化学修饰的siRNA首次成功用于降低动物总胆固醇

RNA干扰(RNAinterference,RNAi)诱导的基因沉默具有高效性和特异性,具有很好的基因药物开发前景,但体内普遍存在的核酸酶会迅速降解外源性RNA,限制了基于RNAi的药物开发。近期,Alnylam公司的Soutschek等将针对apoB基因的siRNA尾部连接胆固醇分子(chol siRNA),大大延长了siRNA在     

siRNA抑制HIV-1基因表达的研究

RNA干扰(RNAinterfering,RNAi)现象是动植物体内的一种序列特异性的、转录后基因沉默的过程.在哺乳动物细胞中,19～25个核苷酸长短的双链siRNA(smallinterferingRNA)可有效地抑制基因表达.利用pBS/H1SP载体,它表达的双链RNA的转录产物可以用来抑制特异性HIV-1基因的表达.在siRNA实验中,为了比较由H1启动子转录的siRNA在细胞内的作用,使用以绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因的载体——pEGFP-C1质粒,在荧光显微镜下,很容易地看到EGFP在细胞中表达.将HIV-1siRNA表达载体与表达相应EGFP-HIV融合基因的质粒,共转染人胚肾293细胞,结果表明,和对照质控载体相比,转染了pHIV-siRNA质粒的细胞中EGFP-HIV的表达得到显著抑制.通过该途径,筛选出能抑制HIV-1基因表达的有效siRNA.此外,还在同一载体上表达两种或三种siRNA,分别针对不同的HIV基因,获得了良好的抑制效果.     

单链抗体靶向递送系统在RNA干扰中的应用

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种由干扰小RNA(small interfering RNA,siRNA)介导的转录后基因沉默.随着医学的发展,通过RNAi来抑制靶基因的表达已经成为一种强有力的研究基因功能、验证药物靶标和治疗多种疾病的方法.然而,RNAi在哺乳动物中的治疗应用却受到基因递送系统的限制,即siRNA在体内递送的靶向性.目前,各种配体,如糖基化分子、肽类、蛋白质、抗体和基因工程抗体片段对于靶向递送siRNA具有巨大的应用潜力.它们改善了基因递送系统的有效性、特异性和安全性.本文主要就单链抗体-鱼精蛋白截短体融合蛋白在 RNAi中的应用进行综述.     

H1启动子siRNA载体的构建及应用

利用双链RNA(dsRNA)调控基因表达已经成为研究基因功能的有力工具。用人H1启动子构建了pBS／H1PS小干扰RNA(siRNA)表达载体,用于在哺乳动物细胞中产生特异性dsRNA转录产物。通过对293细胞中的PSMA7分子进行表达抑制,证明该siRNA载体能够有效产生针对靶基因的RNA干扰(RNAi)效应。     

人eya2基因小干扰RNA表达载体的构建及表达

目的：设计并构建人eya2（eyes absent2）基因小干扰RNA（siRNA）的真核表达载体,并观察其沉默效果。方法：以人eya2为靶基因,以pSliencer2．1-U6 neo质粒为载体,根据人eya2的cDNA序列,设计含有小发卡结构的2条寡核苷酸序列,将其克隆到siRNA表达载体上;转化大肠杆菌DH5Ⅸ菌株,抽提质粒,测序分析;将重组质粒转染人胚肾293T细胞,通过荧光分析、Westemblot和转录活性实验检测其抑制效果。结果：重组体测序结果与目的序列相一致,证明构建了eya2 siRNA真核表达载体;荧光观察表明siRNA能显著减弱细胞中绿色荧光强度,抑制eya2基因表达;Westemblot分析证明构建的siRNA能有效抑制外源性及内源性eya2基因表达;转录活性测定表明,构建的siRNA能有效抑制eya2基因表达。结论：构建了eya2 siRNA真核表达载体,该siRNA能有效地抑制eya2基因表达。     

干扰RNA的非靶免疫副作用及其siRNA序列设计与化学修饰

siRNA介导的RNA干扰技术已经成为基因功能研究和开展疾病治疗的有用工具.近年发现,siRNA在哺乳动物体内可激活天然免疫系统,诱导干扰素等炎症因子的分泌,并且可非特异性抑制某些非靶基因的表达,有可能极大限制RNA干扰技术的应用.进行高效特异性siRNA的设计和修饰,以保持或者增强siRNA的特异性靶基因沉默作用,又消除siRNA对机体的非靶免疫副作用,成为使siRNA安全有效应用于临床治疗的关键.     

小干扰RNA对庚型肝炎病毒基因在人Huh-7细胞中表达的抑制作用

RNA干扰(RNAi)是由小干扰RNA(siRNA)引发的生物细胞内同源基因的转录后基因沉默现象, 是近年来兴起的一项研究生物基因调控与功能的崭新技术. 庚型肝炎病毒(HGV)是一单正链RNA病毒, 复制时不与宿主细胞基因组整合, 尤其适合用于RNAi的研究. 构建了含HGV完整结构基因并携带筛选标志潮霉素基因的真核表达载体pVAX.EH, 转染Huh-7细胞后, 筛选获得稳定表达HGV 结构蛋白的Huh-7细胞株(Huh-7-EH). RT-PCR和Western blot检测证实, HGV结构基因能在Huh-7-EH细胞中转录、表达, 并能进行剪切和翻译后修饰. 以体外转录法制备了2对靶向HGV E2基因的siRNA(1-E2 siRNA和2-E2 siRNA), 将其导入Huh-7-EH细胞中, 采用Western blot和克隆形成实验证实, HGV 1-E2 siRNA和2-E2 siRNA均能特异性抑制HGV结 构蛋白的表达, 抑制作用可维持1周以上. 其中2-E2 siRNA的抑制作用更强, 转染后对Huh-7-EH细胞潮霉素抗性克隆形成的抑制率达到了99%. Huh-7-EH细胞转染siRNA后对潮霉素敏感, 说 明HGV E2 siRNA不仅使HGV E2区的mRNA降解, 还可使融合在HGV E2区下游的潮霉素mRNA降解. 综上所述, 本实验建立的稳定表达HGV结构蛋白的Huh-7-EH细胞株, 能作为用于研究HGV复制和RNAi的细胞模型; HGV结构基因区的siRNA可同时抑制HGV结构蛋白及其下游的潮霉素基因的表达, 证明RNAi在真核细胞Huh-7-EH内可能存在放大作用.     

利用载体介导小干扰RNA诱导RSRC1基因沉默

目的：设计并构建人RSRC1基因小干扰RNA（siRNA）的真核表达载体,并观察其沉默效果。方法：以人RSRC1基因的cDNA序列为靶标,设计含有小发卡结构的2条寡核苷酸序列,并将其克隆到siRNA表达载体pSliencer2.1-U6neo上,转化大肠杆菌DH5α菌株,抽提质粒,测序正确后将重组质粒转染人胚肾293T细胞,通过Western blot和荧光分析检测其抑制效果。结果：重组体测序成功后,Western blot分析证明构建的siRNA能有效抑制外源性及内源性RSRC1表达;将siRNA重组质粒和带GFP标签的RSRC1共转染293T细胞,荧光显微镜下GFP的亮度明显减弱。结论：获得了2条人RSRC1siRNA真核表达载体,均能有效地抑制RSRC1基因表达。     

载体表达的siRNA分子对猪圆环病毒2型复制的抑制作用

[目的]寻找一种基于RNA干扰技术的猪圆环病毒2型感染的防控方法.[方法]根据猪圆环病毒2型毒株基因组核苷酸序列,设计了3条特异性小干扰RNA(short interfering RNA,siRNA)分子,其中2条针对猪圆环病毒1型和2型复制酶基因(rep),1条针对猪圆环病毒2型核衣壳蛋白基因(cap),将合成的DNA片段退火形成双链,分别连接到RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen载体鼠源U6启动子下游,转化大肠杆菌得到阳性克隆,测序鉴定后分别命名为Retro-SH1,Retro-SH4,Retro-SH6.用上述质粒转染PCV2感染前、后的Dulac细胞及肌肉注射PCV2感染前、后的BALB/c小鼠,应用实时定量PCR试验评价其对病毒在细胞及小鼠体内复制的抑制作用,免疫组化法检测脾脏中病毒的存在.[结果]感染PCV2前或后转染500 ng Retro-SH1,Retro-SH4,Retro-SH6质粒能有效抑制PCV2在Dulac细胞上的复制,抑制率最高可达99%以上,对10株不同来源的临床分离株在细胞中复制的抑制作用同样明显,且不同毒株间差异不大.动物试验中,肌肉注射10μg上述不同siRNA分子对小鼠体内PCV2的复制有一定的抑制作用,其抑制率在26%至99%之间.[结论]载体表达的siRNA分子可能成为防控猪圆环病毒2型感染的一种新工具.     

RNAi在基因缺陷模型方面的应用

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)分子导入细胞内后,促进与之同源的mRNA发生特异性的降解,从而高效并特异地阻断或抑制相应基因表达活性的现象。RNAi技术现已成为调控基因的表达,阐明细胞的信号通路和研究功能基因组学的有力工具,并迅速在临床医学上展现出基因药物的诱人前景。目前,人们已开始对RNAi技术在人类疾病预防和治疗中的应用进行研究．这些研究涉及到病毒感染、癌症、代谢性疾患以及遗传病等各个方面。通过综述siRNA分子的作用机制、载体构建以及其在基因缺陷模型的建立等方面的应用,从而展示出RNAi在相关疾病的分子机制研究和基因治疗方面的诱人前景。     

RNAi靶向VP2基因抑制中蜂囊状幼虫病毒在中华蜜蜂幼虫体内复制研究

中蜂囊状幼虫病(Chinese sacbrood disease,CSBD)是造成中华蜜蜂患病死亡的主要原因之一,目前尚无有效的治疗方法。为了研究靶向中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)结构蛋白VP2基因的siRNA介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)作用和其对CSBV在中华蜜蜂幼虫体内复制的影响,设计合成针对CSBV VP2基因的特异性siRNA,以100 nM的浓度与pEGFPN1-VP2-CSBV融合表达载体共同转染至293T细胞中,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察和分析siRNA在体外对CSBV VP2基因表达的干扰效果。同时,将siRNA(1μg/μL)和1×10~7拷贝数的CSBV共同饲喂2日龄中华蜜蜂幼虫,检测幼虫体内CSBV拷贝数和幼虫存活率,研究siR-NA对中华蜜蜂幼虫体内CSBV复制的影响。荧光结果显示,在293T细胞中siRNA能抑制CSBV VP2蛋白的表达,并且通过流式细胞仪检测分析发现干扰效果接近40%。幼虫饲喂实验表明,饲喂siRNA组在各时间点幼虫体内CSBV拷贝数均低于CSBV对照组,且在摄入siRNA后感染CSBV的幼虫存活率明显上升,与CSBV组差异极显著(P<0.01)。通过本研究,证明了针对CSBV结构蛋白VP2基因的特异性siRNA能够介导产生RNAi,影响CSBV在中蜂体内的复制,为深入研究CSBV VP2基因的功能和研发抗CSBV生物制剂提供了理论基础。     

利用RNA干扰抑制人肝癌细胞中核因子-kB p65基因的表达

目的:用小干扰RNA(siRNA)抑制核因子-KB(NF-kB)p65基因在人肝细胞癌细胞中的表达.方法:从p65的cDNA序列中挑选3个RNA干扰靶位点,用体外转录法制备siRNA,以萤光素酶基因的siRNA为对照,分别转染Hep3B和SMMC-7721细胞,用逆转录半定量PCR和免疫印迹检测siRNA对p65基因表达的抑制效率.结果:3条siRNA对p65基因的表达都有抑制作用,其中2条siRNA的抑制作用更为显著,最高抑制效率约为70%.结论:制备的p65-siRNA可用于研究NF-KB在肝细胞癌发生发展中的作用.     

多靶向RNA干扰技术在基因治疗中的应用与前景

RNA干扰(RNA interference,RNAi)通过转录后基因沉默效应特异性抑制靶基因的表达,其沉默机制的高效性、特异性及稳定性使这项技术成为生物医学领域研究基因治疗的重要工具。阐述RNAi技术的特点和RNAi疗法的现状,特别是多靶小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)目前的发展态势及其各种结构性修饰,通过使用这些结构修饰的siRNA提高基因沉默的效率,将有助于提高疗效。但该技术在广泛应用于临床之前,仍存在一些亟待解决的问题与面临的挑战,需进一步研究。     

RNA干涉与干细胞

RNA干涉(RNAi)现象普遍存在于生物体细胞中,在理论上已清楚其分子机制,为干细胞研究提供了新的方法。现从RNAi的分子机制、干细胞中的RNAi现象、研究干细胞RNAi效应的方法以及小分子干涉RNA(siRNA)干涉干细胞特异功能基因的检测方法等方面进行了综述。表明应用RNAi技术研究基因功能和干细胞维持及定向分化的调控具有广阔的发展前景。     

应用载体介导的RNAi技术抑制HCMV的UL49基因表达

为了研究RNA干涉抑制HCMV UL49基因的作用,以pLXSN(U6启动子)为模板通过两步PCR的方法扩增含U6启动子的siRNA表达片段,并通过TA克隆将siRNA表达片段克隆到pMD18-T载体构建成siRNA表达质粒,同时以人巨细胞病毒AD169病毒株基因组为模板PCR扩增UL49基因,将其克隆到pEGFP-N1构建融合质粒pEGFP-UL49。通过脂质体介导将siRNA表达质粒和pEGFP-UL49质粒共转染人宫颈癌细胞系HeLa,在荧光显微镜下观察RNA干涉结果。通过这种方法得到具有介导RNA干涉的siRNA片段,为UL49基因沉默研究提供技术基础。     

p300基因小干扰RNA慢病毒载体的构建及其对乳腺癌ZR75-1细胞的影响

目的:构建p300基因的小干扰RNA(siRNA)慢病毒表达载体,检测其对p300蛋白表达的干扰,以及对乳腺癌细胞ZR75-1生长的影响。方法:利用RNA干扰(RNAi)技术设计并合成针对p300基因的siRNA,并将其克隆到siRNA表达载体pSIH-H1上,经酶切和测序验证,用293T人胚肾细胞包装p300 siRNA慢病毒,感染乳腺癌细胞ZR75-1,建立敲低p300表达的稳定细胞株,通过实时定量PCR和Western印迹检验RNAi的干扰效果,利用细胞生长实验检测p300 siRNA对ZR75-1细胞生长的影响。结果:酶切和测序证明构建了p300 siRNA真核表达载体;实时定量PCR和Western印迹证明构建的siRNA能有效抑制p300基因的表达,并建立了敲低p300表达的稳定细胞株;细胞生长实验证实p300 siRNA可有效促进ZR75-1细胞的生长。结论:构建了p300基因的siRNA真核表达载体,转染细胞后能有效抑制p300基因的表达,且能促进ZR75-1细胞的生长,表明构建的p300 siRNA具有功能。     

小干扰RNA靶向VEGF基因体内外抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖

 血管生成与肿瘤生长、侵袭、转移密切相关.血管内皮生长因子能特异地促进内皮细胞分裂、增殖及迁移,在肿瘤新生血管生成过程中起着至关重要的作用.通过RNAi抑制VEGF表达的抗血管生成疗法可有效应用于肿瘤治疗.本研究采用化学修饰的siRNA在体内外抑制VEGF基因表达,探讨化学修饰的siRNA介导的RNA干扰技术在乳腺癌基因治疗的可行性和特异性.选用阳离子脂质体Lipofectamine^TM2000作为转染试剂,将针对人VEGF基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染人类乳腺细胞株MCF-7和裸鼠移植瘤,在体内外诱导RNAi.采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),蛋白印迹实验等检测siRNA治疗组和对照组VEGF基因表达及细胞增殖变化.体外实验结果显示：靶向VEGF基因siRNA转染乳腺癌MCF-7细胞后,细胞生长抑制率达52.5%;VEGF的mRNA和蛋白表达水平显著降低（P<0.01）;裸鼠体内实验结果显示：siRNA治疗组瘤组织的增长受到明显抑制;RT-PCR结果同时表明治疗组VEGF表达下调.体内外对照组各指标无显著变化.化学修饰的siRNA介导的RNAi在体内外均能成功下调靶基因VEGF的表达,抑制MCF-7细胞增殖,是潜在的肿瘤治疗新方法.     

小鼠胚胎Sry基因的RNA干涉研究

为了研究Sry基因的调控网络,采用siRNA技术使Sry基因沉默,探讨了有效沉默Sry基因的途径和最佳条件.设计、合成针对小鼠Sry基因的发夹状寡核苷酸链,退火后连入真核表达载体pSilencer4.1-CMVneovector,构建以小鼠Sry基因为靶点的siRNA干涉载体pSilencer4.1/Sry217及pSilencer4.1/Sry565,通过尾静脉注射法将载体质粒导入妊娠小鼠体内,于小鼠妊娠第11.5天,即11.5dpc(dayspostcoitum,性交后天数)取出胚胎,采用双重PCR法对胚胎进行性别鉴定,鉴定为雄性的胚胎采用半定量RT-PCR法检测Sry基因的表达量,研究不同干扰序列、不同注射时间及注射剂量对Sry基因表达量的影响.研究结果,确定了质粒的最佳注射时间为9.5dpc,注射剂量为20μg,注射干扰质粒pSilencer4.1/Sry565对Sry基因的抑制效率达85%左右.结果表明,siRNA可以显著抑制雄性胚胎Sry基因的表达.     

shRNA抑制人卵巢癌SW626细胞CXCR4基因的研究

探讨应用RNA干扰技术沉默趋化因子受体4(CXCR4)基因的表达,研究其对人卵巢癌SW626细胞增殖的抑制作用。设计合成两对特异性针对CXCR4基因的Oligo siRNA,用脂质体转染法转染至SW626细胞中,荧光共聚焦显微镜检测转染效率,采用Western blotting检测CXCR4蛋白表达情况,同时利用M'IT试验检测转染后细胞增殖抑制情况。结果显示,转染Oligo siRNA后,SW626细胞CXCR4蛋白表达水平降低(P0.05);细胞增殖的抑制率明显增高(P0.05)。体外合成的特异性针对CXCR4基因的Oligo siRNA对卵巢癌细胞株SW626中CXCR4基因表达和细胞增殖均有明显抑制作用。     

RNA干涉分子机制研究进展

RNA干涉（RNA interference,RNAi）是生物体内的一种通过双链RNA(dsRNA)来抵抗病毒入侵和抑制转座子活动的自然机制.双链RNA与同源mRNA互补结合而使特定基因失活,这一过程已经在包括拟南芥、线虫和真菌等多种模式生物中得到揭示.近来研究表明,21～25 nt的小干涉RNA（small interference RNA, siRNA）可介导哺乳动物细胞特异性基因沉默.RNAi具有高效性和高度特异性,可能成为关闭基因的新技术而在基因功能研究和疾病基因治疗中发挥重要作用.