人凝血因子Ⅶ cDNA基因的克隆与鉴定

目的:克隆并鉴定人凝血因子ⅦcDNA基因。方法:采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法,从人胎肝总RNA中扩增人凝血因子ⅦcDNA基因,将其克隆入pGEM-T载体,对阳性克隆进行序列测定和分析。结果:经RT-PCR扩增和克隆,获得了人凝血因子ⅦcDNA基因,经序列分析表明,所克隆的基因序列正确。结论:本试验成功克隆了人凝血因子ⅦcDNA基因,为重组人凝血因子Ⅶ的研究奠定了基础。     

三芒山羊草中新型储藏蛋白基因Avenin-like的克隆及分析

目的:克隆三芒山羊草(Aegilops neglecta)中新型avenin-like基因,揭示avenin-like基因的表达模式,并对克隆的基因进行相关的分析.方法:利用RT-PCR的方法揭示avenin-like基因的表达模式,并用PCR方法从三芒山羊草中克隆新型的ave-nin-like基因.结果:avenin-like基因在胚乳中特异性表达;克隆得到新型的avenin-like基因;avenin-like基因属于醇溶蛋白超基因家族,含19个半胱氨酸残基、形成8对分子内二硫键和3对分子间二硫键.结论:新型avenin-like基因的克隆为小麦品质改良提供了很好的基因资源.     

拟南芥AST基因的精细作图

拟南芥(Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.)ast(anthocyanin spottedtesta)突变体是由碳离子辐射诱导产生的与花青苷生物合成有关的基因突变体,受单隐性核基因控制.根据拟南芥数据库中的SNPs(single nucleotide polv-mophisms)序列和插入/缺失多态性(insertion/deletion polymorphisms)序列,设计了一系列分子标记.采用图位克隆策略,应用这些分子标记完成了对拟南芥AST基因的精细作图,成功地将AST基因定位到BAC克隆T13M11上,初步认为该BAC克隆中的基因T13M11.8可能是AST基因.该基因的DNA序列长1432bp,含有6个外显子和5个内含子,编码的蛋白与花青苷生物合成途径中的二氢黄酮醇-4-还原酶有较高的同源性.将进一步通过功能互补实验验证图位克隆的结果.     

葡萄球菌A蛋白基因的克隆及其IgG受体区新型表达载体的构建

旨在克隆SPA基因并将该基因的IgG结合区亚克隆至毕赤酵母表达载体中。以金黄色葡萄球菌CowanI菌株基因组为模板,对葡萄球菌A蛋白(SPA)基因全长序列进行PCR扩增,再将PCR产物克隆入pMD18-T质粒,将DNA测序所得的结果用Blastn软件进行在线同源比对,经鉴定为SPA基因序列后,在线对其进行功能区域(IgG-Fc受体区)的预测,将该区域亚克隆入表达载体pPICZaA。结果显示,从CowanI菌株中成功地扩增到SPA基因,与NCBI中公布的序列同源性高达97%,同时构建了IgG-Fc受体区新型的表达载体     

植物耐盐相关基因克隆的研究进展

随着植物分子生物学快速发展,植物耐盐性研究已深入到耐盐相关基因的克隆、基因的结构分析以及基因表达特性等领域.目前,耐盐相关基因的克隆工作进行的如火如荼,有很多植物的耐盐基因已经被克隆,这些已克隆的耐盐相关基因涉及盐胁迫信号传导、基因表达的调控因子、渗透调节物质、胚胎发育晚期丰富蛋白LEA(Late-embryogensiS-abundant)等,本文就盐胁迫涉及的信号传导基因、基因表达调控因子等的克隆研究进展作一简要概述.     

籽粒苋中PPDK基因的克隆及表达特性分析

为寻找能提高植物光合效率的基因资源,以高光效植物籽粒苋(Amaranthus hypochondriacus L.)为试材,利用同源克隆和RACE技术克隆了丙酮酸磷酸二激酶(Pyruvate orthophosphate dikinase, PPDK)基因,基因cDNA全长为3 224 bp,其中5′非翻译区为71 bp,阅读框为2 868 bp,3′非翻译区为285 bp,推导的蛋白质为956个氨基酸,分子量约106 kDa。序列分析表明,克隆的基因含有PPDK基因的功能结构域。表达模式分析显示克隆的PPDK基因在绿色组织中特异表达,为PPDK基因的长转录本,初步确定已克隆得到为籽粒苋中的PPDK基因,将其命名为AhPPDK。     

人钠/碘同向转运体基因cDNA的克隆与序列测定

为研究人钠／碘同向转运体(hNIS)的生物学性能和用于肿瘤放射性碘治疗的可能性,运用反转录聚合酶链反应(RT—PCR)从人甲状腺组织总RNA中扩增出hNIS基因cDNA序列,将其克隆至pUCm-T载体中。序列分析证实克隆片段与献报道的hNIS基因cDNA序列完全一致,说明已成功克隆到hNIS基因cDNA。     

噬菌体φ297切除酶(xis)基因的克隆和序列分析

目的:克隆噬菌体φ297 切除酶(xis)基因,并对其进行遗传与变异研究。方法:提取埃希氏大肠杆菌O157:H7 菌株EH297染色体DNA,采用步移PCR方法寻找目的基因,并通过克隆、亚克隆、DNA测序等分子生物学方法获得切除酶基因,通过序列分析软件对此基因进行分析。结果:克隆获得噬菌体φ297编码的切除酶基因(xis)的完整序列,它的长度是255 bp,编码了一个84个氨基酸组成的蛋白质(Xis),将它们的序列与λ噬菌体的切除酶家族的其它成员进行了比较。其结果是噬菌体φ297的切除酶基因(xis)与噬菌体VT1-Sakai的切除酶基因(xis)只有4个核苷酸的不同,而Xis蛋白与噬菌体VT1-Sakai的Xis蛋白是一样的,与噬菌体933W的Xis蛋白只有47.2%的相似性。结论:噬菌体φ297编码的切除酶基因(xis)与λ噬菌体的切除酶基因同源。     

真菌果胶酶的分子生物学研究进展

近10年来国外在果胶酶分子生物学研究上取得了重大进展,从11个属的真菌克隆了50个以上的基因并测序。对果胶酶基因的结构、功能、调控、录译后加工等方面进行了深入探讨。已克隆的果胶酶基因以多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因和果胶裂解酶(PL)基因为主,也有果胶酯酶(PE)基因和鼠李半乳糖醛酸酶(RHG)基因,大多有内含子。前体蛋白一般有N信号肽和糖基化位点。果胶酶一般受果胶、低浓度的(01%)D半乳糖醛酸等诱导,而受较高浓度(1%)的半乳糖醛酸、抗体、某些抗菌素抑制。     

绿色木霉纤维素酶CBHII基因的分子克隆

本文以噬菌体lambda EMBL3 DNA为载体,通过克隆绿色木酶(Trichoderma viride)高分子量基因组DNA的部分酶解片段,并将重组分子进行体外包装后侵染Escherichia.coli K802,由此构建了绿色木霉基因文库。以李氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素酶CBHII基因的末端片段为探针,用轮迥噬菌斑原位杂交从文库中筛选出CBHII基因的阳性克隆5个,随机取其中3个克隆用上述探针作斑点杂交,结果进一步证明克隆了全长或近全长的绿色木霉CBHII基因,用李氏木霉CBHI基因的末端片段探针作斑点杂交,结果提示CBHI与CBHII基因的末端序列之间无同源性存在。从斑点杂交的阳性克隆中提取DNA,酶切鉴定插入片段的长度,并克隆于质粒pUC19,Southern杂交结果证明获得了含绿色木霉CBHII基因的重组质粒pCBHII-14。     

人内皮抑素基因的克隆与序列分析

目的 :克隆与鉴定人内皮抑素基因功能区片段。方法 :采用反转录聚合酶链反应 (RT PCR)的方法 ,从人胎肝总RNA中扩增人内皮抑素基因 ,将其克隆入 pGEM T载体 ,命名为pT hES ,并应用A377自动序列分析仪进行序列分析。结果 :成功克隆了人内皮抑素基因 ,经序列分析表明 ,所克隆的基因序列正确。这为利用基因工程技术生产重组蛋白奠定了基础。     

蔗茅野生种ErDREB1A基因的克隆与表达分析

为了充分利用蔗茅野生资源,培育耐寒转基因甘蔗提供可靠的候选基因,本研究以电子克隆结合RT-PCR的方法,在蔗茅(Erianthus fulvus)野生种(昆明蔗茅99-1)中克隆到1个干旱应答元件结合蛋白(dehy-dration responsive element binding protein,DREB)基因.生...     

中国蛇岛蝮蛇毒腺cDNA文库ESTs序列测定及生物信息学分析

前期我们构建了中国蛇岛蝮蛇(Gloydius shedaoensis shedaoensis,GSS)毒腺(GSSG)的cDNA(GSSG-cD-NA)文库。本文从构建的GSSG-cDNA文库阳性重组子中随机挑选了216个单克隆进行5’端表达序列标签(EST)单向测序,获得了211条高质量的ESTs。生物信息学序列比对分析结果表明84个克隆为已知功能基因,29个克隆为未知功能基因,98个克隆为新基因,分别占总ESTs的39.8%、13.7%和46.5%。成功获得了GSSG的部分ESTs序列,为GSS蛋白活性组分基因的克隆、表达和功能研究奠定了一定基础。     

牛不同供体核克隆囊胚Xist基因DNA甲基化程度的比较研究

利用亚硫酸氢盐测序法分析Holstein奶牛胎儿成纤维细胞(FFB)和输卵管上皮细胞(FOV)来源的克隆囊胚Xist基因DNA甲基化状况,以体外受精囊胚(IVF)和供体细胞作对照.克隆囊胚Xist基因处于较低程度的DNA甲基化状态,其中,FFB来源的克隆囊胚Xist基因DNA甲基化程度为43%,而FOV来源的克隆囊胚仅为17%.在体外受精囊胚中,Xist基因DNA甲基化处于中等状态,为49%.然而,在体细胞中,Xist基因的甲基化程度较高,FFB为66%,FOV为63%.这些结果说明,Xist基因DNA甲基化是可以被重编程的,所检测的CpG岛可能调节Xist基因的表达.结合已发表的实验数据,在同一个体中,FFB来源的克隆囊胚发育率比FOV的低,但其克隆牛胎儿的妊娠率和产犊率比FOV的高,这暗示不同供体核克隆囊胚的重编程是有差异的,并可能影响到胚胎及个体的发育.     

苹果酸降解相关基因在酿酒酵母中的表达

微生物降酸是现代葡萄酒酿造重要工艺。将裂殖酵母苹果酸通透酶基因(mae1)和苹果酸酶基因(mae2)克隆到酿酒酵母中,构建了苹果酸酒精酵母;将mae1基因和乳酸乳球菌的苹果酸乳酸酶基因(mleS)克隆到酿酒酵母中,构建了苹果酸乳酸酵母。构建的酵母重组子能够有效地分解发酵基质中的苹果酸。     

中国栽培大豆“中油83—14”11S种子贮存蛋白基因的分子克隆

利用植物cosmid载体PEND4K,以国内高蛋白栽培大豆“中油83—14”为材料,构建了含30Kb以上DNA片段的基因文库．用野豌豆(Vicia faba)豆球蛋白基因的克隆为探针,对构建的cosmid文库进行杂交发现野豌豆豆球蛋白基因与“中油83—14”大豆的基因组克隆(genomic clones)有杂交,说明两者之间有同源性,杂交强度不同,并且这些克隆的酶谱不同;说明这些克隆为豆球蛋白基因组分．大豆球蛋白基因的分子克隆为高表达的大豆球蛋白基因的利用提供了基础,是作物遗传工程改良的主要一步．     

以绵羊MHC区段BAC克隆酶切片段为探针杂交筛选绵羊混合组织cDNA文库

在已知中国美利奴羊MHC(Major histocompatibility complex)区段BAC(Bacterial artificial chromosome)克隆序列信息和预测的基因注释前提下,用位于中国美利奴羊基因组BAC文库MHC区段的6个BAC克隆酶切片段为探针,以噬菌斑原位杂交筛选法筛选中国美利奴羊混合组织cDNA文库(库库杂交),对分离到的cDNA阳性克隆进行全序列测定,并与相应的已知序列信息和基因注释的BAC克隆比对以及在NCBI Blastn数据库中序列相似性检索,旨在验证基因注释结果的准确性和对基因(序列)功能的初步分析。实验中,经过两轮杂交共筛选出27个cDNA阳性克隆(序列),并发现这些序列均可定位到相应的BAC克隆上,且25条序列处在注释基因的外显子部分;在NCBI数据库中经Blastn序列相似性检索发现,23条序列与牛基因的序列相似性最高,且与免疫功能密切相关。     

噬菌体Ψ297切除酶(xis)基因的克隆和序列分析

目的：克隆噬菌体ψ297切除酶(xis)基因,并对其进行遗传与变异研究。方法：提取埃希氏大肠杆菌O157：H7菌株EH297染色体DNA,采用步移PCR方法寻找目的基因,并通过克隆、亚克隆、DNA测序等分子生物学方法获得切除酶基因,通过序列分析软件对此基因进行分析。结果：克隆获得噬菌体ψ97编码的切除酶基因(xis)的完整序列,它的长度是255bp,编码了一个84个氨基酸组成的蛋白质(xis),将它们的序列与λ噬菌体的切除酶家族的其它成员进行了比较。其结果是噬菌体ψ297的切除酶基因(xis)与噬菌体VT1-Sakai的切除酶基因(xis)只有4个核苷酸的不同,而Xis蛋白与噬菌体VT1-Sakai的Xis蛋白是一样的,与噬菌体933W的Xis蛋白只有47．2％的相似性。结论：噬菌体ψ297编码的切除酶基因(xis)与λ噬菌体的切除酶基因同源。     

禽网状内皮组织增殖病病毒LTR序列的启动子功能

通过PCR方法,将禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)的长末端重复序列(LTR)扩增并克隆进pUC-18质粒多克隆位点(MCS)的EcoR I和Sac I之间,并以BGH基因的多聚腺苷酸序列作为终止子克隆到SphI~HindIII之间,构建成重组质粒pUC-LTR。将GFP基因和REV囊膜糖蛋白gp90基因分别克隆到pUC-LTR载体中,获得质粒pUC-LTR-GFP和质粒pUC-LTR-gp90。重组质粒经转染48h,能够检测到外源基因的表达。本研究提示,REVLTR能够作为启动子构建表达质粒。     

米根霉糖化酶、类芽孢杆菌木聚糖酶融合蛋白的真核分泌表达

以米根霉(Rhizopus oryzae)3.866基因组DNA为模板,克隆得到糖化酶基因(glucoamylase gene, amyA),基因全长2 049 bp,编码604个氨基酸;以类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)H10-3基因组DNA为模板,克隆出基因木聚糖酶基因(xylanase A gene, xynA)的成熟肽编码序列,长636 bp,编码211个氨基酸。通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)得到拼接片段amyA-l-xynA,并将其克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9中,得到重组质粒pPIC9-amyA-l-xynA,重组质粒线性化后经电击转化到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,得到了表达成功的工程菌AX11。在AX11发酵上清液中同时检测到糖化酶活性(5.8 U/mL)和木聚糖酶活性(32.3 U/mL)。