亲和标签在重组蛋白表达与纯化中的应用

亲和标签融合技术为重组蛋白的纯化提供了一种简单方便的纯化工具,具有结合特异性高、洗脱条件温和、通用性强、纯化倍数高等显著优点。概述了亲和标签对融合蛋白表达的影响,可以提高重组蛋白的产量,增强重组蛋白的可溶性,促进重组蛋白的正确折叠;回顾了在重组蛋白表达与纯化中广泛使用的几种亲和标签,以及近年来相继出现的几种比较新颖的纯化标签;介绍了亲和标签的组合使用策略,His6-MBP组合标签集合了两个标签的优点,串联亲和纯化可以纯化获得生理条件下的蛋白质复合体;展望了亲和标签未来的发展趋势,认为仍需继续开发性能更加优越、纯化效果更加显著的纯化标签系统。     

类弹性蛋白标签在重组蛋白分离纯化中的应用

类弹性蛋白(elastin-like polypeptide,ELP)是一种非常有前途的重组蛋白分离纯化标签.这种人工合成的蛋白质多肽是由五肽重复序列单元(VPGXG)串联组成,具有温度诱导的可逆相变特性.ELP与目的蛋白融合后,赋予重组蛋白相类似的可逆相变性质.多次可逆相变循环(inverse transition cycling,ITC)之后,就可以从蛋白溶液混合液中选择性地分离出ELP融合蛋白,再经特异性酶切或者改变环境条件引发内含肽发生自我剪切去除ELP标签,从而得到单一的目的蛋白,实现简单快速分离纯化重组蛋白.目前,该技术已成功应用于原核大肠杆菌和植物表达系统中.大肠杆菌表达ELP-绿色荧光融合蛋白的最高产量可达1.6 g/L.这种非色谱分离纯化重组蛋白的方法具有技术简单、操作快速、成本低、易于扩大等优点.重点从该技术的原理、技术路线以及发展方向进行综述.     

利用蛋白标签纯化酿酒酵母RAVE-V_1复合物

RAVE(regulator of the H+-ATPase of the vacuolar and endosomal membranes)是调节液泡ATP酶(V-ATP酶)装配与拆卸过程的调节酶,由Rav1p、Rav2p和Skp1p 3个亚基构成。在酿酒酵母细胞中,当葡萄糖耗尽时,V-ATP酶分解成V1、V0两部分,此时,RAVE与V1以复合物的形式存在于细胞质中。本研究利用同源重组技术,构建在基因RAV2的3'端定点插入FLAG标签的重组菌株BY4742 RAV2-FLAG,通过亲和层析原理纯化RAVE-V1复合物,为后续利用电子显微镜对其进行三维结构研究奠定坚实的基础。结果表明:FLAG标签添加到Rav2p的C端可以成功纯化出RAVE-V1复合物;结合质谱鉴定首次发现了Leu1p与RAVE存在相互作用关系,这使得对RAVE的研究转向一个全新的方向;此外,本研究方案对其他调节蛋白及与之相互作用的蛋白组的分离纯化具有借鉴意义。     

重组蛋白质亲和标签的选择与串联亲和纯化的应用进展

重组蛋白质技术作为蛋白质研究的重要手段之一,在生物化学与生物物理学研究领域,扮演着极其重要的角色.亲和纯化作为最为方便与快捷的重组蛋白质纯化手段,日益得到广泛的应用.由于各种亲和标签,纯化介质层出不穷,性质各异.应根据自身研究对象具体情况选择合适的亲和纯化标签.近年双亲和标签进行串联亲和纯化日益成为蛋白质相互作用研究的重要方法.多种亲和标签的搭配已得到成功应用,部分已进入商业化,并在各种模式生物中得到广泛的应用,本文就重组蛋白质亲和标签的选择与串联亲和纯化作一综述.     

多聚组氨酸融合标签在蛋白药物开发中的应用

纯化技术是制约蛋白质药物开发及其产业化的关键技术之一。构建多聚组氨酸标签融合蛋白,采用固定金属离子亲和层析进行纯化,是一种高效的蛋白质纯化策略。介绍多聚组氨酸融合标签在蛋白质药物开发中的应用基础和应用概况,分析多聚组氨酸标签在融合蛋白中的位置对亲和层析纯化的影响,总结常用的多聚组氨酸融合表达方式,并对其融合表达样品的预处理、亲和层析纯化条件及其对目的蛋白药物药用安全性和有效性的影响进行探讨。     

重组蛋白质纯化技术

90年代以来 ,基因重组技术得到很大的发展 ,基因工程产品的分离纯化的成本约占其全部成本的 6 0 %～ 80 %,因此重组蛋白的分离纯化技术越来越重要。着重介绍了扩张柱床吸附层析技术 ,径向膜层析技术 ,灌注层析技术 ,液液萃取技术 ,置换层析技术和金属螯合亲和层析技术近年来进展情况以及它们的优缺点和应用范围。     

重组人蛋白C的研究进展

人蛋白C具有抗凝,促纤维蛋白溶解和潜在的抗炎作用,本在简要介绍了人蛋白C的结构,功能的基础上,重点对哺乳动物细胞和转基因动物表达重组人蛋白C的研究进展作了综述。     

FLAG融合短肽在重组蛋白质纯化中的应用

FLAG融合标签由八个氨基酸组成(AspTyrLysAspAspAspAspLys),专门设计用于重组蛋白质的免疫吸附纯化。现已发展出了多个针对该短肽的抗体,包括M1、M2和M5单克隆抗体。FLAG标签与融合的重组蛋白质之间一般含有一个肠激酶切割位点,可以用肠激酶切割除去。FLAG融合标签技术具有简单、快速进行定量检测的优点,在重组蛋白质的分离纯化中应用广泛。     

利用小肽控制的基于蛋白质内含子非层析标签制备重组蛋白(英文)

基于蛋白质内含子的蛋白质纯化自我断裂标签已经被广泛使用超过15年之久.但这一系统体内表达过程的提前断裂一直是限制这一技术广泛应用的瓶颈,特别是在需要高温表达和长表达周期的真核表达系统中.本研究介绍了一种利用小肽控制的基于蛋白质内含子和非层析标签ELP(elastin-like polypeptide)的自我断裂系统.在这一系统中,蛋白质内含子的体内外活性严格受到其结构互补小肽控制.在体内表达不含有互补小肽时,蛋白质内含子不具有活性;而在体外添加结构互补小肽,蛋白质内含子结构恢复并发生C端断裂反应释放目的蛋白.由于非层析标签ELP的引入,因此整个纯化过程可以简单地通过几步机械沉淀完成.此外,这一系统反应pH、小肽与前体蛋白之间的摩尔比及断裂速率也一并进行了系统的研究.     

转基因植物生产重组药物蛋白的研究进展

转基因植物作为一种新型生物反应器,可以安全、经济、有效的生产各种重组蛋白,以此作为大规模的重组药物生产平台备受瞩目。但是表达量低、下游处理复杂、糖基化结构改变是植物反应器中经常遇到的困难,这些困难限制了植物表达重组药物蛋白的商业化发展。针对这些问题,人们分别采用不同的生物技术策略加以解决,对此做一简要综述。     

聚乙二醇化重组蛋白药物的质量控制

重组蛋白经聚乙二醇(PEG)化修饰在优化药物代谢动力学和药效学性质的同时,使药物的结构和质量属性变得更为复杂,修饰后的重组蛋白在结构、理化性质和生物学活性等方面与未修饰的重组蛋白相比有较大差异,对其质量控制的研究必须结合品种自身独特的质量属性。现从蛋白质药物质量控制的角度,对PEG化蛋白质药物的重要质量属性的质控难点和相应检测方法进行综述,以期对工艺开发和生产上的实际工作有所帮助。     

重组水蛭素的纯化和鉴定

本文报导了化学合成的水蛭素基因在酵母细胞中得到表达,井能分泌水蛭素到胞外。将该菌株培养物的上清液经硫酸铵沉淀和Sephadex G-50过滤后,用DEAE-SephadexA-25进行阴离子交换层析,进而用HPLC反相层析,得到表达产物重组水蛭素。经SDS-PAGE,氨基酸序列分析,抗凝血酶活力分析及血浆滴定实验等方法鉴定,证明该基因表达产物与天然水蛭素HV_2相同。     

影响农杆菌渗入法瞬间表达重组蛋白系统的若干因素

利用农杆菌渗入法(Agroinfiltration)在植物中瞬间表达重组蛋白的系统,具有高效、安全、简便的特点,是一种重要的生产重组蛋白的方法。概述了Agroinfiltration系统的建立、发展及在生产重组蛋白领域的应用进展;并对影响该系统的技术因素作了深入探讨。     

串联亲和标签LOX蛋白慢病毒表达载体的构建及在乳腺癌细胞中的表达

目的:为了研究赖氨酰氧化酶(Lysyl Oxidase,LOX)及其相互作用蛋白质在乳腺癌中的功能,构建带StrepⅡ/FLAG串联亲和标签的重组LOX蛋白慢病毒表达载体并在乳腺癌细胞MDA-MB-231中表达。方法:设计引物通过聚合酶链式反应获得带StrepⅡ/FLAG串联亲和标签的LOX蛋白(LOX-SF)的亲本质粒,双酶切后鉴定测序克隆至GV303表达载体,连同慢病毒包装质粒共同转染293T得到GV303/LOX-SF慢病毒,将其转染MDA-MB-231细胞,使用荧光定量PCR和蛋白质印迹实验对细胞中重组蛋白LOX-SF进行检测。结果:通过串联亲和纯化获得LOX-SF重组蛋白,使用标签抗体成功鉴定到LOX-SF重组蛋白在MDA-MB-231细胞内稳定表达。结论:GV303/LOX-SF的构建,使带StrepⅡ/FLAG融合标签的LOX蛋白在MDA-MB-231中成功表达及纯化,为筛选和研究LOX及其相互作用蛋白在乳腺癌细胞内的功能奠定了实验基础。     

二硫键异构酶的纯化及其对重组蛋白体外折叠的影响

自牛肝中纯化了蛋白二硫键异构酶(PDI),并对重组蛋白的酶促折叠过程进行了探讨．结果表明。在等摩尔PDl的催化作用下,可使1mg／ml的IIJ-2的正确折叠率提高到58%以上,比活性由4×10⁶u／mg增加到8．2×10⁶u／mg,PDl还能部分纠正二硫键错配的IL-2异构体成为正确折叠的lL-2和防止IL-2通过cys的链问交联形成聚合体。GM-CSF在PDl催化下也有类似的结果。PDl作用的关键是它所催化的琉基一二硫键的交换反应。     

重组B群脑膜炎球菌fHBP融合蛋白的表达和免疫原性研究

采用PCR构建编码B群脑膜炎球菌fHBP蛋白V<,1>变异型全长序列和V<,2>变异型C结构域抗原表位融合蛋白的基因片段.并克隆入pET30a<'(+)>载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),在其实现表达,表达量约占菌体蛋白总量的30%.表达产物经离子交换层析纯化后,获得了纯度达到90%以上的融合蛋白.将融合蛋白免疫小...     

重组蛋白在中国仓鼠卵巢细胞中高效表达的影响因素

高效表达重组蛋白 ,对于生物制药意义重大。大多数药用蛋白是糖蛋白 ,中国仓鼠卵巢细胞 (Chinesehamsterovarycell,CHO)是目前重组糖基蛋白生产的首选体系。影响外源蛋白在CHO细胞中表达的因素很多 ,从CHO细胞表达体系、表达载体系统、外源基因、表达细胞株的加压扩增与筛选、细胞大规模培养等方面对CHO高效表达加以阐述 ,同时提出存在的问题和未来的发展方向。