绿荧光蛋白及其在转基因动物研究中的应用

绿荧光蛋白（ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ,ＧＦＰ）是源于水母（Ｊｅｌｙｆｉｓｈ）、海笔（ＳｅａＰｅｎ,ＳｅａＰａｎｓｙ）等海洋无脊椎动物的一种蛋白质,这种蛋白质在体外经适当波长的光激发便可发出绿光,所发出的绿光用普通荧光显微镜或荧光激活细胞分拣器（ＦＡＣＳ）均可检测到。ＧＦＰ作为动、植物以及微生物基因工程研究上的一种选择标记具有检测灵敏度高,操作简便,对机体毒副作用小且不需要添加任何底物或辅助因子等优点,更重要的是检测ＧＦＰ无损于细胞或胚胎的完整性及活力。本文概括介绍ＧＦＰ的生化、发光光谱及遗传学特征及其在转基因动物研究上的应用。     

绿色荧光蛋白

来源于水母Aequorea victoria的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)现已成为在生物化学和细胞生物学中研究和开发应用得最广泛的蛋白质之一. 其内源荧光基团在受到紫外光或蓝光激发时（λ_max=395 nm, 小峰在479 nm）可高效发射清晰可见的绿光. GFP的高分辨率晶体结构为了解和研究蛋白质结构和光谱学功能关系提供了一个极好的机会. GFP已成为一个监测在完整细胞和组织内基因表达和蛋白质定位的理想标记. 通过突变和蛋白质工程构建的GFP嵌合蛋白在生理指示剂、生物传感器、光化学领域以及生产发光纤维等方面展示了广阔前景.     

不同光质下生长的满江红叶绿体和共生者满江红鱼腥藻的吸收光谱和荧光光谱的研究

测定了不同光质下培养的满江红的叶绿体和满江红鱼腥藻的吸收光谱和荧光光谱。吸收光谱表明:对于前者叶绿体,红光和蓝光比白光和绿光更有利于Chl a的形成。对于后者光对其色素的影响比叶绿体更为敏感。在白光下其胆藻素含量最高,在红光下P_(330)含量最高,依次为蓝光、白光、绿光;而类胡萝卜素相对稳定。荧光发射光谱表明:红光下培养的满江红的叶绿体PS Ⅱ荧光发射最强,蓝光、白光、绿光依次减弱。这与我们在电镜下观察到叶绿体膜垛叠的结果是一致的。而在满江红鱼腥藻中,不同光质下的差异与叶绿体不同。从荧光光谱和类囊体膜垛叠的分析表明,我们从另一方面支持了Arntzen等(1977)关于系统Ⅱ颗粒主要分布在基粒膜上的观点。     

发光二极管光质对念珠藻葛仙米生长及生理生化特性的影响

利用发光二极管（LED）作为光源,以冷百荧光灯光作为对照,研究不同光质红光637 nm、绿光529 nm、蓝光453 nm、白光（400700） nm对念珠藻葛仙米生长和生理生化特性的影响。结果表明:在培养前期,红光促进藻蓝蛋白合成,而藻红蛋白合成受抑制;蓝光和绿光则促进藻蓝蛋白合成。在培养后期,红光处理有利于叶绿素a和类胡萝卜素积累,其含量分别达到干重的1.33%和0.24%;绿光、白光和冷白荧光培养物的相应色素的含量均约占1.0%和0.16%;蓝光培养物的相应色素含量分别仅为0.45%和0.11%。红光培养物的氨基酸含量达干重的23.1%,是对照的1.58倍。除蓝光外其他光质对还原糖的含量影响无显著差异。在培养过程中LED白光和冷白荧光培养物的平均相对生长速率分别约为其他色光培养物的1.3和1.5倍。       

盘基网柄菌野生型KAx-3发育过程中自发荧光的观察

社会性变形虫盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)是研究发育和致病机理的重要模式生物之一.发育过程中自发荧光的研究有利于流式细胞仪检测时确定基础荧光阈值、细胞分选和判定荧光标记实验的准确性.本文用荧光显微镜对盘基网柄菌野生型KAx-3不同发育阶段在4种不同波长的激发光(蓝光、绿光、黄光和紫外线)...     

发光二极管光质对念珠藻葛仙米生长及生理生化特性的影响简

利用发光二极管(LED)作为光源,以冷百荧光灯光作为对照,研究不同光质[红光637 nm、绿光529 nm、蓝光453 nm、白光(400—700)nm]对念珠藻葛仙米生长和生理生化特性的影响。结果表明:在培养前期,红光促进藻蓝蛋白合成,而藻红蛋白合成受抑制;蓝光和绿光则促进藻蓝蛋白合成。在培养后期,红光处理有利于叶绿素a和类胡萝卜素积累,其含量分别达到干重的1.33%和0.24%;绿光、白光和冷白荧光培养物的相应色素的含量均约占1.0%和0.16%;蓝光培养物的相应色素含量分别仅为0.45%和0.11%。红光培养物的氨基酸含量达干重的23.1%,是对照的1.58倍。除蓝光外其他光质对还原糖的含量影响无显著差异。在培养过程中LED白光和冷白荧光培养物的平均相对生长速率分别约为其他色光培养物的1.3和1.5倍。     

绿色荧光蛋白在蛋白质研究中的应用

绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）自发现以来,由于具有自发荧光等特性,在分子生物学和细胞生物学领域得到广泛应用。GFP作为一种报道分子,在研究蛋白质相互作用和构象变化、检测蛋白质表达、蛋白质和细胞荧光示踪中,起到了重要的作用。该文通过对绿色荧光蛋白特性的分析．介绍其作为荧光标记在蛋白质研究中的应用,并展望进一步的研究前景。     

嗜热藻BP-1中几个蓝细菌光敏色素结构域体内重组及光化学性质研究

通过蛋白质序列同源性比对分析,在嗜热藻（Thermosynechococcus elongatus BP-1）里面找到了与已知的Pb/Pg型蓝细菌光敏色素TePixJ和TeTlr0924同源的3个基因tlr0911、tlr1215和tlr1999。通过分子克隆技术把它们的GAF结构域分别构建在pET30a（＋）表达载体上,与可生成藻蓝胆素（PCB）的质粒pACYCDuet-ho1-pcyA在大肠杆菌BL21（DE3）体内重组,生成重组蛋白,利用亲和层析柱分离纯化,纯化后的蛋白质经过锌荧光和蛋白质酸性尿素变性以及荧光光谱和吸收光谱等实验分析鉴定,结果表明,Tlr0911-GAF存在蓝光吸收态Pb406 nm和绿光吸收态Pg527 nm之间的可逆光转换,它可共价结合两种藻胆色素,即藻紫胆素（PVB）和藻蓝胆素（PCB）,Tlr1999-GAF则存在蓝光吸收态Pb417 nm和青光吸收态Pt496 nm之间的可逆光转换,它同样共价结合PVB和PCB,而Tlr1215-GAF1和Tlr1215-GAF2不能自发结合藻胆色素,不具有光活性。     

嗜热藻BP-1中几个蓝细菌光敏色素结构域体内重组及光化学性质研究北大核心CSCD

通过蛋白质序列同源性比对分析,在嗜热藻(Thermosynechococcus elongatus BP-1)里面找到了与已知的Pb/Pg型蓝细菌光敏色素TePixJ和TeTlr0924同源的3个基因tlr0911、tlr1215和tlr1999。通过分子克隆技术把它们的GAF结构域分别构建在pET30a(+)表达载体上,与可生成藻蓝胆素(PCB)的质粒pACYCDuet-ho1-pcyA在大肠杆菌BL21(DE3)体内重组,生成重组蛋白,利用亲和层析柱分离纯化,纯化后的蛋白质经过锌荧光和蛋白质酸性尿素变性以及荧光光谱和吸收光谱等实验分析鉴定,结果表明,Tlr0911-GAF存在蓝光吸收态Pb406 nm和绿光吸收态Pg527 nm之间的可逆光转换,它可共价结合两种藻胆色素,即藻紫胆素(PVB)和藻蓝胆素(PCB),Tlr1999-GAF则存在蓝光吸收态Pb417 nm和青光吸收态Pt496 nm之间的可逆光转换,它同样共价结合PVB和PCB,而Tlr1215-GAF1和Tlr1215-GAF2不能自发结合藻胆色素,不具有光活性。     

不同光质对钝顶螺旋藻生长和放氧放氢活性的影响

红光下培养的螺旋藻生长快,于物质积累多,叶绿素含量和藻胆蛋白含量较高;绿光下培养的藻蛋白质含量及放氢活性高;蓝光下培养的藻的放氧活性最高。     

对同一细胞内DNA、RNA和蛋白含量相关测定的显微荧光光度法

用荧光染料DAPI、PyroninY和FITC分别染同一细胞内DNA、RNA和蛋白.在紫外光、绿光和兰光顺序激发后,用MPVⅡ显微荧光光度计测量反映单个细胞内DNA、RNA和蛋白含量的荧光强度.根据荧光发射光谱分析,每种染料荧光之间的干扰是可以忽略的.测量结果与FCM获得的结果是一致的.显微荧光光度术对单个细胞多参数相关测量的优点是简单、便宜,并可用于对活细胞获得形态学和定量细胞化学的组合信息.     

绿色荧光蛋白的神奇功能

高通量遗传筛选已经揭示出许多潜在的蛋白质·蛋白质之间的相置作用．但这些作用需要进一步验证和研究。在本文中．研究者为解决这一问题．研发出一种简单的分析方法．它整合了含有绿色荧光蛋白（GFP）荧光影像的酵母双杂交系统的威力．可以直接显示活细胞中蛋白质－蛋白质相互作用。这种方法就是荧光双杂交（F2H）分析．它采用了经过修改的lac阻抑物系统,将一种荧光诱饵蛋白固着在染色体lac操纵子阵列．形成一个亮色斑点．具有不同荧光的诱捕融合蛋白质可根据颜色的变化进行共定位分析。     

核糖核酸酶、胰凝乳蛋白酶等蛋白质光照产生荧光物质的研究

对核糖核酸酶、胰凝乳蛋白酶等近十种蛋白质、氨基酸及其衍生物进行光照研究,发现在强紫外光照后都能产生荧光物,其发射峰的位置在400um左右.光照带芳香氨基酸残基的蛋白质形成荧光物是蛋白质的一个共同的特性.进一步分离这些蛋白荧光物时,发现这些蛋白质受到紫外光照后,有一定的破坏,包括链的断裂和某些氨基酸含量的减少.     

特异性的蛋白小分子荧光探针及其标记技术

活体蛋白荧光标记技术已经被广泛应用于蛋白质功能的可视化研究中。荧光蛋白常被用来研究蛋白质在生物体内的表达和定位,但由于它本身体积比较大,往往会影响目标蛋白的生物活性。特异性的小分子荧光探针以其体积小、膜透性好、背景噪音低以及制备方便的优点成为蛋白质研究的一个有力工具。本文将简要介绍近几年来各类特异性小分子蛋白荧光探针的研究进展。     

基于荧光蛋白的荧光共振能量转移探针的构建及应用

荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)是基于荧光基团供体和荧光基团受体间偶极子–偶极子耦合作用的非辐射方式的能量传递现象。基于荧光蛋白的FRET技术已被广泛用于研究细胞信号通路中蛋白质–蛋白质活体相互作用检测、蛋白质构象变化监测以及生物探针的研制中。基于荧光蛋白的荧光共振能量转移探针使得人们可以在时间和空间层面上研究细胞信号的转导过程。该文简要介绍了四大类基于荧光蛋白的FRET生物探针的设计、研制以及其在生物信号分子检测、活细胞成像以及药物筛选中的应用和进展情况。     

裙带菜与菠菜的色素-蛋白质复合体的比较研究

裙带菜ＰＳＩ复合体的７７Ｋ荧光发射光谱与菠菜的明显不同,缺少７３０ｎｍ长波荧光峰,位于７１５ｎｍ处,其捕光色素－蛋白质复合体有墨角藻黄素－叶绿素ａ／ｃ－蛋白质复合体和叶绿素ａ／ｃ－蛋白质复合体两种,菠菜只有一种叶绿素ａ／ｂ－蛋白质复合体。     

双分子荧光互补技术

双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation, BiFC）是近年发展起来的用于体内或体外检测蛋白质相互作用的一项新技术.该技术是将荧光蛋白在合适的位点切开形成不发荧光的2个片段,这2个片段借助融合于其上的目标蛋白的相互作用,彼此靠近,重新形成能具有活性的荧光蛋白.BiFC方法简单直观,既可以检测蛋白之间的相互作用,也可以定位相互作用蛋白质的位点.多色BiFC系统共用或与荧光共振能量转移（FRET）技术联用,还可以检测细胞内多个蛋白质的相互作用.     

大豆液泡膜H+-ATPase功能与构象关系的初步研究

大豆液泡膜V型H⁺-ATPase是ATPases中的一种,它在植物细胞的生长发育中有重要的作用.利用竹红菌乙素(HB）和KI这两种分别猝灭蛋白质疏水区域内源荧光和亲水区域内源荧光的荧光猝灭剂,在不同pH值、温度条件下对纯化的大豆液泡膜V型ATPase进行荧光猝灭实验,初步探讨了V型H⁺-ATPase的水解活性同其蛋白质折叠状态间的关系.研究表明,通过比较不同pH值、温度条件下蛋白质疏水区域和亲水区域内源荧光的荧光猝灭常数（K_SV）,发现当环境pH值、温度偏离酶的最适pH值和温度时,蛋白质的内源荧光强度降低且疏水区域和亲水区域内源荧光的荧光猝灭常数（K_SV）降低,说明伴随着酶的水解活性降低,蛋白质的折叠状态发生了变化.我们认为蛋白质在膜内的折叠状态变化是酶失活机制的一个重要方面,为植物的抗冻和抗盐研究提供了一定的参考.     

与一分子荧光分析系统相结合的蛋白质精确标记技术

识别4个碱基密码子的tRNA与荧光标记的氨基酸结合部位特异的标记蛋白质的试剂盒开发成功。与奥林帕斯公司的一分子荧光分析系统相结合,将在蛋白质相互作用的分析方面发挥威力。[编者按]     

利用荧光蛋白对大肠杆菌蛋白质Tat转运系统的研究

探讨了荧光蛋白作为报告蛋白用于蛋白质转运系统研究的可行性 ,结果表明海葵红色荧光蛋白聚集在细胞质内 ,不能转运至周质空间。而水母绿色荧光蛋白在Tat信号肽和Tat转运酶的共同作用下 ,以折叠形式转运至周质空间。通过荧光定量分析表明信号肽保守序列中的双精氨酸是保证绿色荧光蛋白转运及转运效率所必需的 ,且第二个精氨酸比第一个精氨酸更为重要。同时 ,揭示了Tat信号肽需要一定的高级结构才能行使功能 ;Tat信号肽不仅引导蛋白质的转运 ,而且也参与蛋白质的折叠。因此 ,绿色荧光蛋白是非常理想的报告蛋白 ,可用于研究Tat系统 ,但是海葵红色荧光蛋白易于聚集而不适合于此目的。