减毒沙门氏菌为载体在Vero细胞中表达新城疫病毒融合蛋白

RT PCR扩增了新城疫病毒 (NDV)F4 8E9株的融合蛋白 (F)基因并插入到 pcDNA3的CMV启动子下游 ,构建成真核表达质粒pcDNA3 F ,高压电转化dam和 phoP基因双突变株减毒鼠伤寒沙门氏菌 (ZJ111株 ) ,并直接感染Vero细胞 ,分别提取细胞总DNA和总RNA ,DIG标记探针均可检测到阳性杂交信号。FITC标记的羊抗鸡IgG进行间接免疫荧光试验 ,可检测到特异性的黄绿色荧光。ELISA检测F蛋白结果表明 ,转染后 4 8h开始表达 ,随后逐渐增多。SDS PAGE和Western印迹可检测到 5 5kD的蛋白质条带。上述试验结果证实减毒沙门氏菌不仅可将目的基因呈递给Vero细胞 ,而且还得到了转录和表达 ,表达的F蛋白具有免疫反应性 ,为研制减毒沙门氏菌为载体的口服NDVDNA疫苗创造了条件。     

传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因在家蚕中的表达

将传染性法氏囊病病毒(IBDV)细胞致弱株(JD1株)的基因组A节段基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pAcHLT-C中,获得的重组转移载体pAcHLT-C-A与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕培养细胞,获得重组病毒BacPAK-A。DIG标记的DNA点杂交证实重组病毒基因组中含有A节段基因,重组病毒感染家蚕5龄幼虫进行表达, ELISA和Western blotting等结果表明多聚蛋白基因在蚕体内得到了表达,表达产物具有免疫反应性,表达量在感染后5～6 d达到最高。家蚕生物反应器表达IBDV多聚蛋白具有我国的资源优势,为今后研制低成本、实用化的IBDV基因工程疫苗打下基础。     

免疫刺激复合物(ISCOM)介导的传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因免疫的研究

将传染性法氏囊病病毒（IBDV）ZJ2000株的多聚蛋白（VP2／VP4／VP3）基因插入pCI质粒的CMV启动子下游,构建了真核表达质粒pCI-VP2/VP4/VP3,在Lipofectin介导下转染Vero细胞进行了多聚蛋白的瞬时表达。以免疫刺激复合物（ISCOM）为佐剂制备DNA疫苗,进行不同免疫剂量间、不同免疫途径间、一次免疫和二次免疫间的效果对比试验。结果表明：以肌内和皮内联合免疫法效果最好,而口服和点眼等途径未能诱导足够的免疫反应;大于200μg的剂量DNA疫苗才能产生良好的免疫力;二次免疫的效果明显优于一次免疫。与常规的弱毒疫苗B87和D78相比,DNA疫苗产生中和抗体的潜伏期长、效价相对较低,对强毒攻击的保护率相当。本试验还证实,免疫刺激复合物具有明显提高DNA疫苗免疫效果的作用。DNA疫苗能诱导产生保护性反应,为今后IBD疫苗的研究开创了一条新的途径。     

IBDV多聚蛋白基因真核表达质粒的构建与表达

将IBDV上海超强毒株的多聚蛋白基因(vp2-4-3)克隆入真核表达载体pALTER-MAX,构建成功pALTER-MAX-VP2-4-3真核表达质粒,经纯化后,pALTER-MAX-VP2-4-3在Lipofectamie^TM2000介导下转染Vero细胞、11日龄鸡胚的绒毛尿囊膜(CAM)和肌肉注射2日龄的雏鸡,1周后,分别提取细胞或组织中的总DNA或总RNA,用DIG标记探针均可检测到阳性杂交信号;转染的Vero细胞飞片和肌肉冰冻切片,进行免疫荧光检测均呈现阳性结果;转染的鸡胚CAM匀浆上清,用兔抗IBDV超强毒的高免血清,经Dot—ELISA检测呈现阳性。表明转染后基因获得表达,表达的蛋白具有免疫反应性。     

鸡传染性法氏囊病病毒研究进展

传染性法氏囊病(Infection bursal disease, IBD)是由鸡传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)引起的鸡和火鸡的一种高度接触性传染病,给世界各国的禽养殖业带来了巨大损失。自IBDV发现至今新的变异株不断出现,分子结构的改变导致病毒致病力的改变及宿主对疫苗应答的改变,使得传统的疫苗已不能控制其流行,因此各国学者对其基因组结构和功能进行了广泛深入的研究,并积极研制新型有效的疫苗以达到防治的目的。 1 基因组结构和功能 IBDV基因组由A(3.2kb)、B(2.8kb)两个双链RNA节段构成。A编码形成VP2蛋白(37-40k…     

鸡白细胞介素2增强传染性法氏囊病病毒多聚蛋白DNA疫苗免疫原性的研究

鸡白细胞介素 2(IL-2)基因是新近被确定的非哺乳类IL-2基因。将鸡白细胞介素2(IL-2)基因和传染性法氏囊病病毒 (IBDV)多聚蛋白基因 (VP2/VP4/VP3)分别插入真核表达载体pCI的CMV启动子下游 ,制备DNA疫苗 ,免疫 14日龄SPF鸡 ,14d后二免 ,二免后 3d攻击标准强毒株。结果表明共注射鸡IL 2质粒能明显增强DNA疫苗对强毒攻击 ,保护率达 80 % ;能增强DNA疫苗诱导的中和抗体效价 (P<0.05 ) ;能显著促进鸡胸腺、脾脏和外周血液T淋巴细胞及法氏囊B淋巴细胞增殖反应(P<0.05)。这些结果提示鸡IL 2能明显增强IBDV多聚蛋白DNA疫苗的免疫原性 ,是一种优良的禽类DNA疫苗佐剂。     

传染性法氏囊病病毒弱毒株对Vero细胞的适应性研究

传染性法氏囊病病毒疫苗的传统生产工艺是利用鸡胚纤维细胞增殖ＩＢＤＶ,但易被外源病原污染,且生产成本很高,借鉴国内外流行性乙型脑炎疫苗生产的经验,使用Ｖｅｒｏ细胞增殖ＩＢＤＶ弱毒株,从病毒高峰出现时间、滴度峰值的高低、对细胞代谢的影响等方面研究了ＩＢＤＶ对Ｖｅｒｏ细胞的适应性,敏感性以及适应后的种毒的长期保存过程中发现病毒滴度有下降趋势,试用了不同试剂对病毒进行保护。     

用Vero细胞大量制备传染性法氏囊病病毒

目前传染性法氏囊病病毒疫苗主要是用原代鸡胚成纤维细胞 (ＰＣＥＦ)增殖ＩＢＤＶ进行生产。由于ＳＰＦ种蛋价格高 ,且ＳＰＦ种蛋在取得及培养过程中易被外源病原污染 ,造成产品质量的不稳定 ,生产成本很高[1] 。Ｖｅｒｏ细胞系是一种贴壁依赖性的传代细胞系 ,ＷＨＯ已经批准用Ｖｅｒｏ细胞作为载体进行病毒疫苗的生产。目前已成功地应用Ｖｅｒｏ细胞生产出脊髓灰质炎病毒疫苗和狂犬病毒疫苗[2 ] 。用Ｖｅｒｏ细胞生产传染性法氏囊病病毒疫苗也会有较好的前景。我们已完成了在Ｖｅｒｏ细胞上静止状态下增殖ＩＢＤＶ弱毒株的培养条件研究 ,而…     

减毒鼠伤寒沙门氏菌运送的鸡传染性支气管炎病毒s1基因DNA疫苗及其免疫效力研究

为研制鸡传染性支气管炎新型基因工程疫苗,构建和表达了运送鸡传染性支气管炎病毒(IBV)DNA疫苗的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌。首先将鸡传染性支气管炎病毒M41株的全长s1基因插入到嵌合CpG DNA的真核表达质粒pVAX1中,构建出重组真核表达质粒pVAX1-S1-CpG。然后将重组质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,构建出运送DNA疫苗的重组减毒沙门氏菌SL7207(pVAX1-S1-CpG)。将重组菌SL7207(pVAX1-S1-CpG)分别以1×109CFU,5×109CFU,1×1010CFU的剂量滴鼻和口服接种4日龄雏鸡,2周内所有试验鸡均无任何不良反应,试验结果表明重组菌SL7207(pVAX1-S1-CpG)具有良好的安全性。在免疫后35 d,商品鸡体重测定结果表明重组菌免疫不影响鸡体增重。以5×109CFU重组菌滴鼻和口服两次接种4日龄商品代伊莎褐蛋鸡,二免3周后,血清抗体和小肠黏膜抗体测定结果表明,SL7207(pVAX1-S1-CpG)免疫组抗体水平与空白对照组、空载体对照组之间分别存在极显著性差异(P<0.01)。攻毒试验结果表明,重组菌SL7207(pVAX1-S1-CpG)免疫组有较高的免疫保护效力,与灭活苗和减毒苗效力相当,显示出一定的应用前景。     

稳定携带新城疫病毒DNA疫苗减毒沙门氏菌的构建及其免疫原性

采用PCR技术从重组质粒pVAX1-F中扩增出新城疫病毒JS5株的融合蛋白(F)基因,将其克隆入真核表达质粒pmcDNA3.1 中,获得重组表达质粒pmcDNA3.1-F.通过电穿孔转化法将重组质粒转入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,构建成功携带DNA疫苗的重组沙门氏菌SL7207(pmcDNA3.1-F).体内、体外试验结果表明,重组质粒pmcDNA3.1-F在沙门氏菌中的稳定性显著高于pcDNA3.1-F.将重组菌SL7207(pmcDNA3.1-F)和SL7207(pcDNA3.1-F)分别以1×109 CFU剂量两次口服免疫BALB/c小鼠,免疫小鼠可产生针对新城疫病毒F蛋白的血清抗体和黏膜抗体.重组菌以5×109 CFU剂量两次口服免疫4日龄SPF鸡,免疫鸡产生的针对新城疫病毒F蛋白的血清抗体和小肠黏膜抗体效价水平与空载体组之间存在显著性差异(P＜0.05).免疫保护试验结果显示,SL7207(pmcDNA3.1-F)和SL7207(pcDNA3.1-F)免疫组的免疫保护率均与空载体组之间存在显著性差异(P＜0.05),且SL7207(pmcDNA3.1-F)免疫组的保护率较SL7207(pcDNA3.1-F)免疫组提高了20.0%,说明稳定携带新城疫病毒DNA疫苗的减毒沙门氏菌具有良好的免疫原性和免疫保护性.     

表达乙型脑炎病毒E蛋白重组减毒沙门菌活载体疫苗株的构建

目的:构建表达乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白的口服重组减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗株。方法:克隆JEV E基因,将其插入表达载体pYA3341中,构建重组质粒pYA3341-E,将重组质粒电转入鼠伤寒沙门菌疫苗株X4550(缺失asd、cya、crp基因),获得重组疫苗菌株X4550(pYA3341-E);鉴定重组菌E蛋白的表达,测定重组菌的稳定性、生长曲线、安全性,以及小鼠的免疫试验和血清中和试验。结果:酶切鉴定和序列测定证实重组质粒构建成功;SDS-PAGE检测有目的蛋白条带;Western印迹证实表达的E蛋白能与猪抗JEV阳性血清特异性结合;重组菌株在体外营养选择压力下,可稳定地携带重组质粒传代繁殖,在体内可较稳定地定居于肠系膜淋巴结和脾脏;小鼠口服试验证实重组菌无毒性作用,安全可靠;小鼠口服重组菌免疫,ELISA检测产生了抗JEV抗体;中和试验表明产生的抗体具有中和活性。结论:构建了能稳定表达JEV E蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门菌疫苗株X4550(pYA3341-E),为研究乙型脑炎口服基因工程疫苗奠定基础。     

传染性法氏囊病病毒感染性克隆的快速构建

用长距离RT PCR一步扩增并克隆全长为 2 82 7bp的传染性法氏囊病病毒 (IBDV)的B节段基因组cDNA ,通过定点的沉默突变在B节段编码区引入一个EcoRV酶切位点作为分子标记。分别构建IBDV的A、B节段基因组真核表达载体 ,在脂质体介导下共转染Vero细胞。RNA点杂交、间接免疫荧光分析表明重组子在Vero细胞得到了表达 ;用转染细胞的培养上清液不断地接种新的Vero细胞 ,模拟病毒“传代” ,观察到细胞形态学发生变化 ,产生了类似野生IBDV感染细胞时出现的细胞病变效应 (CPE) ;电子显微镜下可以看到符合IBDV病毒粒子结构的物质 ;酶切鉴定验证了所引入的分子标记 ,证实人工IBDV获得拯救。建立的基于长距离RT PCR和RNA聚合酶Ⅱ系统的快速、简易的IBDV感染性克隆构建方案 ,为开发新一代抗IBDV的基因缺失疫苗创造了条件。