与抗辐射性相关蛋白AA12相互作用蛋白的筛选

将AA12基因克隆入酵母双杂交载体中,转化入酵母菌AH109,Western印迹检测其在酵母中的表达;将转化有AA12基因的酵母菌AH109培养再转化人前列腺cDNA库质粒,检测报告基因的表达情况。Western印迹结果表明AA12可以在酵母菌AH109中表达。共转化子中有2个β-半乳糖苷酶活性分析和d-半乳糖苷酶活性分析结果为阳性的克隆,但测序结果为相同序列。本实验筛选到1个与AA12相互作用的蛋白,此结果为进一步研究新基因AA12的功能奠定了基础。     

抗增殖蛋白在酵母双杂交系统中转录激活作用的检测

目的:检测抗增殖蛋白在酵母双杂交系统中是否具有转录自激活作用。方法:采用PCR方法扩增抗增殖蛋白基因全长序列,构建酵母双杂交系统的诱饵载体pGBKT7-PHB,制备酵母菌AH109感受态细胞,将pGBKT7-PHB转化感受态酵母菌AH109后培养于含缺失培养基的平板上,检测β-半乳糖苷酶活性,判定其是否具有转录自激活作用。结果:扩增出抗增殖蛋白基因全长序列,构建了诱饵载体pGBKT7-PHB,转化酵母菌AH109后在双缺和三缺培养基上未能使β-半乳糖苷酶活性滤纸片变蓝,说明报告基因未被激活。结论:抗增殖蛋白没有转录自激活作用,可用于酵母双杂交系统。     

不同亚型流感病毒NS1蛋白在酵母菌细胞中转录激活功能的差异

非结构蛋白1（nonstructural protein1,NS1）是甲型流感病毒一种重要的调控蛋白,与病毒的毒力密切相关,本文检测了不同亚型流感病毒NS1蛋白在酵母菌细胞中的基因转录激活能力,将携带NS1基因的诱饵载体与空的猎物载体共转化AH109和Y187酵母菌细胞,观察AH109在QDO培养基上的生长情况,以X-α-gal为底物检测其分泌α-半乳糖苷酶的能力;通过ONPG实验定量分析Y187酵母菌细胞β-半乳糖苷酶活性的强弱,结果发现转化H1N1,H5N1和H9N2亚型流感病毒NS1基因的AH109酵母菌细胞能够在QDO培养基上生长,并分泌高水平的α-半乳糖苷酶,同时这些基因转化的Y187酵母菌细胞具有很强的β-半乳糖苷酶活性,与此相反,H3N2亚型流感病毒NS1基因转化AH109和Y187后,上述实验结果均为阴性,这说明H1N1,H5N1和H9N2亚型的NS1蛋白具有刺激酵母菌细胞基因转录的功能,而H3N2亚型的NS1蛋白缺乏这种能力,表明NS1蛋白型别的不同可造成其生物学活性的差异。     

核转录因子TR3及其缺失突变体在酵母双杂交系统中转录激活作用的检测

目的:检测TR3及其转录活性域缺失突变体在酵母双杂交系统中的转录自激活作用。方法:采用PCR方法扩增TR3全长序列及其缺失突变体,构建酵母双杂交系统的诱饵载体pGBKT7-TR3和pGBKT7-TR3/Δ1～690,将pGBKT7-TR3转化感受态酵母菌AH109后培养于含缺失培养基的平板上,检测β-半乳糖苷酶活性,判定其是否具有转录自激活作用。结果:构建了包含TR3全长序列和TR3/Δ1～690序列的诱饵载体,转化酵母菌AH109后在双缺和三缺培养基上未能使β-半乳糖苷酶活性滤纸片变蓝,说明β-半乳糖苷酶报告基因未被激活。结论:TR3及其转录活性域缺失突变体没有转录自激活作用,可用于酵母双杂交系统。     

酵母双杂交系统筛选与组蛋白去乙酰化酶1相互作用的蛋白质

目的：获得组蛋白去乙酰化酶1（HDAC1）的cDNA并构建为酵母双杂交系统中的饵基因,筛选出与其相互作用的蛋白质。方法：利用RT-PCR方法从人HeLa细胞中克隆出1446bp的cDNA片段,重组入载体pGBKT7得到pGBKT7-HDAC1,转化至酵母菌AH109,检测其对酵母细胞无毒性也无自激活报告基因活性,然后将其与已转入HeLa细胞基因组cDNA文库的酵母菌融合,进行筛选和验证工作。结果：筛选出3个阳性克隆,经免疫共沉淀试验进一步验证,发现仅有1个蛋白能与HDAC1发生相互作用,测序结果表明该蛋白为FHL2。结论：应用酵母双杂交方法筛选出HDAC1的相互作用蛋白FHL2,为进一步研究HDAC1的作用提供了新线索。     

利用酵母双杂交系统从人胚胎肝脏cDNA文库中筛选与JNKK2相互作用的蛋白

目的:利用酵母双杂交系统,以149位赖氨酸突变成甲硫氨酸的c-Jun N端激酶激酶2(JNKK2)失活突变体(JNKK2KM)为诱饵,从人胎肝文库中筛选能与JNKK2作用的蛋白。方法:构建诱饵质粒p GBKT7-JNKK2KM,将其转化到AH109感受态酵母菌中进行扩增,而后检测融合蛋白表达、自激活活性以及对宿主的毒性;将诱饵酵母菌与含有人胎肝c DNA文库质粒的Y187交配进行酵母双杂交筛选,经缺陷型培养基筛选排除假阳性克隆;取阳性菌落抽提质粒进行酶切鉴定,对鉴定后的阳性克隆进行测序及生物信息学分析,明确筛选出的蛋白信息,通过免疫共沉淀实验验证筛选出的蛋白与JNKK2的相互作用。结果:构建了诱饵质粒,检测到融合蛋白的表达,且无自激活作用,未发现对宿主存在毒性;初步筛选到120个阳性克隆,经多轮重复验证得到阳性克隆11个,经生物信息学分析最后确定3个可以与JNKK2相互作用的新蛋白质分子为鸟嘌呤核苷酸结合蛋白β多肽2样蛋白1(GNB2L1)、开放读框60(ORF60)与泛素样修饰物激活酶3(UBA3),免疫共沉淀实验表明它们均能与JNKK2发生相互作用。结论:筛选到3个新的JNKK2相互作用蛋白,为深入探究JNKK2在肝脏中的作用奠定了基础。     

酵母双杂交筛选心脏cDNA文库中与人热激蛋白70相互作用的蛋白质

目的:利用酵母双杂交系统从人心肌cDNA文库中筛选与热激蛋白70(HSP70)相互作用的蛋白质。方法:从人心脏cDNA文库扩增Hsp70基因,克隆于pGBKT7载体上,酶切鉴定及序列分析,并检测pGBKT7-Hsp70酵母细胞AH109中的自激活活性;将构建的酵母表达诱饵质粒载体pGBKT7-Hsp70转化AH109酵母细胞,与转化有人心脏cDNA文库的酵母Yl87进行交配实验,筛选与HSP70相互作用的蛋白质,通过一对一的回复杂交实验排除假阳性,对阳性克隆进行序列测定和生物信息学分析。结果:构建了"诱饵"质粒栽体pGBKT7-Hsp70,并证明其在酵母双杂交系统中无自激活活性,筛选得到多个与Hsp70相互作用的阳性转化子,并最终得到HSP70的1个相互作用蛋白质HIP。结论:应用酵母双杂交系统筛选出与HSP70相互作用的1个蛋白质,它们的相互作用可能与HSP70发挥细胞分子伴侣作用有关。     

人类RhoxF1蛋白的生物信息学分析及其自激活检测

目的：生物信息学分析人类RhoxF1蛋白的氨基酸序列,构建RhoxF1酵母双杂交诱饵载体,并检测其自激活活性。方法：生物信息学分析RhoxF1蛋白保守区域,比较小鼠Rhox5与人RhoxF1的氨基酸序列同源性,PCR扩增RhoxF1基因,与PMD-18-T载体连接,然后把RhoxF1克隆到pGBKT7载体中,醋酸锂法将重组质粒pGBKT7-RhoxF1转入酵母菌AH109,观察pG-BKT7-RhoxF1在AH109中的表达情况,检测诱饵载体有无毒性和自激活作用。结果：RhoxF1蛋白保守区域有大量的DNA结合位点,与Rhox5具有30%的同源性。成功构建诱饵载体pGBKT7-RhoxF1,目的片段可在酵母AH109中表达,并且对酵母菌无毒性,对报告基因无自激活功能。结论：探索了RhoxF1的蛋白特性,成功构建pGBKT7-RhoxF1重组质粒,可以作为酵母双杂交诱饵载体筛选与RhoxF1相互作用的蛋白,进而对其进行功能性研究。     

HCV截短型E2蛋白在酵母双杂交系统中的表达及自激活作用检测

目的：获得不包含C末端跨膜区的HCV包膜糖蛋白E2蛋白（E2 661）编码基因,构建酵母双杂交诱饵载体,并检测对报告基因的激活作用。方法：PCR扩增HCV E2661 cDNA片段,先克隆入pMD-18T载体中,经测序正确后,再亚克隆入诱饵载体 pGBKT7,将重组质粒pGBKT7-E2661用醋酸锂法转化入酵母菌AH109,检测目的蛋白在酵母细胞中的表达以及对报告基因有无激活作用。结果：成功构建含有HCVE2661基因片段的酵母双杂交诱饵载体,目的片段可在酵母细胞AH109中正确表达,对酵母菌无毒性且对报告基因无自主激活作用。结论：可利用所构建的pGBKT7-E2661作为酵母双杂交系统中的“诱饵”,进行相互作用分子的筛选研究。     

酵母双杂交系统筛选GATA-1相互作用蛋白质及功能验证

目的 利用酵母双杂交技术从人脑cDNA文库中筛选与人GATA-1相互作用的蛋白质.方法 从人K562细胞中扩增出全长GATA1基因,设计引物将其3段截断体亚克隆入酵母表达载体pDBLeu中,转化至AH109感受态酵母中,利用酵母双杂交技术筛选人脑cDNA文库中与其相互作用的蛋白质,阳性克隆通过回转及免疫共沉淀试验进行验证,利用3xGATA荧光素酶报告基因对相互作用蛋白质进行功能验证.结果 成功构建出酵母诱饵蛋白表达质粒pDBLeu-GATA1（1）,pDBLeu-GATA1（2）,pDBLeu-GATA1（3）,筛到34个阳性克隆,用生物信息学分析及回转验证得到5个与GATA-1相互作用的候选蛋白,通过免疫共沉淀试验进一步验证,获得3个蛋白质能与GATA-1相互作用,分别是ECSIT,EFEMP1和GPS2.荧光素酶试验表明这3个蛋白质均能对GATA1的转录活性产生影响,证实它们之间的相互作用具有影响GATA1转录的功能.结论 应用酵母双杂交技术及免疫共沉淀试验,从人脑cDNA文库中成功获得3个与GATA-1相互作用并对其转录活性具有调节作用的蛋白质,为研究GATA1蛋白质的功能提供了新的线索.