构建溶瘤腺病毒的策略

溶瘤腺病毒是通过遗传工程改造的腺病毒,具有溶细胞复制周期的特性和特异靶向肿瘤细胞和裂解肿瘤细胞的功能。溶瘤腺病毒通过复制、释放子代病毒感染邻近肿瘤细胞。现在对腺病毒生活周期的认识水平,可以对其基因组进行改造从而使其特异性裂解肿瘤细胞而不杀伤正常细胞,并且构建了多种溶瘤腺病毒。本文主要概述了溶瘤腺病毒的三种构建策略:剔除腺病毒在正常细胞中复制所必需而在肿瘤细胞中不需要的某些基因;利用肿瘤特异性启动子控制病毒复制所必需的基因;对腺病毒衣壳蛋白进行基因修饰,达到特异性结合肿瘤细胞的目的。     

荷载金黄色葡萄球菌肠毒素A 基因的双调控溶瘤腺病毒载体 的构建、鉴定及其抗膀胱肿瘤作用

目的:构建表达超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A基因的双调控选择增殖型溶瘤腺病毒SG502-SEA及对照组携带超抗原SEA基因的非增殖溶瘤腺病毒DC318-SEA,并探讨其潜在的抗膀胱肿瘤作用.方法:将超抗原SEA基因片段经SpeⅠ和SalⅠ双酶切后,克隆入非增殖溶瘤腺病毒载体pSG218中,将鉴定正确的腺病毒载体命名为pDC318-SEA.同样方法将超抗原SEA基因片段克隆入双调控特异性增殖溶瘤腺病毒载体pSG502中,将鉴定正确的腺病毒载体命名为pSG502-SEA.将以上两种携带SEA基因的病毒载体与病毒骨架质粒PPE3-ccdB共转染293细胞,9～14d出现病毒空斑,经过3次病毒空斑纯化,提取腺病毒DNA,应用PCR进行鉴定,经鉴定正确的腺病毒分别命名为DC318 - SEA和SG502-SEA.大量扩增后,氯化铯梯度离心纯化腺病毒,测病毒滴度.结果:经PCR及酶切鉴定,SEA基因成功克隆到两病毒载体中,可以表达SEA基因,且病毒滴度为2.5×101pfu/ml.结论:成功构建表达超抗原SEA基因的双调控增殖型溶瘤腺病毒SG502-SEA及对照组携带超抗原SEA基因的非增殖溶瘤腺病毒DC318-SEA,为下一步抗膀胱肿瘤体内外实验奠定基础.     

溶瘤腺病毒的靶向性策略

溶瘤腺病毒靶向性研究主要集中在利用肿瘤专一性启动子控制腺病毒复制所必需的基因,以及删除或突变在正常组织中复制所必需而在肿瘤中复制所不需要的基因。该文介绍腺病毒载体的性质以及溶瘤腺病毒靶向性策略。     

溶瘤腺病毒在肿瘤靶向治疗中的研究进展

溶瘤腺病毒是一组通过基因工程构建的腺病毒、能够选择性在肿瘤细胞中完成感染-复制周期,从而特异性地杀伤、溶解肿瘤而不伤及其他正常细胞、组织,其作用机制包括：通过基因的缺失突变、插入特异性启动子、以及通过病毒结构蛋白的修饰等方面,实现肿瘤靶向治疗作用。本文就相关研究及进展进行综述。     

溶瘤腺病毒在肿瘤靶向治疗中的研究进展

溶瘤腺病毒是一组通过基因工程构建的腺病毒、能够选择性在肿瘤细胞中完成感染-复制周期,从而特异性地杀伤、溶解肿瘤而不伤及其他正常细胞、组织,其作用机制包括:通过基因的缺失突变、插入特异性启动子、以及通过病毒结构蛋白的修饰等方面,实现肿瘤靶向治疗作用。本文就相关研究及进展进行综述。     

干细胞荷载溶瘤腺病毒靶向治疗脑胶质瘤

胶质瘤是颅内常见的恶性肿瘤之一,其发病率呈现逐年上升趋势.当前,胶质瘤的治疗仍以手术为主,结合放疗和化疗等,但这些传统的治疗方法均存在某些局限性,临床上迫切需要研究更新型的方法,例如肿瘤基因治疗.溶瘤腺病毒是一类经过基因工程改造的病毒,能够特异性感染并杀伤肿瘤细胞,而不影响正常细胞功能.溶瘤腺病毒治疗具有肿瘤特异性和安...     

加热调控的溶瘤腺病毒载体构建及其特征研究

溶瘤腺病毒作为近年来新兴的肿瘤基因治疗策略,因具有“细胞溶解”和“旁观者效应”而备受关注．构建了受热休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)基因启动子调控的溶瘤腺病毒载体Ad-HSP70p-E1A,观察该病毒与热疗联合应用对肺癌细胞生长的抑制作用和带动治疗基因在肺癌细胞中表达的效果．体外实验结果表明,Ad-HSP70p-E1A在肺癌细胞株A549内能较好地实现自身复制,并产生一定的溶瘤作用,在联合热疗后,Ad-HSP70p-E1A的自身复制能力和溶瘤效果分别增强了2～10倍和5倍以上．此外,Ad-HSP70p-E1A还可通过反式提供E1A蛋白而使10 moi用量的复制缺陷型腺病毒AdGFP、Ad-CMV-hGMCSF和Ad-CMV-mIL12的表达提升76.64倍、5倍和7倍．     

溶瘤病毒载体研究进展

溶瘤病毒(oncolytic virus,OVs)疗法是治疗肿瘤的一种新方法,它可通过直接杀死肿瘤细胞并引起机体的免疫反应发挥作用.然而天然溶瘤病毒有一定的局限性,因此需将各种不同的病毒作为载体,通过基因修饰的方法增强或减弱病毒毒力并导入新的功能性基因,以提高其溶瘤作用.目前可以作为溶瘤病毒载体的有单纯疱疹病毒、腺病毒、牛痘病毒、水泡性口炎病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒等.这些病毒载体均可通过不同的基因修饰方法,靶向性感染并杀死不同的肿瘤细胞,获得较好的溶瘤作用.本文综述了几种溶瘤病毒载体的基因修饰方法,以及修饰后的溶瘤效果.     

超抗原SEA的GPI锚定修饰和在CHO-dhfr~-细胞膜上的表达

将GPI锚定修饰的免疫分子直接转移到肿瘤细胞膜上,是研究治疗性肿瘤疫苗的一种有潜力的新策略。通过将从衰变加速因子(DAF)来源的GPI修饰性信号序列与SEA嵌合,获得了GPI修饰的SEA分子,构建的真核表达载体pCIGPI-SEA,用脂质体方法转染到CHOdhfr-细胞中,并用氨甲喋呤(MTX)进行筛选,细胞免疫荧光分析证实,SEA能够在细胞膜上表达。上述GPI锚定修饰的SEA,可用于进一步研究治疗性肿瘤疫苗。     

含CD自杀基因腺病毒载体的构建及其应用

构建了含ＣＭＶ启动子、大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（ｃｄ）基因的复制缺陷型重组腺病毒载体（ＡｄＣＭＶＣＤ）。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和ＲＴ－ＰＣＲ鉴定证实,ｃｄ基因已克隆进入ＡｄＣＭＶＣＤ,并在受染细胞中表达。经氯化铯密度梯度离心法纯化的病毒滴度达１×１０１５ｐｆｕ／Ｌ。经１００ｍ．ｏ．ｉ．的ＡｄＣＭＶＣＤ感染的ＨｅＬａ和Ｃ６细胞株在１００μｍｏｌ／Ｌ５ＦＣ处理后,细胞存活率＜２０％。同时也观察到ＡｄＣＭＶＣＤ／５ＦＣ系统有很强的旁杀伤效应,将３．３％的ＡｄＣＭＶＣＤ受染细胞与９６．７％的野生型细胞混合,经５０μｍｏｌ／Ｌ５ＦＣ处理后,＞６０％的细胞被杀死。ＡｄＣＭＶＣＤ／５ＦＣ系统的建立为肿瘤基因治疗的研究提供了新的手段。     

携带PTEN基因的重组腺病毒表达载体构建的研究

构建携带抑癌基因PTEN(Phosphatase and temin homolog deleted on chromosome ten)的重组腺病毒表达裁体,为研究PTEN的功能和作用机制奠定基础.采用RT-PCR法从大鼠海马神经元扩增目的基因PTEN,克隆人含绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein),GFP基因的pAdTrack-CMV穿梭质粒,在含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183大肠杆菌内进行同源重组;获得重组腺病毒质粒,经Pacl线性化后,转染AD293细胞.结果表明,感染腺病毒载体的AD293细胞表达GFP基因,随着时间逐渐增强,并且出现明显的细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE),经PCR对传代的Ad-PTEN分析证实得到目的基因.成功构建了携带PTEN基因的腺病毒表达载体,为研究PTEN的功能和作用机制奠定了基础.     

人Notch1受体shRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建人特异性受体Notch1短发夹RNA重组腺病毒载体,探讨其对人脐带间充质干细胞中Notch1表达的影响,以便进一步研究Notch1的生物学功能.方法:设计合成Notch1序列干扰序列,插入到pGenesil-1.1上构建重组质粒,取阳性克隆进行酶切及DNA测序鉴定.通过同源重组,构建含目的基因的重组腺病毒质粒栽体pGsadeno-Notch1-shRNA.经PacI线性化后脂质体介导转染到HEK 293细胞,包装后得到腺病毒颗粒.产生的重组腺病毒体外转染人脐带间充质千细胞,RT-PCR和Western blot 检测特异性shRNA对人脐带间充质干细胞中Notch1蛋白在mRNA及蛋白表达水平的抑制效果.结果:经酶切及DNA测序重组腺病毒质粒构建正确.重组腺病毒转染人脐带间充质干细胞3d后,RT-PCR及Western blot检测,可显著下调细胞内Notch1的转录及蛋白表达水平.对Notch1 mRNA和蛋白表达的抑制率分别为70.31％和86.97％,具有统计学意义(P＜0.05).结论:成功构建了表达人Notch1受体shRNA的重组腺病毒载体,为研究Notch1在肿瘤学中的生物学作用及机制奠定基础.     

人肝癌靶向性CD80基因表达重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建人肝癌靶向性CD80基因重组腺病毒载体。方法:首先,从人基因组DNA中克隆AFP增强子、启动子,利用腺病毒穿梭质粒pShuttle和pShutte-CMV,采用AFP增强子替换CMV启动子,构建含有AFP启动子和增强子的穿梭质粒,命名为pShuttle-AFP。将人CD80基因克隆到pShuttle-AFP的AFP增强子和启动子之后,构建pShuttle-AFP-CD80质粒。再将其与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化E.coliBJ5183,利用同源重组构建腺病毒质粒pAd-AFP-CD80。以获得的重组子转染AD293细胞后制备重组腺病毒,并对重组的病毒进行鉴定和病毒滴度测定。结果:测序结果与Genebank中公布的AFP启动子、核心增强子和CD80基因序列相符。双酶切结果与预期结果相符。PacI酶切结果与目的结果一致。穿梭质粒pShutte-AFP-CD80和腺病毒质粒pAd-AFP-CD80经酶切和PCR鉴定均获得期望大小的目的片段。结论:成功的构建了人肝癌靶向性pAd-AFP-CD80腺病毒载体,为CD80基因在肝癌靶向性治疗的研究奠定了基础。     

重组Osx腺病毒载体的构建及其调控成骨细胞增殖与分化的作用

构建表达成骨相关转录因子Osx的腺病毒,观察Osx对原代培养的小鼠成骨细胞增殖与分化的调控作用。将Osx编码基因克隆入腺病毒载体pAdEasy中,经293A包装后得到重组腺病毒,感染原代培养的小鼠颅骨细胞,茜素红染色观察矿化程度,实时定量RT-PCR检测成骨相关标志基因的转录水平,流式细胞检测细胞周期的改变。结果发现,①得到的病毒滴度为2×109PFU/ml,最佳感染复数为50;②表达Osx并不能够促进成骨细胞的矿化;③定量RT-PCR表明表达Osx 1d、3d、6d后成骨分化标志骨钙素、骨涎蛋白、Ⅰ型胶原蛋白的表达量明显上调(p<0.01);④流式细胞仪的结果表明Osx能够促进成骨细胞的增殖(p<0.01)。通过腺病毒在原代培养的成骨细胞中表达Osx能够促进成骨细胞的增殖,并对其分化具有一定的调控作用,为Osx在各种骨损伤的基因治疗应用方面提供了基础。     

人snail真核表达载体构建与鉴定

目的:构建人snail基因真核表达载体并鉴定。方法:使用RT-PCR法获取人snail基因全长c DNA,经Bam H I、Eco R I双酶切、连接,插入pc DNA3.1(+)真核表达载体,转化TOP10感受态细胞,用含氨苄青霉素的LB培养基筛选阳性克隆,提取质粒双酶切电泳及测序鉴定,瞬时转染siha细胞Western-blot从蛋白水平鉴定重组质粒在真核细胞内的表达。结果:pc DNA3.1-snail重组质粒经酶切电泳符合预期片段,测序鉴定插入片段与NCBI Gen Bank文库中人snail序列一致,重组质粒瞬时转染后snail蛋白表达量明显增高。结论:成功构建pc DNA3.1-snail重组质粒载体,为进一步探讨snail基因生物学功能奠定了基础。     

腺病毒载体的高分子修饰

腺病毒载体是基因治疗的常用载体之一,已经广泛应用于肿瘤和遗传疾病等的基因治疗研究中.但是临床发现腺病毒载体有较高的免疫原性,同时缺乏组织或细胞特异性,制约了其在临床上的应用.通过共价键结合或者静电力作用,将高分子修饰到病毒衣壳上,利用高分子的特殊性质可以降低载体的免疫原性和提高载体的靶向性,同时载体保持了较高的转染能力...     

结缔组织生长因子基因RNA干扰复制缺陷型腺病毒载体的构建及鉴定

目的：构建能介导结缔组织生长因子（CTGF）基因RNA干扰的复制缺陷型腺病毒表达载体。方法：以大鼠CTGF基因为靶序列,设计并合成含编码短发夹RNA序列的寡核苷酸,构建腺病毒穿梭质粒P-shuttle-CTGF,酶切及测序分析正确后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转染AD-293细胞,进行病毒包装,得到腺病毒载体Ad．H1-CTGF,用该载体感染HSC-T6细胞,观察其对CTGF基因表达抑制的效果。结果：构建的腺病毒穿梭质粒p-shuttle-CTGF经酶切、测序分析证实正确;包装的病毒载体滴度为4×1010PFU／mL,感染HSC-T6细胞后,Western印迹证实CTGF表达显著减少。结论：构建的腺病毒载体Ad．H1-CTGF可有效抑制HSC-T6中CTGF的表达,为抗纤维化研究提供了有力的工具。