Connexin31 相互作用蛋白筛选、证实与功能研究

筛选间隙连接蛋白 31 (connexin31 , Cx31) 相互作用蛋白并研究其在 Cx31 运输中的功能 . 运用制备的抗 Cx31 多克隆抗体免疫沉淀, SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,蛋白质条带回收,蛋白质胶块酶解,电喷雾 - 四极杆 - 飞行时间质谱分析,数据库扫描筛选可能相互作用蛋白,可能互作蛋白经免疫共沉淀、细胞免疫共定位等证实,确定 actin 为 Cx31 相互作用蛋白 . 用药物处理细胞,抑制 actin 的功能,观察 Cx31 定位与间隙连接通道的通透性,确定 actin 在 Cx31 运输中的功能 . 当药物抑制 actin 的功能时, Cx31 很少能到达细胞膜上形成间隙连接通道, Cx31 主要分布在胞质中;当药物抑制 tublin 的功能时, Cx31 能到达细胞膜上形成间隙连接通道,细胞免疫荧光实验显示间隙连接斑有增多的现象,但染料转移实验表明细胞膜上间隙连接通道并没有增加 . Actin 在 Cx31 运输至细胞膜上形成间隙连接通道的过程中具有重要作用 .     

免疫共沉淀筛选细胞内与A型流感病毒M2蛋白相互作用的蛋白

摘要：【目的】筛选细胞内与A型流感病毒M2蛋白（A/M2）相互作用的蛋白质。【方法】将A/M2编码序列插入真核表达载体pCAGGS-CFlag,重组质粒pCAGGS-CFlag-A/M2转染HEK-293T细胞,裂解细胞,以Flag单抗偶联的琼脂糖球珠免疫沉淀A/M2-Flag蛋白,清洗去除非特异性结合的杂蛋白后,SDS-PAGE银染法显示与A/M2共沉淀的蛋白,从胶上切下此蛋白条带进行质谱分析。【结果】成功构建了A/M2的表达质粒,免疫印迹证实了A/M2蛋白在293T细胞中能够表达,免疫共沉淀筛选到与A/M2结合的多种蛋白,分析质谱结果,确定ataxin 10和3个真核翻译起始因子(eIF)为候选蛋白。【结论】ataxin 10与A/M2相互作用为流感病毒感染或接种流感疫苗引发小脑性共济失调提供了解释,eIF与A/M2相互作用表明A/M2可能在调控病毒蛋白合成方面起重要作用。     

MAP法制备抗人Connexin31抗体

MAP（multiple antigenic peptide）多肽法具有快速、简便、成本低廉的特点．用MAP法,直接在多肽合成仪上合成Connexin31羧基端一个多肽片段（250—266AA）的MAP肽,经超滤器纯化后,免疫新西兰雄兔后采血检测、并纯化．经western blotting、细胞免疫荧光染色、免疫沉淀证实得到的抗体为抗间隙连接蛋白31的特异抗体．     

PML-C与GINS2蛋白相互作用的胞内验证

目的 通过胞内实验验证PML-C与GINS2蛋白之间的相互作用.方法 将诱饵蛋白质粒pGBKT7-PML-C和文库蛋白质粒pACT2-GINS2共转化AH109酵母菌,通过一对一的酵母双杂交技术验证两者在活细胞内的相互作用;构建pCMV-HA-PML-C及pCMV-Myc-GINS2真核表达载体并共转染人胚肾293细胞,利用免疫共沉淀技术验证二者之间的相互作用.结果 pGBKT7-PML-C诱饵蛋白质粒和pACT2-GINS2靶蛋白质粒共转化AH109酵母菌后,可见蓝色阳性克隆生长;pCMV-HA-PML-C及pCMV-Myc-GINS2真核表达载体构建成功,共转染293细胞,抗HA多克隆抗体沉淀与HA-PML-C相互作用的蛋白复合物后,用抗Myc单克隆抗体进行Western印迹检测,可以检测到Myc-GINS2蛋白.结论 利用酵母双杂交和免疫共沉淀技术在胞内验证了PML-C与GINS2间存在相互作用.     

NLS-RARα蛋白相互作用蛋白的筛选与验证

急性早幼粒细胞白血病(APL)具有特征性染色体易位,产生的PML-RARα融合基因在其发生发展中有重要作用．PML-RARα融合蛋白在细胞内被中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)切割为PML突变蛋白(核定位信号NLS缺失)和RARα突变体 (NLS-RARα,包含有PML的核定位信号),这两段蛋白质在APL的发生中可能具有重要作用．为进一步研究NLS-RARα的生物学功能,运用酵母双杂交技术在白血病cDNA文库中筛选与其作用的蛋白质．首先PCR技术扩增NLS-RARα编码序列,克隆至诱饵载体pGBKT7,测序鉴定后将其转化酵母AH109．免疫印迹检测到诱饵蛋白表达后,将含有诱饵载体的AH109与含有白血病cDNA文库的酵母Y187交配,在含有X-α-gal的营养缺陷性培养基上选择和筛选二倍体酵母．经回转实验和测序分析验证得到8个与NLS-RARα相互作用的蛋白质．为进一步验证这些相互作用,克隆其中的JTV-1蛋白,利用间接免疫荧光,GST pull-down和免疫共沉淀技术成功验证了它与NLS-RARα的相互作用．为进一步探讨APL的发生机制提供了新的线索．     

血管生成素相互作用蛋白的发现及其在哺乳动物细胞中的验证

通过RT-PCR从人外周血白细胞中钓取血管生成素(angiogenin,Ang)cDNA,构建诱饵蛋白载体pAS-2-1-Ang,对其自身转录激活活性进行鉴定后,通过酵母双杂交系统筛选人肝细胞cDNA文库,获得两个双阳性克隆.序列分析和同源检索表明所获候选蛋白分别为人上皮细胞素和λ晶体蛋白.构建Ang及候选蛋白标签融合表达载体并共转染COS-7细胞,利用免疫共沉淀和蛋白质印迹方法在哺乳动物细胞中验证了Ang与候选蛋白间的相互作用.为阐明Ａng促血管新生的分子机制创造了条件.     

凋亡蛋白和Nmi的相互作用及作用位点的筛选鉴定

为研究来源于鸡贫血病毒的小分子蛋白质———凋亡蛋白 (apoptin)诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制 ,利用酵母双杂交系统从人白细胞cDNA文库筛选凋亡蛋白相互作用蛋白质 ,核苷酸序列分析及同源性检索表明 ,其中一个约为 1.2kb的克隆与Nmi(N Mycinteractionprotein)高度同源。细胞免疫共沉淀实验结果显示 ,在哺乳动物细胞水平仍能够检测到凋亡蛋白与全长Nmi的特异相互作用。利用构建好的分别缺失C端 11个氨基酸、中间 33～46位氨基酸和二者均缺失的 3个凋亡蛋白突变体进行相互作用位点研究 ,结果表明凋亡蛋白的 33～ 46位氨基酸(核外运信号 )对于凋亡蛋白与Nmi的相互作用是必需的 ,而C端核定位信号 /DNA结合序列对于凋亡蛋白与Nmi的相互作用不是充分必要的     

非肌肉肌球蛋白ⅡA的相互作用蛋白研究进展

非肌肉肌球蛋白ⅡA(NMⅡA)是肌球蛋白超家族的成员之一,其生物学功能已引起国内外学者的广泛重视。研究发现,NMⅡA可作为分子马达为细胞内分子运动提供动力;还可通过与其他蛋白质发生相互作用而参与细胞黏附与迁移、细胞吞噬、胞质分裂等多种生理病理活动。本文综述了与NMⅡA存在相互作用的蛋白质及其产生的生物学效应,以期为全面了解NMⅡA的生理病理功能,深入探讨肿瘤等重大疾病的发病机制及新药研发提供一定线索和依据。     

从人白细胞cDNA文库筛选凋亡素相互作用蛋白

来源于鸡贫血病毒的小分子蛋白-凋亡素(apoptin)能够选择性诱导肿瘤细胞凋亡,为研究其选择性诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制,利用酵母双杂交系统筛选从人白细胞cDNA文库筛选apoptin相互作用蛋白,核酸序列分析及同源性检索表明,其中一个与ABP280（actin-binding protein 280）有高度同源性.细胞免疫共沉淀实验结果显示：在哺乳动物细胞水平仍能够检测到apoptin与ABP280片段的特异的相互作用.分别构建缺失C端11个氨基酸、中间33～46位氨基酸和二者均缺失的apoptin的3个突变体, 突变体与ABP280相互作用研究表明：apoptin的33～46位氨基酸（核外运信号）对于apoptin 与ABP280的相互作用是必需的,而C端核定位信号/DNA结合序列对于apoptin 与ABP280的相互作用不是充分必要的.     

与TaFRA蛋白相互作用候选蛋白的筛选

F-box蛋白是E3泛素连接酶SCF复合体的重要亚基, 通过底物蛋白的特异识别发挥功能。TaFRA是在盐胁迫差异表达片段基础上通过RACE方法获得的一个基因, 编码F-box蛋白。文章利用TaFRA基因构建诱饵表达载体, 直接用cDNA+pGAD+pBD共转化酵母双杂交的方法筛选相互作用的候选蛋白。通过对阳性克隆的鉴定和测序分析, 共获得44个与TaFRA相互作用的候选蛋白, 其中32个为已知蛋白, 包括硫氧还蛋白、金属硫蛋白、ATP合成酶及丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶等多种逆境胁迫反应蛋白及转录因子蛋白, 说明TaFRA与胁迫反应相关, 可能通过对上述蛋白编码基因的调控参与了植物的胁迫反应过程, 为进一步阐明TaFRA的功能及作用机制奠定了理论基础。     

人NIRF蛋白与HBV核心蛋白相互作用的初步研究

人NIRF蛋白在细胞内是否能与HBV核心蛋白发生相互结合,目前尚不清楚.构建pcDNA3-HBC质粒,采用基因共转染和共表达技术,在真核细胞内进行NIRF与HBc的免疫荧光共定位实验,并通过免疫共沉淀实验进一步验证两种蛋白是否发生相互结合.结果表明在细胞内,NIRF能与HBc发生相互结合.     

草鱼呼肠孤病毒NS31蛋白在昆虫细胞中表达及互作多肽筛选

草鱼呼肠孤病毒(Grasscarpreovirus,GCRV)是引发病毒性草鱼出血病的主要病原.前期研究证实GCRV-S7基因片段编码NS31蛋白是GCRV的非结构蛋白,在病毒感染的中后期表达.为深入开展NS31的具体生物学功能,本研究从GCRV-JX01株病毒基因组中扩增NS31,克隆至pFastBacHTA载体;利用杆状病毒Bac-to-Bac系统成功表达携带his标签的重组蛋白his-NS31;Western-Blot和IFA实验表明重组杆状病毒能够感染昆虫细胞(Sf9)表达NS31,进一步通过his-Ni2+柱纯化NS31,SDS-PAGE鉴定蛋白约为30KD.运用噬菌体展示技术筛选噬菌体12肽库,研究NS31特异性结合多肽.挑取30个克隆进行DNA序列测定,结果表明NS31主要和2种多肽分子相互作用.进一步结合生物信息学分析表明上述多肽与草鱼基因组中6个基因具有同源性,提示其可能是NS31互作蛋白.本研究为深入探索NS31在病毒感染过程中的生物学功能奠定了重要基础.     

酵母双杂交筛选人乳腺cDNA文库中与Gankyrin相互作用的蛋白

目的：应用酵母双杂交技术,筛选与Gankyrin有相互作用的蛋白质。方法：应用酵母双杂交系统,以Gankyrin基因全长为诱饵,在人乳腺cDNA文库中筛选能与Gankyrin相互作用的蛋白质,并运用营养缺陷型培养基和X-α-Gal等实验提供的信息,筛除假阳性克隆。结果：以Gankyrin为诱饵筛选出了5个阳性克隆,对其中一个蛋白质RhoGDI2与Gankyrin进行了免疫共沉淀与GSTpull-down实验验证,证实了它们的相互作用。结论：Gankyrin能与RhoGDI2发生相互作用,在此基础上,可以开展Gankyrin调控肿瘤发生机制的研究。     

转录因子AP-2β与SLP-2的蛋白相互作用

AP-2β是转录因子AP-2家族中的重要一员.AP-2是一个与哺乳动物的发育、细胞生长、分化、凋亡和肿瘤发生都有密切联系的重要的转录因子家族.最近的研究表明,AP-2能通过与其他蛋白的相互作用来调控AP-2下游基因的转录活性.采用免疫共沉淀结合质谱鉴定的方法筛选与AP-2β相互作用的蛋白.结果筛选到Stomatin like protein2(SLP-2)蛋白可能与AP-2β相互作用.免疫共沉淀实验证实外源过表达和内源的SLP-2蛋白都能与AP-2β蛋白相互作用.而且,细胞免疫荧光实验发现外源表达的Myc-AP-2β蛋白与内源的SLP-2蛋白在MCF-7细胞的胞质中有共定位.此外,免疫印记实验结果表明过表达SLP-2能上调AP-2β的蛋白水平,这就表明SLP-2与AP-2β相互作用后,SLP-2可能使AP-2β蛋白更稳定.这些研究结果为进一步研究这两个基因的功能提供了新的切入点.     

人类间隙连接蛋白β-5基因的克隆、表达及突变分析

利用同源筛选与巢式PCR的方法克隆了编码人类间隙连接蛋白b -5的基因GJB5,确定了基因组结构,FISH将其定位于1p33-p35.经RT-PCR分析,GJB5在胎儿皮肤、成人皮肤、胎盘中有表达.采用直接测序的方法对142个感觉神经性听力下降患者及36个其他遗传性疾病家系(5个变异性红皮肤角化病家系,13个Charcot-Marie-Tooth病家系,4个上睑下垂家系和14个视网膜色素变性伴耳聋家系)患者进行了GJB5的突变分析.在两个感觉神经性耳聋患者(M1883,M1589)中发现了两种错义突变(686A→G,H229R;25C→T,L9F);在3个遗传性听力下降的耳聋家系中发现了一种位于内含子剪接受体位点的18 bp的杂合缺失,其中一个家系(娄底家系)中伴有一种错义改变(R265P),18 bp的杂合缺失和错义改变在家系中均不与突变共分离.对缺失携带者进行RT-PCR分析,未能在皮肤组织中发现任何异常的mRNA,mRNA的表达量也未见明显异常.群体分析时发现,199个正常人中有两例此18 bp缺失的携带者.     

宿主细胞内SARS-CoV N蛋白相互作用蛋白的筛选与鉴定

SARS-CoVN蛋白可与病毒RNA形成复合物,也可与病毒或宿丰细胞中多种蛋白质相互作用,影响宿主细胞的多个信号转导通路,干扰宿主细胞的细胞周期,从而改变宿主细胞的生命活动.利用酵母双杂交技术筛选了15个宿丰细胞内与SARS-CoVN蛋白的相互作用蛋白,其中包括信号传导组分7种,蛋白激酶3种,细胞因子2种,未知功能蛋白3种.并利用免疫共沉淀方法进一步证实了趋化因子CXCL16是宿主细胞与SARS-CoV核衣壳蛋白的相互作用蛋白.     

乙肝病毒X与Tab1蛋白相互作用的体内外验证

目的:借助实验室前期质谱分析技术和数据分析研究基础,采用免疫共沉淀(Co-IP)和蛋白质沉降实验(GST pull-down)验证HBV X蛋白与Tab1蛋白的相互作用,为进一步研究HBx在HBV慢性感染致癌机制中的作用提供一定的实验依据。方法:成功构建pGEX-2TK-GST-HBx质粒,对GST-HBx融合蛋白进行诱导表达,与GST-beads结合孵育,构建pcDNA3.1/myc-His(-)BTab1,转染293T细胞使其表达,然后GST pull-down体外试验验证二者的相互作用;构建pcDNA3.1/myc-His(-)B-Tab1和pcDNA3.1-3×flag-HBx真核表达质粒,共转染293T和HepG2细胞使其表达,通过Co-IP实验验证抗Myc抗体可以将HBx从细胞裂解液中沉淀下来,证实了它们在两种细胞系中存在相互作用。结果:显示了HBx和Tab1在体内外条件下能够发生相互作用,为进一步明确HBV X蛋白功能及作用机制奠定基础。     

α－苦瓜子蛋白晶体结构中的次级相互作用的研究Ⅱ疏水相互作用的分析

α－苦瓜子蛋白结构模型中共有疏水残基１４１个,占践基总数的５７％。其中１２８个疏水残基有相互作用,占疏水残基的９１％。疏水残基之间的相互作用与其是否在α－螺旋或β片层内没有多大关系。本文着重分析了α－螺旋间和α螺旋与β结构之间的疏水相互作用;讨论了α５和大β片层中疏水残基与亲本残基的分布特点,这一特点对该蛋白分子最后折叠成特定的空间结构有重要影响。类似的情况在同源蛋白天花粉蛋白中也是存在的。     

脑红蛋白与Na^＋，K^＋-ATP酶β2亚基的相互作用及作用位点的鉴定

为研究神经系统特异性携氧蛋白———脑红蛋白 (NGB)保护神经元耐受缺氧损伤的分子机制 ,利用酵母双杂交系统从人胎脑cDNA文库中筛选与其有相互作用的蛋白质。序列分析表明 ,其中一个克隆的编码产物与Na ,K ATP酶 β2亚基 (NKA1b2 )序列一致。随后采用PCR方法从人胎脑cDNA文库中扩增获得NKA1b2全长cDNA。蛋白质结合实验表明 ,原核表达的NGB与体外转录翻译得到的NKA1b2在细胞外有结合作用。免疫共沉淀实验证明二者在生理条件下能够以复合物的形式存在。利用NGB系列短截体研究相互作用的位点发现 ,NGB蛋白N末端 1～ 75位氨基酸可与NKA1b2结合 ,但结合力很弱 ,而其C末端 75个氨基酸则与NKA1b2无结合作用 ,由此推测NGB蛋白整体的三维结构是结合所必需的。     

酵母双杂交筛选类固醇激素合成急性调节蛋白的相互作用蛋白质

目的:利用酵母双杂交技术筛选人肝cDNA文库中与类固醇激素合成急性调节蛋白(STAR)相互作用的蛋白质。方法:将全长STAR基因克隆到酵母表达载体pDBLeu中,形成诱饵;将构建好的诱饵质粒转化至AH109酵母感受态中,利用酵母双杂交技术筛选人肝cDNA文库中与其相互作用的蛋白质,并进行相互作用的回转验证。结果:构建了酵母诱饵蛋白表达质粒pDBLeu-STAR,并筛选到6个猎物,其中有5对相互作用回转验证阳性。结论:为进一步研究STAR的功能和作用机制提供了新的线索。