下游工艺开拓中如何系统地筛选离子交换层析介质

下游层析工艺开拓中,选择层析介质最重要的因素包括纯度、动力载量和凝胶的使用寿命。本文作者示范了介质的动力载量及其回收率的重要区别。     

金黄色葡萄球菌蛋白A (SpA) Z结构域串联体的克隆、表达和筛选

筛选一种高效重组金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)用于制备抗体纯化亲和介质。首先通过基因操作获得金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)的Z结构域单体、二串体、三串体、四串体和五串体基因,将目的基因分别克隆至pET-22b表达载体并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,获得不同串联个数的Z结构域基因工程菌,经诱导表达和Ni2+亲和层析纯化得到Z结构域单体和二-五串体蛋白。纯化后的目的蛋白偶联至琼脂糖凝胶作为亲和层析介质,对人免疫球蛋白G(IgG)进行分离纯化。分析比较Z结构域串联体蛋白产量及其偶联的亲和介质对抗体吸附载量的差异。结果表明,构建的Z结构域单体、二串体、三串体、四串体和五串体基因工程菌能有效表达目的蛋白,制备的凝胶亲和介质可特异性吸附人IgG。增加Z结构域串联数,重组蛋白产量和单位摩尔数多聚体蛋白吸附载量获得提高,其中,重组四串体蛋白产量大(160 mg/10 g湿菌体),对抗体的吸附载量高(34.4 mg人IgG/mL胶),更适合作为配基用于亲和层析介质的制备。     

密理博ProSep Ultra Plus

ProSep Ultra Plus是一种蛋白A亲和层析介质,是当前市场上动态结合载量及通量最高的一种亲和树脂,是为适应现今低成本、大规模制备高浓度治疗性抗体需求而设计的。     

检测HIV-1载量的荧光实时定量PCR技术的建立及其应用

准确测定HIV 1的前病毒载量和病毒载量的技术 ,在感染者预后和艾滋病患者药物治疗效果的评价以及艾滋病的其它研究方面 ,都具有十分重要的应用价值。以定量的HIV 1DNA和RNA为标准外参照 ,利用SYBRGreen荧光染料和GeneAmp5 70 0SequenceDetectionSystem (5 70 0系统 ) ,建立了测定HIV 1的前病毒载量和病毒载量的荧光实时定量PCR技术。以病毒感染细胞和培养上清为材料 ,测定了三种化合物 (AZT ,GL和WT)对细胞内的前病毒载量和培养上清中的病毒载量的抑制活性 ,并与合胞体形成抑制方法测定化合物抗病毒活性的结果进行了比较。根据病毒载量、前病毒载量和合胞体形成计算出的三种化合物的治疗指数均依次变小 ,提出以荧光实时定量PCR技术测定前病毒载量 ,会在评价药物在体内外根除或减少存在于CD4休止或记忆T淋巴细胞中的HIV 1前病毒方面有特别的价值。     

检测HIV-1载量的荧光实时定量PCR技术的建立及其应用

准确测定HIV-1的前病毒载量和病毒载量的技术,在感染者预后和艾滋病患者药物治疗效果的评价以及艾滋病的其它研究方面,都具有十分重要的应用价值。以定量的HIV-1DNA和RNA为标准外参照,利用SYBRGreen荧光染料和GeneAmp5700 Sequence Detection System(5700系统),建立了测定HIV-1的前病毒载量和病毒载量的荧光实时定量PCR技术。以病毒感染细胞和培养上清为材料,测定了三种化合物(AZT,GL和WT)对细胞内的前病毒载量和培养上清中的病毒载量的抑制活性,并与合胞体形成抑制方法测定化合物抗病毒活性的结果进行了比较。根据病毒载量、前病毒载量和合胞体形成计算出的三种化合物的治疗指数均依次变小,提出以荧光实时定量PCR技术测定前病毒载量,会在评价药物在体内外根除或减少存在于CD4休止或记忆T淋巴细胞中的HIV-1前病毒方面有特别的价值。     

检测HIV—1载量的荧光实时定量PCR技术的建立其应用

准确测定HIV－1的前病毒载量和病毒载量的技术,在感染者预后和艾滋病患者药物治疗效果的评价以及艾滋病的其它研究方面,都具有十分重要的应用价值。以定量的HIV－1 DNA和RNA为标准外参照,利用SYBR Green荧光染料和GeneAmp5700Sequence Detection System（5700系统）,建立了测定HIV－1的前病毒载量和病毒载量的荧光实时定量PCR技术,以病毒感染细胞和培养上清上材料,测定了三种化合物（AZT,GL和WT）对细胞内的前病毒载量和培养上清中的病毒载量的抑制活性,并与合胞体形成抑制方法测定化合物抗病毒活性的结果进行了比较,根据病毒载量、前病毒载量和合胞体形成计算出的三种化合物的治疗指数均依次变小,提出以荧光实时定量PCR技术测定前病毒载量,会在评价药物在体内外根除或减少存在于CD4休止或记忆T淋巴细胞中的HIV－1前病毒方面有特别的价值。     

实时荧光定量PCR检测马尔尼菲篮状菌病组织样本中菌载量的研究

目的实时荧光定量PCR测定马尔尼菲篮状菌病组织样本中马尔尼菲篮状菌的载量。方法收集马尔尼菲篮状菌病患者的皮肤病理切片、淋巴结活检组织,提取总DNA,采用实时荧光定量PCR技术检测样本中马尔尼菲篮状菌载量。结果皮肤病理切片、淋巴结活检组织中马尔尼菲篮状菌载量阳性。病理切片平均菌载量3.01×10~4 copies(1.07×10~4~7.26×10~4 copies),淋巴结活检组织中马尔尼菲篮状菌载量4.68×10~5 copies。结论荧光定量PCR能高效检测皮肤病理切片、淋巴结活检组织中马尔尼菲篮状菌载量,对马尔尼菲篮状菌病诊断有一定的价值。     

呼吸道感染患儿EBV-DNA载量表达及其与肝肾功能损伤的关系研究

摘要 目的：探讨呼吸道感染患儿爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）-脱氧核糖核酸（DNA）载量表达及其与肝肾功能损伤的关系研究。方法：选取2016年1月至2019年6月本院门诊及病房住院治疗经临床确诊的175例呼吸道感染儿童为研究对象,依据EBV-DNA载量水平分为阳性组（n=117）和阴性组（n=58）,比较不同性别、年龄的呼吸道感染患儿EBV-DNA阳性率,根据EBV-DNA载量峰值将阳性组患儿分为EBV-DNA高载量组(n=21)、中载量组（n=35）和低载量组（n=61）,比较不同EBV-DNA载量组患儿肝肾功能异常比例及血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、胱抑素 C(CysC)、β₂微球蛋白(β₂-MG)水平,Pearson相关性分析EBV-DNA载量与ALT、AST、CysC、β₂-MG的关系。结果：不同性别患儿间EBV -DNA阳性率差异无统计学意义（P>0.05）,1-3、3-6岁年龄段儿童中EBV -DNA阳性率最高,不同年龄间患儿EBV -DNA阳性率差异有统计学意义（P<0.05）;EBV-DNA低载量组、中载量组、高载量组的肝异常比例为19.67%、48.57%、66.67%,肾异常比例为13.11%、42.86%、52.38%,不同EBV -DNA载量患儿肝肾功能异常比例相比,差异有统计学意义（P<0.05）;血清ALT、AST、CysC、β₂-MG水平随EBV-DNA载量升高而升高（P<0.05）, EBV -DNA载量与ALT、AST、CysC、β₂-MG水平呈正相关性（P＜0.05）。结论：呼吸道感染患儿EBV -DNA载量升高会增加发生肝肾功能损伤的风险,且在1-6岁儿童EBV -DNA阳性率较高,检测EBV -DNA载量有助于呼吸道感染患儿肝肾功能的损伤的评估。     

猴免疫缺陷病毒（SIV）在艾滋病模型恒河猴组织中的分布和载量测定

目的研究当艾滋病恒河猴模型的血浆病毒载量处于低水平或阴性时,猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency viruses,SIV）在宿主组织中的分布情况。方法SIVmac251感染恒河猴10只,定期检测其血浆载量,感染病毒平均高峰时间第14天时,活检取淋巴结。选取感染18个月后病毒载量最低水平和阴性的2只艾滋病猴（SAIDS）,经安死术后取淋巴结、脾、肝、肺、肾、脑等组织,用原位杂交和实时荧光定量PCR的方法检测病毒在组织中的分布和组织中的病毒载量。结果感染后14d,10只猴血浆病毒载量达到10^7copies/mL,淋巴结组织病毒载量为10^5-10^8copies/g,原位杂交方法在腹股沟淋巴结中检测到强阳性斑点。感染后第18个月的2只猴,血浆病毒载量下降并维持不高于10^2copies/mL水平或阴性,但组织分布不尽相同,在肠系膜淋巴结、肾上腺、海马回、空肠、脾脏等组织中检测到10^5-10^6copies/g的病毒载量,于一只猴的脑积液中检测到10^3copies/mL的病毒载量。用原位杂交的方法在肠系膜淋巴结和空肠中检测到强阳性斑点,其它组织中未检测到阳性斑点。结论实验证实SAIDS猴在血浆病毒载量低甚至阴性时,病毒在不同组织中仍有分布,有些组织中甚至出现高病毒载量,提示在制备SIV/SAIDS模型中,尤其在药物筛选和疫苗评价时,应考虑组织病毒载量指标的测定和药物、疫苗对组织病毒的治疗清除作用的评价。     

NIRF可抑制乙型肝炎病毒在水动力法转染HBV小鼠模型中的复制及表达

目前对NIRF(Np95/ICBP-90 like RING finger protein)的研究正朝着细胞癌变进程以及表观遗传学的方向发展,但在体内NIRF对乙型肝炎病毒(HBV)的复制及表达的影响,目前尚不明确.通过高压水动力法转染HBV小鼠模型,不同时间点收集血液和肝组织标本,荧光定量PCR检测血清及肝组织中病毒载量,WesternBlot检测肝组织HBc(hepatitis B virus core protein)表达,ELISA检测血清HBeAg表达,并通过免疫组化染色检测HBsAg、HBcAg在肝组织中的定位及表达.小鼠转染pAAV-HBV1.3和NIRF以后,血清及肝组织病毒载量降低(n=3,P<0.05),HBc蛋白及HBV相关抗原的表达受到抑制,说明在水动力法转染HBV小鼠模型中NIRF对HBV的复制及表达起到抑制作用,期待能为后续的HBV致病机理及治疗药物的研究与开发提供支持与帮助.     

赣南地区森林地表死可燃物载量与环境因子的关系

森林可燃物载量分布格局是植被与地形等环境因子之间相互作用的结果。本研究通过野外实测赣南地区主要7种森林类型地表死可燃物载量数据,依据时滞可燃物分类标准,构建了地表可燃物载量与地形、植被等环境因子间的结构方程模型,并分析了各因子的影响路径及其直接、间接和总效应。结果表明: 7种不同森林类型中,1、10和100 h时滞可燃物载量均是针阔混交林内最高,毛竹林内最低。对1 h时滞载量影响最大的变量依次为:坡度(影响系数为0.40)＞树冠高度(0.07)＞树种(-0.03)＞郁闭度(0.01);对10 h时滞载量影响最大的变量依次为:胸径(0.15)＞树种(-0.09)＞坡向(-0.08)＞郁闭度(-0.06);对100 h时滞载量影响最大的变量依次为:坡向(0.25)＞胸径(0.19)＞郁闭度(-0.08)＞树种(0.02);对可燃物总载量影响最大的变量依次为:坡度(0.22)＞树种(-0.04)、郁闭度(-0.04)＞树冠高度(-0.01)。     

宫颈上皮内瘤变治疗前后人乳头状瘤病毒载量的临床研究

目的:探讨宫颈上皮内瘤变(CIN)治疗前后人乳头状瘤病毒(HPV)载量与预后的意义.方法:从2006年6月～2009年9月间在新疆维吾尔自治区人民医院妇科门诊和妇科病房就诊的190例CIN患者,经宫颈环形电切术(LEEP)或宫颈冷刀锥切术治疗后进行1年随访,检测治疗前后HPV的载量,对病灶持续存在和复发进行分析.结果:CIN患者经LEEP或宫颈冷刀锥切术治疗后HPV平均载量较治疗前均显著降低(P＜0.01).随着HPV病毒载量持续时间越长,病变的持续存在率、复发率越高.结论:LEEP或宫颈冷刀锥切能显著降低CIN患者HPV载量,病毒载量影响疾病预后,其研究对随访和预后都有指导意义.     

乙型病毒性肝炎患者血清HBV-LP与HBV-DNA水平表达的相关性及临床意义

目的:探讨乙型病毒性肝炎患者血清乙肝病毒外膜大蛋白(HBV-LP)与乙肝病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA)水平表达的相关性及临床意义。方法:选择2016年1月至2018年6月间我院收治的乙型病毒性肝炎患者148例,根据不同乙型肝炎血清标志物模式将患者分为A组18例、B组52例、C组41例、D组37例。根据不同HBV-DNA载量分为阴性组70例、低载量组21例、中载量组35例、高载量组22例。检测不同乙型肝炎血清标志物模式下HBV-LP、HBV-DNA阳性率及水平,比较不同HBV-DNA载量HBV-LP水平和肝功能指标,并分析其相关性。结果:C组、D组患者HBV-LP、HBV-DNA阳性率及水平均高于A组和B组(P<0.05),A组和B组、C组和D组患者HBV-LP、HBV-DNA阳性率及水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。阴性组、低载量组、中载量组、高载量组天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、HBV-LP水平均呈逐渐升高的趋势,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。经Pearson相关性分析显示,乙型病毒性肝炎患者血清HBV-LP与HBV-DNA载量的对数值、ALT、AST呈正相关(P<0.05)。结论:乙型病毒性肝炎患者血清HBV-LP可以反映HBV复制情况,并于肝功能指标密切相关。     

大连市HIV感染者/艾滋病患者在抗病毒治疗过程中病毒载量及细胞免疫指标变化的相关性分析

目的研究大连市HIV感染者/艾滋病患者抗病毒治疗过程中,HIV病毒载量和细胞免疫指标的变化情况。方法选取2013年开始抗病毒治疗,治疗时间满一年的HIV/AIDS 60例,分别在进行抗病毒治疗过程中的0、6、12月用全自动病毒载量分析仪(COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan)检测HIV病毒载量,同时用流式细胞计数仪(FACSCalibur)检测CD4~+和CD8+T淋巴细胞数。结果60例HIV/AIDS中治疗前仅有9例患者有检测数据,都是高病毒载量(VL1 000),在治疗6个月后,病毒载量抑制比例为73.33%(44/60)、治疗12个月后,载量抑制比为81.67%(49/60)。两组治疗后比治疗前病毒载量抑制比显著升高(Z=12.85,P0.001;Z=16.35,P0.001)。随着治疗时间的推移,CD4~+T淋巴细胞数和CD4~+/CD8~+比值都有所上升,差异有显著性(F=72.73,P0.001;F=53.83,P0.001)。病毒载量越低,T淋巴细胞数及CD4~+/CD8~+比值越高,呈负相关,有显著性差异(F=21.66,P0.001;F=8.53,P0.001)。结论抗病毒治疗有助于提高CD4~+T淋巴细胞数,改善HIV/AIDS免疫状态。细胞免疫指标与病毒载量的相关性呈负相关。     

人乳头状瘤病毒分型及病毒载量与宫颈病变的研究进展

宫颈癌作为目前妇女最常见的恶性肿瘤,新发病例在全球范围内仍处于上升趋势。已有实验证明,HPV感染是宫颈癌发生发展的必要条件。然而不同分型及其病毒载量高低仍会影响诊断率,从而影响病情,使之发展为持续性感染,最终演变为癌前病变或宫颈癌。目前,研究者对于高危型HPV病毒载量与宫颈病变之间是否存在依存关系尚存争议。研究表明,高病毒载量可能成为预测宫颈癌前病变进展的指标,然而对于病理诊断明确的宫颈癌患者而言,病毒载量并不能代表病理分期。本文综述了人乳头状瘤病毒,不同基因分型,病毒载量等因素对于宫颈病变及宫颈癌的相关性的近年研究进展,希望有助于指导临床工作。     

马传染性贫血病毒弱毒疫苗株与亲本强毒株的体内病毒载量与诱导保护性免疫关系的研究

慢病毒免疫应答的载量阈值学说认为病毒载量决定了机体对病毒反应的类型。为了探讨马传染性贫血病毒(EIAV)血浆病毒载量与马体免疫保护的相关性,本研究利用Real-time RT-PCR方法对EIAV弱毒疫苗株(EIA-VDLV125)免疫马和EIAV强毒株(EIAVLN40)非致死剂量接种马血浆中病毒载量进行了动态比较。结果显示两组马在监测过程中皆可检测到相似水平的病毒载量(103～105copies/mL),且两者之间差异不显著(P0.05)。以上毒株接种23周后,对马匹进行了强毒株(EIAVLN40)的致死剂量攻毒,根据攻毒后典型马传贫急性发病与否确定接种保护率。结果显示,疫苗组的保护率为67%而非致死剂量强毒组的保护率为0。以上结果提示,病毒血浆载量不是决定EIAV弱毒疫苗诱导免疫保护能力的主要或单一因素。     

免疫抑制剂地塞米松可明显延长乙型肝炎病毒抗原在水动力法转染HBV小鼠模型中的表达

建立基于高压水动力法的乙型肝炎病毒(HBV)转染小鼠模型,并进一步建立和优化乙肝动物模型研究方法。首先构建了含腺相关病毒倒转末端重复序列元件与包含1.3个拷贝HBV基因组(ayw亚型)的HBV表达质粒(pAAV-HBV1.3);并将pAAV-HBV1.3质粒经高压水动力法尾静脉注射C57BL/6小鼠,不同时间点采集血液和肝组织标本,ELISA检测血清HBsAg、HBeAg表达;Real-time PCR检测血清及肝组织病毒载量;HE染色、免疫组化染色检测肝组织病理学改变及病毒抗原在肝组织中的定位及表达;最后采用免疫抑制剂地塞米松注射液(DEX)腹腔注射小鼠,建立免疫功能抑制小鼠模型,在此基础上制备乙肝病毒转染小鼠模型,并进行血清HBsAg、HBeAg检测。结果是正常免疫状态下,小鼠转染pAAV-HBV1.3 10d时血清及肝组织HBV相关抗原阳性,30d后HBV相关抗原检测阴性,但30d和60d血清及肝组织病毒载量检测均为阳性,且与对照组差异显著(P0.01,P0.05);经地塞米松注射后处于免疫抑制状态下的高压水动力法建立的乙肝病毒转染小鼠,则在60d仍可检测到HBsAg、HBeAg的表达。以上结果表明通过高压水动力法建立了急性乙肝小鼠模型,通过抑制小鼠免疫状态,可延长病毒在小鼠体内存留时间。该模型建立为HBV疫苗评价、药物开发及乙肝相关致病机理研究奠定了基础。     

人类免疫缺陷病毒感染者病毒载量研究

人类免疫缺陷病毒（ＨＩＶ）载量是指ＨＩＶ感染者体内潜伏的和具有复制活性的病毒数,它包括血浆中的循环ＨＩＶ－ＲＨＡ和整合到细胞内的ＨＩＶ－ＤＮＡ即前病毒。近年来随着检测技术的发展,人们发现早期感染者的组织中已存在大量病毒和病毒产物,因此可用病毒载量来评估无症状感染者的免疫状态和病毒的复制情况。近年来病毒载量的测定已被广泛地用于多项临床研究及观察中,现就ＨＩＶ感染者病毒载量研究的若干进展作一简要综述。     

I b 型慢性丙肝患者血清IL-10、IL-12 水平 与HCV-RNA 载量关系的研究*

目的:研究I b型慢性丙肝患者血清IL-10、IL-12水平与HCV-RNA载量的关系,探讨难治性丙肝的免疫发病机制。方法:选取HCV-RNA阳性的I b型慢性丙肝患者48例,依据病毒载量将其分为三个组,低病毒载量组(1.0*103IU/mL1.0*106IU/mL)13例,另选HCV-RNA阴性的慢性HCV感染者15例,健康献血员15例作为对照组;应用ELISA法检测所有研究对象的血清IL-10、IL-12水平。结果:慢性丙肝患者外周血IL-10水平显著高于健康献血员(P=0.003),IL-12水平低于健康献血员(P=0.045);随着HCV-RNA载量的升高,HCV-RNA阳性的I b型慢性患者外周血IL-10水平逐渐升高,组间比较差异具有统计学意义(F=18.65,P=0.000);血清HCV-RNA载量与血清IL-10水平呈正相关(相关系数r=0.71,P=0.000),与血清IL-12水平无相关性(P=0.479)。结论:慢性HCV感染者与患者的细胞免疫均倾向于TH2型;I b型慢性丙肝患者外周血IL-10水平与HCV-RNA病毒载量呈正相关。     

慢性乙型肝炎患者HBV-DNA载量与ALT的相关性研究

目的探究乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性、乙型肝炎e抗体(HBeAb)阳性、乙型肝炎核心抗体(HBcAb)阳性的慢性乙型肝炎患者的HBV-DNA载量与血清谷丙转氨酶(ALT)水平的相关性。方法纳入2018年1～12月我院收治的436例慢性乙型肝炎小三阳患者。采用实时荧光定量PCR法检测血清HBV-DNA含量,采用酶联免疫吸附试验检测ALT水平。以ALT值作为因变量,以HBV-DNA作为自变量,采用SPSS 16.0软件对指标开展曲线拟合,建立回归方程并分析曲线方程,分析HBV-DNA载量与ALT水平的相关性。结果 SPSS16.0软件建立幂模型:R~2=0.107,F=85.887,P=0.000,b0=47.785,b_1=0.075,b_2=0,分析曲线发现随着HBV-DNA载量的增加,ALT水平持续升高;当HBV-DNA载量升高到一定范围后,随着HBV-DNA载量增加,ALT水平变化幅度极小,无限接近某一特定值。结论慢性乙型肝炎小三阳患者HBV-DNA载量与血清ALT呈正相关,能反应病情好转程度,可作为临床监测疾病好转的指标。