YAC克隆的筛选及鉴定分析技术

人工酵母染色体（ＹＡＣ）技术是人类基因组分析及疾病相关基因的分离、克隆中的关键技术。在基因组ＹＡＣ文库基础上特定目的基因的分离克隆涉及ＹＡＣ克隆的筛选,嵌合体、缺失体和共转染克隆的检测与处理,插入片段的分离及其结构特征的分析,亚克隆的快速构建等等。近年来,有关技术取得了重要进展,已趋于成熟,并正得到广泛应用 。     

水稻核基因组DNA的YAC克隆和鉴定

将EcoRI部分消化的水稻(Oryza sativa L.)细胞核高分子量DNA电泳分部,回收大于200kb的片段,与内切酶消化过的酵母人工染色体(YAC)双质粒载体pJs97。pJS98DNA连接,转化酵母YPH252感受态原生质球,用ura^-,TrP^-双选择培养基直接筛选转化子,已获得2 000多个克隆。转化子DNA的southern杂交显示插入片段在200～820kb范围。     

人基因组YAC分子克隆库的构建及DMD基因YAC克隆的筛选

以pYAC4为载体,以正常人白细胞和含4条X染色体的细胞株GM1414为DNA源构建成人基因组YAC(Yeast Artificial Chromosome,酵母人工染色体)分子克隆库,已得到原始克隆近2万个,插入DNA片段长度在400—1000kb,从其中选出一组YAC克隆,它们含有DMD基因全部DNA顺序。     

酵母人工染色体克隆

在重组ＤＮＡ技术中,常用的克隆载体,如质粒、λ－噬菌体、粘性质粒等,其可插入的外源ＤＮＡ的容量上限为５０ｋｂ。在构建一般的小基因克隆时,这些载体的容量完全可以满足需要。但是,在诸如人类及其它高等动、植物的基因组分析,真核细胞基因功能研究以及定向克隆等...     

嵌合YAC克隆的成因,检测及减少嵌合的对策

ＹＡＣ克隆技术因其克隆容量大而成为基因组研究的重要工具。但因为存在高嵌合率,不利于ＹＡＣ库应用。嵌合产生的原因有共连接,共转化及同源重组,据此发展了相应的检测方法,并可分别采用双酶切法,提高原生质体浓度法,及使用重组缺陷菌株等措施来降低了由于上述原因造成的嵌合,使ＹＡＣ库使用更方便。     

YAC克隆系统

目前,利用质粒和噬菌体作为载体,已完成了许多基因与基因组DNA片段的克隆及作图.但是,质粒和噬菌体所能携带的外源DNA片段的大小是很有限的.一般来说,入噬菌体能携带的DNA片段不超过25kb;Cosmid质粒所能携带的DNA片段不超过45kb.而现在发现的一些大基因,如人类的Factor VIII基因(180kb)和Dystrophin基因(1800kb)都已远远超过上述载体的克隆容量.这些容量较小的克隆载体,在克隆真核基因组的染色体时,遇到了巨大的困难.为了克服这一难题,80     

人基因组YAC克隆DNA的Alu—PCR反应条件的系统研究

在人基因组ＹＡＣ克隆的Ａｌｕ－ＰＣＲ指纹分析中要求ＤＮＡ扩增带具有ＹＡＣ特征性;在Ａｌｕ－ＰＣＲ方法对ＹＡＣ克隆中的人类基因组ＤＮＡ片段进行特异的同位素标记时则要求被增标记的ＤＮＡ序列在插入片段中具有一定弥散性,我们建立了两种不同的Ａｌｕ－ＰＣＲ反应体系以满足这一不同要求,并已得到较为满意的结果,根据不同条件下的Ａｌｕ－ＰＣＲ结果,分析了多引发位点ＰＣＲ中的一些现象,并作了解释。     

YAC介导的天蚕丝素基因向家蚕的转移 ——天蚕丝素基因—YAC克隆在家蚕的表达

本文为天蚕Antheraea yamamai丝素基因在家蚕Bombyx mori成功表达的首次报道。     

人基因组YAC克隆DNA的Alu－PCR反应条件的系统研究

在人基因组ＹＡＣ克隆的Ａｌｕ－ＰＣＲ指纹分析中要求ＤＮＡ且扩增带具有ＹＡＣ特征性;在用ＡｌＵ－ＰＣＲ方法对ＹＡＣ克隆中的人类基因组ＤＮＡ片段进行特异的同位素标记时则要求被扩增标记的ＤＮＡ序列在插入片段中具有一定的弥散性。我们建立了两种不同的Ａｌｕ－ＰＣＲ反应体系以满足这一不同要求,并已得到较为满意的结果。根据不同条件下的Ａｌｕ－ＰＣＲ结果,分析了多引发位点ＰＣＲ中的一些现象,并作出了解释。     

海水中DHA产生菌的筛选及一株高产菌的鉴定

从海水中筛选产DHA的微生物,共采集海水样品280余份,用苏丹黑染色法得到160株产油脂菌株,在对60株脂肪粒较大的微生物用索氏抽提法提取油脂后,初筛得到油脂含量高于8%的菌株7株。对10株油脂产量较高的菌株进行复筛,编号7-3的菌株油脂含量达到15.9%,DHA在油脂中的含量达到45.2%,选用7-3作为目的菌株。对7-3进行形态特征、培养特征及生理生化特征鉴定,初步判定菌株7-3为酒香酵母属(Brettanomyces sp.)。     

人Xp11.2区4.3MbYAC重叠群：大尺度限制图与CpG岛分析

人Ｘｐ１１．２区域具有重要的医学遗传学和基础遗传学价值,它包含很多遗传疾病基因,且至少包含一个逃避Ｘ染色体失活的位点,非常规的基化多态也有发现。我们利用这一区域已知的一系列ＤＮＡ位标,从我们构建的ＹＡＣ库中筛选出一系列ＹＡＣ克隆。     

海水中DHA产生菌的筛选及一株高产菌的鉴定

从海水中筛选产DHA的微生物,共采集海水样品280余份,用苏丹黑染色法得到160株产油脂菌株,在对60株脂肪粒较大的微生物用索氏抽提法提取油脂后,初筛得到油脂含量高于8%的菌株7株。对10株油脂产量较高的菌株进行复筛,编号7-3的菌株油脂含量达到15.9％,DHA在油脂中的含量达到45.2%,选用7-3作为目的菌株。对7-3进行形态特征、培养特征及生理生化特征鉴定,初步判定菌株7-3为酒香酵母属(Brettanomyces sp.)。     

人基因组百万碱基级巨型YAC的构建

人基因组百万碱基级巨型ＹＡＣ的构建戴长虹,柴建华（复旦大学遗传学研究所,上海２００４３３）关键词人基因组;酵母人工染色体（ＹＡＣ）;百万碱基;巨型ＹＡＣ人类的全部遗传信息包含在３ｘ１０＇核着酸对（ｈｐ）中,共编码５００００～１０００００个基因。人类基...     

YAC介导的天蚕丝素基因向家蚕的转移──天蚕丝素基因-YAC克隆在家蚕的表达

本文为天蚕Antheraeyamamai丝素基因在家蚕Bombyxmori成功表达的首次报道。我们构建了天蚕丝素基因的YAC克隆,然后把含有该克隆的DNA溶液导入家蚕受精卵。分子杂交实验证明天蚕丝素基因已整合到家蚕基因组中。通过丝心蛋白氨基酸组分分析以及茧丝的溶解性比较,发现有部分转基因家委表达了天蚕丝素基因。F2代的转基因家蚕蛾的染色体DNA中同时还存在YAC序列,说明YAC对丝素基因具有介导作用。天蚕丝素基因以单拷贝形式存在于转基因家蚕中。     

PCR筛选阳性克隆方法的改进

ＰＣＲ筛选阳性克隆具有简便、快速的优点,但常发生假阳性错误。用与载体匹配的引物和目的的基因引物组合进行ＰＣＲ,可以消除假阳性,同时可以判断插入目的基因的方向。     

高发酵度酵母的筛选及鉴定

主要研究了Saccharomyces cerevisiae wx、Saccharomyces cerevisiae qp、Saccharomycescerevisiae nq、Saccharomyces cerevisiae cx、Saccharomyces cerevisiae hs和Saccharomyces cerevisiae3322(以下简称S.C.wx、S.C.qp、S.C.nq、S.C.cx、S.C.hs和S.C.3322)6株酵母菌的形态、同化氮源、发酵力、α-葡萄糖苷酶活力等生理特性,通过实验比较发现S.C.nq和S.C.cx两株菌种在利用糖的种类、同化氮源、真正发酵度及α-葡萄糖苷酶活力等方面较高,因此对这两株菌种进行了还原双乙酰、糖代谢两方面性质的比较,结果表明:两株菌种在还原双乙酰、糖代谢两方面效果显著,筛选出两株优良的高发酵度啤酒酵母菌种。     

基因组YAC文库构建方法的几点改进

以pJS97、pJS98为载体, 对中国人基因组YAC文库的构建进行了尝试.建立了一种对小片段DNA“原位电泳筛除”的方案, 采用多胺溶液处理以减少大片段DNA的降解, 使整个建库工作更加简便、有效. 此外, 改进了转化子的挑取和保存的方法, 既简化了操作, 又减少了杂菌污染和交叉污染. 这些改进的方案, 可以推广到其他高等生物基因组YAC文库的构建和应用工作.