猪型布鲁氏菌rOmp3148-74-BLS融合肽的诱导表达与纯化

目的:为了研究布鲁氏菌Omp31分子的抗原性质,以及布鲁氏菌BLS蛋白质的聚合功能,通过融合PCR技术,制备布鲁氏菌Omp3148-74与BLS的融合蛋白质,并且进行蛋白质的纯化。方法:以猪型布鲁氏菌Omp31基因和BLS基因作为研究对象,通过融合PCR技术构建重组表达载体,IPTG诱导融合蛋白质表达之后,利用His-tag亲和层析柱进行亲和纯化。结果:Omp3148-74-BLS融合DNA长度为531 bp,编码177个氨基酸;加上原核表达载体上的His-tag标签,融合蛋白质的实际大小为25.07 kD,实验结果证实表达载体构建正确,重组表达正确。结论:通过融合PCR技术构建的重组子pET-28-a-Omp3148-74-BLS,可以在大肠杆菌中成功表达;His-tag亲和层析技术可以纯化到Omp3148-74-BLS融合蛋白,而且蛋白质纯度较高。     

布鲁氏菌rOmp31_(48-74)-BLS重组载体的构建与苜蓿的转化

将布鲁氏菌rOmp3148-74-BLS基因转入紫花苜蓿中苜一号,最终获得转基因苜蓿。本试验利用不依赖于连接反应的克隆(Ligation-Independent Cloning,LIC)方法将布鲁氏菌rOmp3148-74-BLS基因克隆到植物表达载体pJG045上,并利用三亲本杂交的方法转化农杆菌AGL0。最后通过农杆菌介导法将该基因转化紫花苜蓿中苜一号。经PCR鉴定,筛选出转基因苜蓿植株。本试验为今后布鲁氏菌转基因植物疫苗的研发奠定了理论和实验基础。     

布菌Omp31-BLS融合肽抗血清的免疫学性质研究

目的:检测Omp31-BLS融合肽抗血清的质量。方法:利用间接酶联免疫吸附实验、免疫双扩散实验以及凝集实验检测Omp31-BLS融合肽制备的抗血清的质量。结果:Omp31-BLS融合肽抗血清可以较好地识别Omp31-BLS融合肽蛋白质,而且,当抗体被稀释4 000倍的时候,酶联免疫吸附实验测定的OD值为1.2,明显高于其他3个对照组。在免疫双扩散实验中,抗血清被稀释64倍的时候,仍然能够出现明显的免疫沉淀线。此外,凝集实验也反映出Omp31-BLS融合肽抗血清可以与Omp31-BLS融合肽抗原发生强烈的凝集作用。结论:Omp31-BLS融合肽抗血清可以较好地识别对应的蛋白质抗原,二者之间存在明显的抗原-抗体反应,为利用Omp31-BLS融合肽进行布鲁氏菌病的血清学诊断提供了理论基础和技术支持。     

拟南芥转录因子DYT1的原核表达与多克隆抗体制备

以拟南芥雄性不育突变体ms157为材料,对其转录因子DYT1的原核表达进行了分析及多克隆抗体的制备.结果表明:构建的原核表达载体转化入BL21菌株后,经IPTG诱导,表达了分子量约为50 kD的重组蛋白.SDS-PAGE检测结果表明,该重组表达蛋白以可融性形式表达.用该蛋白作为抗原注射新西兰兔后,成功获取了多克隆抗体.Western blotting证实其具良好的免疫原性,ELISA结果表明融合蛋白的效价大于1:5 120.     

H3N2亚型猪流感病毒M1基因克隆及表达特性分析

从H3N2亚型猪流感病毒感染的鸡胚尿囊液中提取病毒基因组RNA,采用RT-PCR方法克隆M1全长基因,将M1基因亚克隆至pET-28a(+)表达载体中,构建重组表达质粒pET-28a-M1,将该重组质粒转化大肠杆菌BL21并经IPTG诱导表达。诱导产物经SDS-PAGE电泳分析显示重组蛋白M1获得大量表达,表达蛋白纯化后免疫Wistar大鼠制备多克隆抗体。Westernblotting检测结果表明制备的抗M1蛋白多克隆抗体可以识别大肠杆菌表达的M1蛋白和病毒感染细胞的病毒M1蛋白。构建M1基因真核重组质粒p3xFLAG-CMV-7.1-M1并转染Vero细胞,Western blotting检测表明抗M1蛋白多克隆抗体可以识别在Vero细胞中得到表达的M1蛋白,成功建立M1基因的真核表达系统。分析了病毒感染过程中M1蛋白的变化及其作为病毒复制指示分子的可能性。鼠源M1蛋白多克隆抗体的制备和M1基因真核重组表达质粒的构建,为进一步研究猪流感病毒的复制机理以及M1蛋白在病毒复制过程中的生物学功能奠定了基础。     

沙门菌毒力基因spvB的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的:构建沙门菌毒力基因spvB的原核表达载体,诱导表达纯化SpvB蛋白并以其为抗原免疫小鼠,制备多克隆抗体。方法:利用生物信息学软件对SpvB进行分析,选取抗原性较高、易表达的氨基酸序列作为克隆序列,以携带spvB基因的鼠伤寒沙门菌为模板,PCR扩增目的片段后与原核表达载体pET28a(+)连接;将质粒pET28a-SpvB转化大肠埃希菌BL21(DE3)后诱导表达并纯化。目的蛋白免疫小鼠,制备抗SpvB多克隆抗体,Western blot检测抗体特异性。结果:成功构建spvB原核表达载体,经IPTG诱导结果显示,重组蛋白表达且主要存在于包涵体中,将纯化后的蛋白免疫小鼠Western blot检测血清中抗体与SpvB特异性结合。结论:获得具有免疫原性的SpvB蛋白及其多克隆抗体,为进一步研究该基因的功能奠定基础。     

真核细胞表达单纯疱疹病毒Ⅰ型包膜糖蛋白B及其抗原性与免疫原性分析

为在真核细胞中表达并纯化I型单纯疱疹病毒(HSV I)包膜糖蛋白gB,并分析其抗原性和免疫原性,化学合成了包膜糖蛋白gB1胞外区基因片段,构建真核表达载体,并转染至HEK293细胞,表达的蛋白用羊抗HSV1+HSV2血清作为一抗,用ELISA检测其抗原性;用纯化的gB1蛋白免疫昆明小鼠,观察诱发抗体产生的时间及其效价,并用ELISA和Western blot检测小鼠抗gB1多克隆抗体特异性识别重组gB1抗原的能力,评价其免疫原性。结果显示在HEK293细胞中成功表达重组gB1蛋白,ELISA证实羊抗HSV1+HSV2多抗能够识别重组gB1蛋白;重组gB1蛋白免疫小鼠7周后,小鼠血清中多克隆抗体效价达到5×103,表明在真核细胞中高效表达并纯化的重组gB1蛋白具有良好的抗原性和免疫原性,为HSV检测试剂和疫苗研究提供了理论基础。     

大肠埃希菌外膜蛋白OmpC的原核表达与免疫保护作用研究

Omp C蛋白为大肠埃希菌主要外膜蛋白,具有提高宿主免疫能力的作用,在疫苗上有很好的应用前景。通过分子克隆获得Omp C蛋白的表达菌株;Western-blotting法证实Omp C抗体可与表达的重组蛋白很好的结合。利用切胶纯化获得Omp C蛋白,免疫小鼠产生抗体,然后攻毒大肠埃希菌肠道致病菌,结果显示保护率达到63.64%,与对照相比较具有显著差异。利用正交试验,获得Omp C菌株的最佳表达条件为:诱导时菌液OD600值0.5,IPTG终浓度0.3 mmol/L,诱导时间8 h,温度32℃;最佳培养条件为:葡萄糖浓度0%,转速230 r/min,装液量50 m L。为Omp C工业发酵、蛋白功能与疫苗开发研究奠定了基础。     

小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件的原核表达及多克隆抗体制备

目的:用原核表达的方法获得带有6个His标记的小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件的重组蛋白,并制备其多克隆抗体。方法:利用RT-PCR技术,从小鼠心肌组织中扩增出小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件cDNA片段,将该片段与原核表达载体pET-28a连接,构建重组表达质粒pETLG1-3并转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组表达菌株。用IPTG诱导重组大肠杆菌BL21(DE3)/pETLG1-3表达,SDS-PAGE分析表明在相对分子质量60000处有特异性重组蛋白表达条带,并经Western印迹进一步鉴定。用含融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶颗粒免疫家兔,制备抗小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件多克隆抗体,ELISA方法检测抗体滴度。结果:从小鼠心肌组织中克隆了层粘连蛋白α5链LG3组件的基因,并在大肠杆菌得以表达和纯化;制备了重组蛋白的多克隆抗体,其滴度可达到1∶10240。结论:小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件重组蛋白及其多克隆抗体的获得,为后续研究其功能打下了基础。     

真核细胞表达单纯疱疹病毒I型包膜糖蛋白B及其抗原性与免疫原性分析

为在真核细胞中表达并纯化I型单纯疱疹病毒（HSV I）包膜糖蛋白gB,并分析其抗原性和免疫原性,化学合成了包膜糖蛋白gB1胞外区基因片段,构建真核表达载体,并转染至HEK293细胞,表达的蛋白用羊抗HSV1+HSV2血清作为一抗,用ELISA检测其抗原性;用纯化的gB1蛋白免疫昆明小鼠,观察诱发抗体产生的时间及其效价,并用ELISA和Western blot检测小鼠抗gB1多克隆抗体特异性识别重组gB1抗原的能力,评价其免疫原性。结果显示在HEK293细胞中成功表达重组gB1蛋白,ELISA证实羊抗HSV1+HSV2多抗能够识别重组gB1蛋白;重组gB1蛋白免疫小鼠7周后,小鼠血清中多克隆抗体效价达到5×103,表明在真核细胞中高效表达并纯化的重组gB1蛋白具有良好的抗原性和免疫原性,为HSV检测试剂和疫苗研究提供了理论基础。