FMDV整联蛋白受体b1亚基的克隆及其配体黏附区多抗的制备

采用RT-PCR技术从牛气管组织扩增出2400 bp的b1基因, 回收纯化连入PGEM-T载体, 测序。用Expasy软件对b1基因的抗原性进行分析, 选取胞外区334~861 bp的配体结合区与6×His融合, 在大肠杆菌中大规模诱导表达, 并经Ni2+亲和柱层析纯化。通过SDS-PAGE鉴定后, 应用纯化蛋白免疫新西兰家兔, 获得效价在1:12 800以上的多抗, Western blotting鉴定表明此抗体可特异性的与表达的融合蛋白作用。     

FMDV整联蛋白受体β1亚基的克隆及其配体黏附区多抗的制备

采用RT-PCR技术从牛气管组织扩增出2400 bp的β1基因, 回收纯化连入PGEM-T载体, 测序.用Expasy软件对β1基因的抗原性进行分析, 选取胞外区334～861 bp的配体结合区与6×His融合, 在大肠杆菌中大规模诱导表达, 并经Ni2+亲和柱层析纯化.通过SDS-PAGE鉴定后, 应用纯化蛋白免疫新西兰家兔, 获得效价在1:12 800以上的多抗, Western blotting鉴定表明此抗体可特异性的与表达的融合蛋白作用.     

凝血靶向通用效应因子tTF/SA融合蛋白的表达及活性鉴定

制备凝血靶向通用效应因子tTF/SA融合蛋白,并鉴定其生物学活性。利用PCR技术构建tTF与链霉亲和素SA的融合基因,克隆至表达载体pET22b( ),在E.coliBL21(DE_3)中表达,镍亲和层析柱纯化tTF/SA融合蛋白。凝血实验和FⅩ活化实验鉴定融合蛋白中tTF的活性,ELISA鉴定融合蛋白中SA与生物素Biotin结合的活性。获得序列正确的tTF/SA/pET22b( )重组子,融合基因在E.coliBL21(DE_3)中高效表达。纯化后的融合蛋白具有活化FⅩ、引起血液凝固的能力,且能与生物素结合。融合基因已成功在E.coliBL21(DE_3)中表达,tTF/SA融合蛋白具有TF和SA活性。融合蛋白tTF/SA可作为通用效应因子,与生物素化的肿瘤组织血管特异性载体联用,实现选择性诱发肿瘤组织血管栓塞的多点治疗。     

GhCyt b5基因的克隆及其蛋白参与电子传递功能的分析

从陆地棉品种中棉所35盐胁迫EST文库中筛选到与其它植物高度同源的细胞色素b5蛋白(Cyt b5)基因片段,利用RACE技术,获得Cyt b5基因的cDNA序列,命名为GhCyt b5,基因全长810bp,最大阅读框402 bp,编码由134个氨基酸组成的蛋白质,分子量约为17kDa.将该基因的编码序列插入到原核表达载体pET32a中,构建重组质粒为pET32a-Cyt b5,对不同条件下进行蛋白诱导表达分析,发现在28℃和1 mmol/L IPFG条件下能够获得可溶性的GhCyt b5蛋白.利用Ni2+柱亲和层析纯化和SDS_PAGE鉴定分析表明获得重组蛋白为目的蛋白.通过提取棉花细胞物质为反应介质,进行体外电子传递功能分析,发现GhCyt b5能够从还原态变为氧化态,参与电子的传递功能.     

PHD2基因原核表达载体的构建及其在大肠埃希菌中的表达

目的构建PHD2基因原核表达载体pET-43.1b（＋）-PHD2,实现Nus-PHD2融合蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达。方法用SacⅠ酶切pET-43.1b（＋）制备线性化载体,设计与线性化载体两端具有至少15个同源序列的特异性引物,以真核重组质粒pCMV6-Entry-EGLN1为模板,PCR法扩增PHD2目的基因。采用In-Fusion技术构建原核表达载体pET-43.1b（＋）-PHD2,并将其导入大肠埃希菌BL21（DE3）中诱导表达。用SDS-PAGE和Western blot分析并鉴定表达出的融合蛋白。用Ni-NTA亲和层析法纯化目的蛋白。结果成功构建了PHD2原核表达载体;SDS-PAGE结果显示融合蛋白以可溶性形式表达;Western blot鉴定表明融合蛋白可以与PHD2单克隆抗体特异性结合。结论实现了Nus-PHD2融合蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达,为PHD2生物学功能的研究奠定了基础。     

SA-hirudin-RGD融合蛋白的原核表达及其抗凝血酶与抗血小板聚集功能的研究

目的:构建SA-hirudin-RGD重组载体,表达和纯化融合蛋白,并对其抗凝血酶、抗血小板聚集功能进行初步验证。方法:利用基因重组技术将链霉亲和素(SA)核心区与hirudin-RGD序列连接,并克隆到原核表达载体PET-44b中,Westernblotting鉴定经IPTG诱导后纯化的融合蛋白。抗凝血酶和抗血小板聚集作用分析证明该融合蛋白既有抗凝血酶又有抗血小板聚集的功能。结果:重组载体p ET44b-SA-hirudin-RGD经限制性酶切鉴定和基因测序证实构建成功;经IPTG诱导后SA-hirudin-RGD融合蛋白在大肠杆菌中高效表达;纯化得到该目的蛋白,相对分子质量经Westernblotting鉴定约为70000。抗凝血酶和抗血小板聚集的实验证明,融合蛋白SA-hirudin-RGD既有抗凝血酶又有抗血小板聚集的功能。结论:具有抗凝血酶和抗血小板聚集双重功能的SA-hirudin-RGD融合蛋白被成功表达和纯化,为下一步SA-hirudin-RGD的功能研究及临床应用确立了基础。     

利用GST融合蛋白表达系统表达与纯化人N-Ras蛋白

目的:克隆人N-ras蛋白全长编码区基因,获得其原核表达产物,并对融合蛋白进行纯化。方法:采用PCR技术从人乳腺文库中扩增出人N-ras蛋白全长编码区基因,将其克隆到p GEX-KG载体中,在大肠杆菌Rossate中表达后,利用GST-Sepharose 4B亲和珠对原核表达产物进行纯化,SDS-PAGE鉴定表达与纯化产物。结果:从人乳腺文库中扩增获得约600 bp的DNA片段,并克隆至p GEX-KG载体上,经测序与目的序列完全一致;在大肠杆菌Rossate中诱导表达出相对分子质量约47×103的目的蛋白;纯化后,经鉴定获得了纯度较高的重组蛋白GST-N-Ras。结论:获得了重组蛋白GST-N-ras,为后续深入研究Ras基因与其他癌基因、抑癌基因的相互作用奠定了基础。     

表皮生长因子受体干扰序列与白细胞介素24融合蛋白的原核表达

目的：在大肠杆菌中表达表皮生长因子受体干扰序列（EGFRi）与白细胞介素24（IL-24）的融合蛋白。方法：人工合成肿瘤细胞表面受体特异性结合位点EGFRi核苷酸序列,应用重叠延伸PCR技术将其与IL-24基因连接,其间引入一段柔软短肽编码基因;将融合基因克隆入pET-22b原核表达载体,IPTG诱导融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,对表达条件进行优化;用His·Bind纯化试剂盒对表达产物进行纯化,SDS-PAGE进行鉴定。结果：酶切和测序结果证实EGFRi-IL-24融合基因的原核表达载体构建正确;在IPTG浓度为0.8mol／L、28℃诱导10h的条件下,可溶性融合蛋白表达量最高;表达产物的相对分子质量与预期值一致,为22000;经纯化得到了均一的融合蛋白。结论：获得大肠杆菌表达的融合蛋白EGFRi-IL-2,可用于活性分析。     

富亮氨酸重复超家族新成员LRRC4的IgC2结构域蛋白的原核表达和纯化

富亮氨酸重复超家族新成员LRRC4基因是新克隆的脑瘤相关基因,采用多聚酶链式反应（PCR）方法获得长约500bp含IgC2结构域的DNA序列,扩增产物克隆至pGEX-4T-2质粒中,构建GST融合表达质粒,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,经包涵体沉淀,溶解,Glutathione-Sepharose亲和层析纯化获得融合蛋白,并以Western blot鉴定证实,通过IgC2结构域蛋白的纯化分离该结构域,为进一步研究该结构域及LRRC4基因的结构和功能奠定了基础。     

长双歧杆菌NCC2705株果糖结合蛋白BL0033基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的：克隆长双歧杆菌NCC2705株果糖结合蛋白BL0033的基因,利用大肠杆菌表达GST-BL0033融合蛋白并纯化。方法：以长双歧杆菌NCC2705株基因组为模板,PCR扩增BL0033基因,并将其插入pGEX-4T-1表达载体,转化至大肠杆菌DH5α;提取质粒,经PCR、质粒双酶切及测序鉴定后,转入大肠杆菌BL21,并对表达条件进行摸索;用谷胱甘肽-Sepharose4B树脂对可溶性GST-BL0033融合蛋白进行纯化。结果：PCR扩增的BL0033基因长度接近1000bp,与预期值一致;重组菌在IPTG浓度为0.05mmoL/L的条件下,于16℃诱导过夜后,SDS-PAGE分析可见可溶性表达条带,相对分子质量约60×103,与预期值一致;亲和纯化后,SDS-PAGE结果显示单一的表达条带。结论：克隆了BL0033蛋白的基因,并表达纯化了融合蛋白GST-BL0033,为进一步研究长双歧杆菌NCC2705株BL0033蛋白功能奠定了基础。     

人PPARαLBD在大肠杆菌中的表达纯化及鉴定

过氧化物酶体增殖物活化受体α(peroxisome prolifterator-activated receptor α,PPARα)属于Ⅱ型核受体,通过其配体结合区（1igand binding domain,LBD）结合特定的激动剂对参与机体代谢的关键酶、受体等的表达起调节作用。本研究从人肝组织提取总RNA,RT-PCR扩增出PPARαLBD的cDNA,将其克隆入表达载体pMAL-p2X麦芽糖结合蛋白（Maltose Binding Protein,MBP）编码基因malE序列的下游,重组质粒转化E coli TB1,进行了高效的可溶性融合蛋白表达。产物经多糖亲和树脂（Amylose-resin）纯化后,获得了电泳纯的MBP-PPARαLBD。MBP-PPARαLBD用Xa因子酶切,经Amylose-resin亲和层析、DE-52阴离子交换层析纯化回收,获得了电泳纯的PPARαLBD。本研究为进一步比较MBP-PPARαLBD和PPARαLBD的功能,筛选PPARα配体奠定了基础。     

斑马鱼心脏标志基因TNC多克隆抗体的制备及表达研究

TNC是心脏发育的标志基因,但该基因在斑马鱼中的表达尚未研究。斑马鱼TNC基因基因的开放阅读框含有5132bp,编码1710个氨基酸,采用生物信息学结合PCR的方法获得了斑马鱼TNC基因的片段。将所得的PCR片段插入原核表达载体pGEX-4T-1中,并将重组质粒（pGEX-4T-1-TNC）转化大肠杆菌BL21;通过IPTG诱导表达GST—TNC融合蛋白,通过尿素洗涤沉淀蛋白并切胶回收纯化融合蛋白,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。Western blot和免疫组化分析表明,制备的抗体具有良好的高效价性和特异性。利用该抗体进行斑马鱼胚胎抗体染色分析表明,TNC蛋白在心脏组织中特异表达。     

猪丹毒丝菌C43065株表面保护性抗原AN端保护区在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌中表达猪丹毒丝菌C43065株表面保护性抗原A（SpaA）N端保护区（SpaA-N）,并检测其抗原性。方法：利用PCR方法从猪丹毒丝菌C43065株基因组中扩增出spaA基因片段,构建pMD18-spaA重组质粒并对插入片段进行测序;以pMD18-spaA重组质粒为模板,PCR扩增得到spaA-N基因片段,构建重组表达质粒pGEX-spaA-N,经序列测定证实正确后转化大肠杆菌BL21（DE3）,再经IPTG诱导表达GST-SpaA-N融合蛋白并纯化。结果：扩增得到的spaA基因长1881bp,编码由626个氨基酸残基构成的多肽;SDS-PAGE和Western印迹检测结果表明,诱导表达获得相对分子质量约64000的GST-SpaA-N融合蛋白,该融合蛋白能与相应抗体发生特异性反应。结论：获得了在大肠杆菌中可溶性表达的GST-SpaA-N融合蛋白,为进一步研究猪丹毒丝菌免疫保护性抗原奠定了基础。     

丙型肝炎病毒ns2基因的克隆及其表达

以p90-HCV为模板,通过PCR分别得到全长和截短(2881-3078bp)ns2基因。将截短ns2基因克隆到pET32a原核表达载体,并在大肠杆菌中获得了Trx-His-NS2C融合蛋白的可溶性高表达。通过His树脂纯化得到融合蛋白,免疫家兔获得高效价高特异性的抗体。同时构建了含有全长ns2基因的重组腺病毒,利用该重组病毒感染HepG2和293细胞成功的表达23.2kDa的NS2蛋白。本文的研究为进一步开展NS2蛋白的结构与功能研究奠定了良好的基础。     

Inducible model for beta-six-mediated site-specific recombination in mammalian cells

The prokaryotic beta recombinase catalyzes site-specific recombination between two directly oriented minimal six sites in chromatin-integrated substrates. Here, we demonstrate that an enhanced green fluorescent protein (EGFP)-fused version of beta recombinase (beta-EGFP) is fully active, retaining most specific activity. It is used to develop a recombination-dependent activatable gene expression (RAGE) system based on the androgen receptor (AR) ligand-binding domain (LBD). Two hybrid molecules, a direct fusion of the LBD-AR to the C-terminus of beta recombinase (beta-AR) and a triple fusion of beta-EGFP to the same ligand-binding domain (beta-EGFP-AR), were engineered and their subcellular behavior, stability and catalytic activity were evaluated. Both chimeric beta recombinase proteins showed in vivo inducible recombinogenic activity dependent on addition of an androgen receptor agonist, although the beta-AR fusion protein demonstrated more accurate ligand-dependent translocation from cytoplasm to nucleus.     

弗氏志贺菌5a 型 M90T 株 ClpB 蛋白在大肠杆菌中的融合表达和纯化

目的：构建弗氏志贺菌cZp8基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达后,纯化带T7标签的ClpB蛋白。方法与结果：PCR扩增得到线性化表达载体pET24a与2574bp的c加曰基因片段,利用不依赖连接反应的克隆法（LIC）进行克隆,得到重组质粒pET-ClpB,转入大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达,通过一系列条件优化,确定可溶性表达条件为在30℃下、用1mmol／LIPTG诱导2h;利用抗T7单克隆抗体琼脂糖珠进行亲和纯化,得到了纯度很高的相对分子质量为95×10^3的ClpB-T7融合蛋白。结论：实现了ClpB-T7在大肠杆菌中的可溶性表达,并纯化获得了高纯度的融合蛋白。     

肿瘤MUC1/Y的克隆及其胞外段在大肠杆菌中的可溶性表达、纯化和鉴定

为获得MUC1 Y全长cDNA及其胞外段蛋白 ,以用于进一步的生物学功能及肿瘤生物学治疗的研究 .利用RT PCR从HeLa细胞中扩增MUC1 Y全长cDNA ;PCR扩增其胞外段 ,克隆到原核表达载体pGEX 2T ,转化DH5a菌 ,诱导表达 ;亲和层析纯化 ;凝血酶酶切、GST活性及N端蛋白测序鉴定 ;免疫家兔制备多克隆抗体 .所得MUC1 YcDNA的开放读框为 759bp ,登录于GenBank(AF12 552 5) .其信号肽编码序列缺失 9bp ,第 3 3 1位发生G A转换 ,造成缬氨酸突变为蛋氨酸 .表达获得约 4 0kD融合蛋白GST Yex ,占菌体总蛋白 2 5%～ 3 0 % ,其中 70 %～ 80 %为可溶性 ,经亲和层析一步纯化 ,纯度 >90 % ,GST比活性为 0 2 1U μg .凝血酶酶切后的N端蛋白序列测定表明与已知序列完全一致 ,抗血清ELISA效价为 1∶2 50 0 0 0 .结果表明 ,克隆到发生碱基缺失和突变的MUC1 Y全长cDNA ,获得MUC1 Y胞外段蛋白及其多抗 ,可进一步用于相关研究 .     

Expression of human papillomavirus type 6b E2 gene product with DNA-binding activity in insect (Bombyx mori) cells using a baculovirus expression vector

Human papillomavirus type 6b (HPV6b) has been shown to be a major etiologic agent of genital condylomas. The E2 gene, one of the early genes, has been shown to activate the enhancer element in trans in cells transformed with bovine papillomavirus type 1a (BPV1a) but the E2 gene product of any HPV has not been identified. The E2 gene of HPV6b was inserted into the polyhedrin gene of a Baculovirus, Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus (BmNPV), 156 bp downstream from the translational start codon, and transferred into BmNPV by allelic replacement in a cotransfected Bombyx mori cell line, Bm-N. The predicted 46-kDa protein was produced by a recombinant virus in the infected Bm-N cells at a high level under the control of the polyhedrin promoter. We obtained the antibody against the putative E2-polyhedrin fusion protein by immunizing a rabbit with this protein. This protein reacted with the antibodies against polyhedrin and the fusion protein. This protein did specifically bind to the upstream regulatory region of the HPV6b and BPV1a genomes. This DNA binding activity was blocked by the antibody against this protein.     

多疣壁虎tubulin beta3基因克隆和多克隆抗体制备

Tubulin beta3(TUBB3)是特异表达于神经元的微管蛋白tubulin beta家族成员,被认为在维持轴突正常状态起着重要作用,是神经元特异的标志蛋白。该研究旨在获得多疣壁虎TUBB3全长cDNA序列并制备其多克隆抗体,为进一步研究多疣壁虎断尾再生提供基因和抗体工具。根据多疣壁虎中枢神经组织cDNA文库中TUBB3的EST片段序列,采用RACE-PCR方法,获得了全长cDNA,序列全长1790bp,编码450个氨基酸,与其他物种TUBB3蛋白高度同源;RT-PCR方法和Northern blotting检测了TUBB3组织表达谱及其转录本的大小;在GenBank登录号为JQ080315;NJ法构建的系统进化树分析表明,多疣壁虎的TUBB3蛋白与鸡的TUBB3蛋白在进化距离上较近;构建pET-32a-TUBB3原核表达载体,诱导表达并纯化TUBB3蛋白,获得兔抗壁虎TUBB3多克隆抗体,ELISA检测其效价大于1:65536,Western blotting方法证实所制备的多克隆抗体可特异识别多疣壁虎神经组织的的TUBB3蛋白。