克隆。对其中2个表达β-葡萄糖苷酶的克隆进行亚克隆,获得2个新颖的β-葡萄糖苷酶的基因,分别命名MhGH3和bgl66。生物信息学分析表明,MhGH3基因由1 992个碱基对组成,bgl66基因由2 025个碱基对组成。在氨基酸水平上,MhGH3和bgl66编码的蛋白质与GenBank数据库中已知β-葡萄糖苷酶的一致性分别为64%和55%。     

嗜热毛壳菌一种β-葡萄糖苷酶的分离纯化及特性

研究了嗜热毛壳菌Chaetomiumthermophilum液体发酵产生的一种胞外β-葡萄糖苷酶的分离纯化及特性。粗酶液经硫酸铵沉淀、DEAE-SepharoseFastFlow阴离子层析、Phenyl-Sepharose疏水层析、SephacrylS-100分子筛层析等步骤后获得凝胶电泳均一的β-葡萄糖苷酶。经10%SDS-PAGE和凝胶过滤层析方法分别测得该酶的分子量大小约为118.0kDa和120.1kDa。该酶反应的最适温度为70℃,最适pH值为4.0~5.0。有高的热稳定性,在60℃保温1小时酶活性不丧失,在70℃时的半衰期为16min,在90℃保温10min仍具有7.6%的活性。且能在pH4.0~11.0之间保持稳定。金属离子对β-葡萄糖苷酶的活性影响较大,其中Ca2 、Ba2 对酶有激活作用,而Zn2 、Cu2 、Al3 、Ag 、Hg2 对酶有显著的抑制作用。     

产β-葡萄糖苷酶的菌种的筛选,鉴定及其酶学特性

β-葡萄糖苷酶来源广泛,几乎存在于所有的生物体中,而不同来源的β-葡萄糖苷酶其性质也各不同.本文利用七叶苷分离培养基从土样中分离筛选出产6种β-葡萄糖苷酶时间较快的菌种,其中发现菌种WGEA1酶活性较高,随后对菌种WGEA1进行初步的鉴定并且采用DNS法测该菌株所产粗酶液的酶学特性.酶学特性表明,WGEA1产的β-葡萄糖苷酶最适温度是在50~55℃之间,最适pH在6~7之间;在低于50℃条件下,pH为5~8时,酶活较稳定,同时在最适反应时间30 min下,金属离子和有机溶剂都对酶活性影响很大,这些发现都为在非水相体系中酶法合成烷基糖苷奠定了一定的基础.     

一株嗜热毛壳菌β-葡萄糖苷酶的分离纯化及特性

研究了液体发酵嗜热毛壳菌Chaetomium thermophile产生的β-葡萄糖苷酶的分离纯化及特性。粗酶液经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析、Phenyl-Sepharose 疏水层析、Sephacryl S-100分子筛层析等步骤后获得凝胶电泳均一的β-葡萄糖苷酶。经12.5%SDS-PAGE和凝胶过滤层析方法分别测得该酶的分子量大小约为78.4kDa和81kDa。该酶反应的最适温度和pH值分别为60℃和4.5-5.0。有较好的酸稳定性和热稳定性。金属离子对β-葡萄糖苷酶的活性影响较大, 其中Ca2+对酶有激活作用, 而Ag+、Cu2+ 、Hg2+对酶有显著的抑制作用。该酶对水杨苷具有很强的底物特异性。     

黑曲霉（Aspergillus niger）F044脂肪酶新型基因lipB的克隆、表达及酶学性质分析

摘要：【目的】本研究拟克隆新型的黑曲霉（Aspergillus niger）脂肪酶（EC 3.1.1.3）基因,实现其在大肠杆菌（Escherichia coli）的高效表达,并对表达产物进行系统的酶学性质分析,为该脂肪酶的工业化生产及应用奠定基础。【方法】通过PCR和RT-PCR克隆脂肪酶基因,并将其开放式阅读框（ORF）克隆入融合表达载体pET28a;表达产物经Ni-agarose纯化后对LipB进行酶学性质分析,并通过圆二色谱进行结构分析。【结果】成功地从A. niger F044中克隆了一个新型的脂肪酶基因lipB,获得了该基因的全基因组序列和cDNA序列（GenBank: FJ536287、FJ536288）,并实现了其在E. coli中的高效表达。LipB分子量约为43.0 kDa,最适底物为pNPC（C8）,酶学动力学常数Km=5.98 mmol/L,最适反应温度为50℃,最适pH为6.0;该酶能在40℃条件下保持稳定,在60℃条件下处理1 h后残余酶活仅为18.8%;该酶对Ca2+敏感,当脂肪酶经2 mmol/L Ca2+处理1 h后,酶活提高了2.6倍。圆二色谱分析表明该酶在Ca2+处理前后具有明显的结构变化。【结论】新型A. niger脂肪酶lipB基因的克隆不仅积累了脂肪酶基因资源,而且为高效基因工程菌的构建及规模化应用奠定基础;对LipB的酶学性质分析表明该酶在食品和油酯化工等领域具有广阔的应用前景。     

土壤微生物中新型β-葡萄糖苷酶的挖掘与鉴定

【背景】通过培养微生物来获得新β-葡萄糖苷酶因只有少部分微生物可以被培养而受到限制,但宏基因组学技术可以挖掘非培养微生物来源的β-葡萄糖苷酶资源。【目的】利用宏基因组学技术挖掘土壤微生物来源的新型β-葡萄糖苷酶,并对其酶学性质进行初步分析。【方法】构建土壤微生物的宏基因组文库,利用七叶苷平板显色法对所构建的文库进行筛选获得阳性克隆,并对阳性克隆所含的β-葡萄糖苷酶基因进行异源表达和生物化学特性分析。【结果】通过筛选文库中的62万个克隆,获得一个具有β-葡萄糖苷酶活性的克隆,其插入片段中包含一个2 301 bp的ORF(YNBG3),蛋白同源性分析显示其属于β-葡萄糖苷酶第三家族。对YNBG3酶的生化分析确定其最佳反应温度为53°C,最适p H为5.2,有较好的热稳定性,对一定浓度范围内的DMSO、丙酮、乙醇等有机试剂有较好的耐受性,EDTA和尿素可增加该酶的活性。【结论】利用宏基因组学技术获得了一个有较好热稳定性及耐受一定浓度有机试剂和尿素的新β-葡萄糖苷酶。     

高糖土壤微生物宏基因组文库的构建及β-葡萄糖苷酶基因鉴定

采用宏基因组技术构建了高糖土壤微生物的DNA文库,该文库约含9万个克隆,文库外源DNA总容量为3.1×10~9bp。利用活性筛选策略,对文库进行筛选,获得11个β-葡萄糖苷酶的阳性克隆,并对其中2个表达β-葡萄糖苷酶的克隆进行亚克隆和序列分析,获得两个编码新型β-葡萄糖苷酶的基因分别命名为:unbgl3A和unbgl3B。生物信息学分析表明:unbgl3A基因由2241个碱基对组成,unbgl3B基因由2292个碱基对组成。在核苷酸水平上,unbgl3A、unbgl3B与已知数据库中的β-葡萄糖苷酶基因没有任何相似性。在氨基酸水平上,与GenBank数据库中已知β-葡萄糖苷酶的相似性分别为73%和69%。     

一种耐热偏酸性β-甘露聚糖酶基因克隆与高效表达

【目的】克隆半纤维素降解高效菌株Bacillus subtilis BE-91的甘露聚糖酶基因并进行原核表达,对表达产物进行酶学性质研究。【方法】采用PCR扩增法从B. subtilis BE-91菌株中克隆β-甘露聚糖酶基因,分别连接到pEASY-E1和pET28a载体,导入Escherichia coli BL21(DE3)进行诱导表达。用DNS法对工程菌株的胞内和胞外β-甘露聚糖酶进行定量分析,选取胞外甘露聚糖酶活力高的组分进行酶学性质研究。【结果】从B. subtilis BE-91菌株中克隆的β-甘露聚糖酶基因(GenBank登录号：KP277209)在E. coli中获得高效表达,工程菌株pEASY-man/BL产胞外β-甘露聚糖酶的活性可达229.1 IU/mL;该基因序列全长960 bp,包含319个氨基酸的编码序列和一个终止密码子;表达产物的最适反应温度为65 °C,最适反应pH为6.0,属于耐热偏酸性β-甘露聚糖酶;该酶稳定温度≤65 °C,稳定pH为4.5?7.0;1 mmol/L的Cu2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+对该酶有激活作用,而Ba2+和Pb2+有强烈抑制作用。【结论】B. subtilis BE-91拥有珍贵的β-甘露聚糖酶基因资源,其胞外表达产物的耐热偏酸性酶学性质在开发饲料添加剂方面具有潜在的应用前景。     

绿色木霉耐热β-葡萄糖苷酶分离纯化及酶学性质研究

旨在对绿色木霉-葡萄糖苷酶进行分离纯化并研究其酶学性质。对绿色木霉GIM3.139进行摇瓶发酵,经离心超滤和Sephadex G-200凝胶层析,得到纯化后的β-葡萄糖苷酶,并研究其酶学性质。结果显示,分离纯化组分经PAGE电泳检测达到电泳纯,研究发现,该酶最适反应温度为80℃,热稳定性好,在70-95℃时能长时间保持较高活力,最适p H值为6.5,耐酸碱稳定性好。金属离子中,Fe3+、Mg2+、K+对β-葡萄糖苷酶的活性起抑制作用,其中Fe3+对该酶的抑制作用最为明显,Fe2+、Mn2+对β-葡萄糖苷酶的活性起激活作用,其中Mn2+对β-葡萄糖苷酶的激活作用最为明显。有机溶剂中,甲醇、丙酮对该酶起到激活作用,其中甲醇的激活作用最明显,而乙酸乙酯对该酶具有明显的抑制作用。分离纯化得到了电泳纯的β-葡萄糖苷酶,并掌握了其基本的酶学性质。     

β-葡萄糖苷酶在酿酒酵母表面的表达

应用表面表达技术对来自Trichodermareesei的β-葡萄糖苷酶在酿酒酵母表面的表达及后期性质进行了研究。实验结果表明酵母表面表达酶有活性,该酶的最佳诱导时间为24h,最适温度是70℃,而酶活的最适pH是5．5。使异源表面表达了Bgl1的酵母在以纤维二糖为唯一碳源的培养基中生长,发酵结果表明纤维二糖被明显利用了,但在培养186h后,发酵液中仍残留一定量的纤维二糖。这种技术对纤维素发酵系统中纤维二糖酶活性低的现状有所帮助。     

麻类脱胶高效菌株果胶裂解酶基因克隆与表达

【目的】克隆麻类脱胶高效菌株Dickeya sp.DCE-01的果胶裂解酶基因并进行原核表达,对表达产物进行纯化和酶学性质研究。【方法】根据该菌株全基因组序列预测的果胶裂解酶基因Q59419设计引物,PCR扩增后将该基因连接到pEASY-E1和pACYCDuet-1载体上,导入E.coli BL21(DE3)进行表达。选择酶活力高的阳性克隆子进行大量诱导表达后,采用超滤和Sephadex G-100凝胶层析两步法纯化出果胶裂解酶,研究其酶学性质。【结果】克隆到果胶裂解酶基因pel(GenBank登录号:JX964997),其序列全长1 128 bp,编码375个氨基酸。pACYCDuet-1-pel-BL表达胞外果胶裂解酶活力最高,发酵液粗酶活达298.8 IU/mL。其最适反应温度为50°C,最适pH为9.0;保温1 h,酶活稳定温度≤45°C,稳定pH为9.0?10.0。酶催化作用依赖于Ca2+,其最适作用浓度为2 mmol/L;Zn2+、Ca2+和NH4+促进酶活力,Fe3+和Pb2+严重抑制酶活力;聚半乳糖醛酸钠为该酶的最适底物。【结论】从麻类脱胶高效菌株中发掘到碱性果胶裂解酶基因,其表达产物在生物质加工过程中具有重要工业化应用前景。     

一株β-葡萄糖苷酶产生菌株的分离鉴定及酶学性质研究

【目的】分离获得β-葡萄糖苷酶高产菌株,确定该菌分类地位,并对其所产β-葡萄糖苷酶的酶学性质进行初步研究。【方法】采用七叶灵显色法从土壤样品中筛选β-葡萄糖苷酶产生菌,再用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)显色法进行复筛;通过形态特征、生理生化特征及16S rDNA序列相似性分析等方法确定其分类学地位;利用超滤、疏水层析、阴离子层析、分子筛层析法对β-葡萄糖苷酶进行分离纯化;以PNPG为底物,测定β-葡萄糖苷酶的最适反应pH及最适反应温度,通过双倒数作图法确定β-葡萄糖苷酶催化不同底物水解的米氏常数Km值。【结果】从土壤样品中筛选得到一株β-葡萄糖苷酶高产菌株ZF-6C,初步鉴定为Bacillus korlensis;芽胞杆菌ZF-6C所产β-葡萄糖苷酶的分子量约为90 kD,最适反应pH和温度分别为7.0和40°C,该酶具有水解β(1,4)糖苷键的活性,最适底物为邻硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷,Km值为0.73 mmol/L。金属离子Ca2+、Pb2+增强酶活,而Cu2+、Fe2+抑制酶活。【结论】首次报道从Bacillus korlensis中分离得到β-葡萄糖苷酶,Bacillus korlensis ZF-6C所产β-葡萄糖苷酶在分子量、最适反应条件及底物特异性等方面均不同于已知酶,可能为一结构新颖且催化效率较高的β-葡萄糖苷酶。