22株猪瘟病毒E2基因部分编码序列的序列分析

RT－PCR方法获得了13株猪瘟病毒分离株、石门系强毒、中国C株及法国温度敏感株Thiverval株的E2基因部分编码序列的拉增片段,并对其进行了测序,得到了251bp的E2基因部分编码序列。利用DNAStar软件对其中224bp的片段进行了序列分析,并与已发表的Alfort、Brescia等毒株进行比较,结果13株猪瘟分离株所测片段均为猪瘟病毒E2基因的序列,与石门系强毒的序列相比所有毒株的碱基替换随机地分布于整个序列,无碱基缺失和碱基插入。其中变化较大的区域位于序列的3′端。2 2株HCV E2基因部分编码序列的核苷酸及氨基酸同源性范围分别为78.1%-100%、78.4%-100%,其中13株猪瘟病毒流行毒株的核苷酸及氨基酸同源性范围分别为:78.1%-100%、78.4%-100%,4株70－80年代分离的毒株的核苷酸及氨基酸同源性范围分别为：79.0%-88.3%、81.1%-87.8%,9株90年代分离的毒株的核苷酸及氨基酸同源性范围分别为：90.3%-100%、83.8%-100％;说明猪病毒流行株的变异呈现一定的多样性。     

12株猪瘟病毒E2基因主要抗原区域的序列差异分析

用RTPCR扩增了12个不同时期分离的HCV毒株E2基因主要抗原区域的cDNA片段并对其进行了序列测定。应用DNAstar序列分析软件对所测的12个HCV毒株与国内外已知的6个毒株Alfort株、Ald株、Brescia株、Gpe株、C株、CW株及早期已测定的HCLV株、HCVSM株和北京顺义株(BJSY2/96)3个毒株的相应片段进行了同源性比较分析。E2基因主要区域长度均为224 bp,包括从HCV 2485到2708位的E2基因B、C区域。所测的疫苗株HCLV与国外测得的疫苗株C株核苷酸及氨基酸同源性分别为991%和100%,表明目前应用的疫苗株是稳定的;用目前我国流行的部分野毒株对HCLV株免疫猪的攻击试验表明,HCLV对野毒株均具有很好的免疫力,这与序列分析结果相吻合。根据系统树分析,可将HCV分为两大群,5株90年代的野毒株及1株80年代的野毒株(其中北京3株、河南2株、广东1株)均与国内外C株、标准株属同一群(即第一群),其核苷酸及氨基酸的同源性分别为857%～100%和838%～100%;与Alfort株同属第二群的有6个野毒株(广西北海、辽宁、河北黄骅、吉林、深圳光明、四川成都),其中80年代与90年代的野毒株各有三株,核苷酸及氨基酸的同源性分别为843%～100%和851%～100%;21株HCV的核苷酸及氨基酸的同源性分别为781%～100%和784%～100%。两群之间的特征性差异表现在713和729位氨基酸位点的不同,经分析发现猪瘟野毒株具有复杂性与多样性。     

两个猪瘟病毒野毒株gp55基因抗原编码序列的分析及比较

利用反转录－ＰＣＲ方法扩增了吉林省猪瘟病毒（ＨＣＶ）两个野毒株ｇｐ５５基因的主要保护性抗原编码区,并将其克隆到ＰＧＥＭ＿Ｔ载体中,然后用Ｓａｎｇｅｒ双地测定了其核苷酸序列,并推导了其氨基酸序徇。将测定的这两个ＨＣＶ野毒株的部分序更与国内外已知的ＨＣＶ序列进行比较,结果表明：这两个野毒株的核苷酸序理的同生为９４．９％,氨基酸序列同源性为９７．４％,与１９８５－１９９２年意大利中部分离４个野毒的同源性     

猪瘟病毒石门株与兔化弱毒株E0糖蛋白基因的克隆及序列分析

参考已发表的猪瘟病毒序列,设计并合成了一对引物,应用ＲＴＰＣＲ 技术,扩增了猪瘟兔化弱毒（Ｈｏｇ ｃｈｏｌｅｒａ ｖｉｒｕｓ ｌａｐｉｎｉｚｅｄ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｓｔｒａｉｎ , ＨＣＬＶ） 和石门强毒株的Ｅ０ 糖蛋白基因,并将其克隆到ｐＧＥＭＴ 载体中,测定了其核苷酸序列,并推导了其氨基酸序列。结果表明我国这两株强弱不同毒株Ｅ０ 糖蛋白核苷酸序列同源性和推导的氨基酸序列同源性分别为９５－０ ％ 和９４－３ ％ ,有１３ 个氨基酸的差异,ＨＣＬＶ 比石门株多了一个潜在的Ｎ糖基化位点。将我国这两株病毒与国外已报导的ＨＣＶ 毒株Ｅ０ 基因序列进行了比较,发现石门株与日本的两株毒株ＡＬＤ 和ＧＰＥ－ 同源性较高,核苷酸序列同源性分别为９７－４ ％ 和９６－５ ％ ,氨基酸同源性分别为９７－４ ％ 和９６－０ ％ ,而与欧洲Ｂｒｅｓｃｉａ 株和Ａｌｆｏｒｔ 株同源性较低,核苷酸同源性分别为９２－２ ％ 和８６－５ ％ ,氨基酸同源性为９５－２ ％ 和９２－５ ％ , ＨＣＬＶ 与ＡＬＤ、ＧＰＥ－ 、Ｂｒｅｓｃｉａ、Ａｌｆｏｒｔ 株核苷酸同源性分别为９５－６ ％ 、９４－９ ％ 、９１－３ ％ 、８５－５ ％ …     

两个猪瘟病毒野毒株gp55基因抗原编码区序列的分析及比较

利用反转录－PCR方法扩增了吉林省猪瘟病毒（HCV）两个野毒株gp55基因的主要保护性抗原编码区,并将其克隆到pGEM－T载体中,然后用Sanger双脱氧法测定了其核苷酸序列,并推导了其氨基酸序列。将测定的这两个HCV野毒株的部分序列（350bp）与国内外已知的HCV序列进行比较,结果表明：这两个野毒株的核苷酸序列的同源性为94．9％,氨基酸序列同源性为97．4％,与1985～1992年意大利中部分离4个野毒株的同源性明显高于其它HCV毒株,核苷酸同源性分别为97．2％～98．3％和94.0％～949％,氨基酸同源性分别为98．3％～991％和97.4％～98.3％,而与我国的HCV标准强毒株即石门株的核苷酸同源性仅分别为83.1％和83.1％,氨基酸同源性仅分别为90.6％和91.4％。因此认为吉林省这两个野毒株与意大利中部的4个野毒株具有密切的关系,而与石门株很可能来源不同。     

猪瘟病毒流行毒株E2基因密码子优化及在酵母中的高效表达

密码子的偏嗜性是影响基因异源表达的重要参数之一,优化密码子序列能够提高外源基因的表达水平。野生型猪瘟病毒E2基因在毕赤酵母中的表达量较低,为了提高E2基因在毕赤酵母中的表达水平,利用PCR基础上的定点突变技术将E2基因上的毕赤酵母低利用密码子突变为其高利用率的简并密码子。结果表明,替换野生型E2基因上24个酵母低利用密码子后,E2基因在酵母中表达水平有较显著提高,表明通过密码子优化提高E2基因在毕赤酵母中的表达这一策略是成功的。     

猪瘟病毒E2基因在昆虫细胞/杆状病毒中的表达

目的利用昆虫细胞/杆状病毒系统表达猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白,用于E2蛋白功能、开发CSF新型疫苗以及建立相关血清学诊断方法等研究。方法采用RT-PCR扩增CSFV E2基因,将PCR产物克隆到pGEM-T-Easy载体,将该基因插入到pFast-BacHT A载体中,构建重组转座载体后转化DH10Bac感受态细胞,获得重组Bacmid质粒后转染sf9昆虫细胞,传毒3代,对表达蛋白进行Western-blot及免疫组化鉴定。结果成功克隆CSFVE2基因,其核苷酸序列为1119 bp。SDS-PAGE电泳结果显示表达E2蛋白相对分子质量约为43×103,Western-blot和免疫组化结果证实表达蛋白能够被CSFV标准阳性血清识别。结论在Bac-to-Bac杆状病毒系统中的成功表达了CSFV E2蛋白,与CSFV标准阳性血清具有较好的反应性。     

猪瘟病毒E2基因主要抗原区的克隆及原核表达

利用反转录PCR（RT－PCR）和套式PCR（nest Polymerase Chain Reaction,nPCR)技术扩增出当前猪瘟流行毒（广西玉林株,GXYL)一中国猪瘟兔化弱毒（C－株）兔脾组织毒E2基因的主要抗原区,将其克隆到表达载体pPROEX-HTb中,获得重组质粒pPROEX-GXYL和pPROEX-C,经PCR,酶切和序列分析鉴定表明,插入的位置,大小和读码框均正确。SDS－PAGE,检测表明,经重组质业pPROEX-GXYL和pPROEX-C转化,诱导的受体菌能表达E2基因主要抗原区蛋白,Western-blot检测表明,诱导表达的抗原蛋白能与猪瘟阳性血清发生特异性反应。     

猪瘟病毒E2基因真核表达质粒的构建及基因疫苗的研究

构建了猪瘟（ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ,ＣＳＦＶ）主要保护性抗原Ｅ２基因４种不同的真核表达质粒。小鼠免疫试验表明,Ｅ２基因上不同的功能区对基因疫苗的免疫应答有很大影响,有信号肽序列的Ｅ２基因可诱导产生特异性免疫反应,且无跨膜区序列的Ｅ２基因所诱导的免疫应答反应比有跨膜区序列的强,而无信号肽序列的Ｅ２基因则不能诱导产生ＣＳＦＶ特异性的免疫反应。攻毒保护试验表明,免疫家兔最     

我国猪瘟病毒兔化弱毒株囊膜糖蛋白E0基因的克隆及序列测定

采用异硫氰酸胍一步法从４８０代猪瘟病毒兔化弱毒株（ＨＣＬＶ）脾毒中提取总ＲＮＡ,以该ＲＮＡ为模板,进行反转录,然后采用套式ＰＣＲ扩增出ＨＣＬＶ的囊膜糖蛋白Ｅ０基因,琼脂糖凝胶电泳表明其大小与预计相符。将扩增出的Ｅ０基因克隆到ｐＧＥＭＴ载体中,用自动序列分析仪对其进行序列测定。将测得的序列及推导的氨基酸序列与国外测得的Ｃ株相应序列进行比较,结果发现,它们之间核苷酸序列同源性为９９．０８％,氨基酸序列同源性为９８．４２％。     

猪瘟病毒石门株与兔化弱毒株gp55基因的克隆与序列分析

猪瘟病毒石门系强毒株及兔化弱毒疫苗株（ＨＣＬＶ株）是我国的标准毒株,囊膜糖蛋白ｇｐ５５（又称Ｅ１）是该病毒最重要的保护性抗原。本实验采用反转录ＰＣＲ扩增了这两个毒株的ｇｐ５５基因。序列分析结果表明：１．石门株和兔化弱毒株糖蛋白Ｅ１的氨基酸序列含有１５个半胱氨酸残基（Ｃｙｓ）,其数量及位置与国外４株猪瘟病毒（Ａｌｆｏｒｔ、Ｂｒｅｓｃｉａ、ＡＬＤ和ＧＰＥ＾－）完全一样。Ｅ１中Ｃｙｓ的数量及位置的保守性     

猪瘟病毒石门株NS4A基因的克隆,测序及分析

采用RT-PCR技术,利用一对引物,从感染猪血中成功扩增了猪瘟病毒强毒石门株NS4A基因,片段大小为757bp,与预期大小一致。克隆后经酶切鉴定,自动化测序。序列比较表明,该基因为最保守的基因之一,其中石门株序列与ALD,GPE,HCLV及Brescia株均有很高的同源性,由其推导的氨基酸的同源性高达100％。仅与Alfort株的同源性消低。对石门株序列与同属的BVDVSD－1株和NADL株序列进行了比较。     

风疹病毒毒株的分离鉴定及其E1基因部分序列分析

利用逆转录巢式PCR技术检测61例风疹高发人群的血液标本,经细胞培养技术从RV RNA阳性标本中分离风疹病毒株,应用细胞病变、血凝试验、电镜观察及PCR扩增等实验证实其为风疹病毒,命名为HRB株.同时还对该分离株的E1基因部分片段进行序列分析并与其它型别基因进行比较,结果显示,此分离株与中国疫苗株(BRDⅡ)及另外2株香港分离株均不在同一分支,而是位于由20世纪60年代分离株所构成的一个亚支上.     

齿兰环斑病毒外壳蛋白基因克隆及序列分析

齿兰环斑病毒外壳蛋白基因克隆及序列分析刘志昕潘俊松邵寒霜郑学勤（中国热带农业科学院热带作物生物技术国家重点实验室,海南儋州５７１７３７）关键词齿兰环斑病毒,外壳蛋白基因,序列分析兰花受病毒危害相当严重,齿兰环斑病毒（Ｏｄｏｎｔｏｇｌｏｓｕｍｒｉｎｇｓ...     

猪瘟病毒石门株特异cDNA片段的扩增与序列分析

以猪瘟病毒感染细胞中提取的细胞总ＲＮＡ为模板,应用反转录─聚合酶链反应,在化学合成的两对特异引物引导下,成功地扩增出了两个石门株的ｃＤＮＡ片段。电泳证明它们的大小与预计的３４６ｂｐ和１２０ｂｐ完全一致。酶切分析证实了它们应有的酶切位点。随后对这两个片段进行了克隆和序列测定,并与国外株的序列进行了比较。结果证明本实验扩增的两个ｃＤＮＡ序列与Ａｌｆｏｒｔ株和Ｂｒｅｓｉａ株的同源性分别是９５．２％和９８．５％。