α-苦瓜素基因的克隆和原核表达

α-苦瓜素(Alpha-momorcharin)是一种多功能核糖体失活蛋白,具有抗肿瘤、抗HIV-1和抗菌活性,并同时具有免疫抑制活性.利用PCR(polymerase chain reaction)技术从苦瓜基因组中扩增出了成熟的α-苦瓜素蛋白基因,并亚克隆到表达载体pET28a( )上,然后分别在BL21(DE3) 和RosettaTM(DE3)pLysS中进行表达.结果表明只在RosettaTM(DE3)pLysS中,重组α-苦瓜素基因能成功地表达出33 kD大小的重组蛋白,而且在18℃和22℃的温度下,经IPTG诱导后,能成功地表达出大量可溶性重组蛋白.利用重组蛋白的N末端带有的6×His 标签,通过Ni-NTA柱纯化获得了α-苦瓜素重组蛋白.Western杂交实验表明,纯化后的重组蛋白可与鼠抗His-Tag单克隆抗体发生特异性反应.α-苦瓜素重组蛋白的获得为进一步系统研究和改造其功能与活性奠定了基础.     

淋巴因子和干扰素

8803了4在大肠杆菌中表达的重组体人刀-干扰素的纯化〔英〕/Lin,L.S.…了Metho-ds Enzymol一1956,229一183一192〔译自CBA,1987,(4),1676〕 重组体人户干扰素和结构类似物(在该结构类似物中丝氨酸取代了在第17位上的半胧氨酸)是疏水性的,只有在有离子型去垢剂如SDS的情况下是可溶性的。因此,在有SDS的情况下进行纯化,用2一丁醇酸的沉淀作用来萃取,并在SephaerylS一200和SephadexG一75上层析。(马亚敏)880375大规模生产人淋巴母细胞干扰案〔英〕/Phillips,八.W.…了Methods Enz-ymol一1986,119一35一35〔译自CBA-1987,(4),1749〕 …     

项目推介

重组人甲状旁腺素PTH(1-84)由重庆科润生物医药研发有限公司自主研制的重组人甲状旁腺素PTH(1-84)系治疗用生物制品一类,已获一项专利授权ZL00133573.1,并获临床批件:2007L1219。重组人甲状旁腺激素(1-84)是冻干粉针剂,用于治疗骨质疏松症,特点及优势表现为:(1)具有显著的骨同化作用,可增加骨量。目前临床广泛应用的抗吸收治疗无此效应,因此,对重度骨质疏松症的治疗尤为有利。(2)副作用小于rhPTH(1-34)。rhPTH(1-84)人体内发挥生理作用的PTH氨基酸序列完全一致。在国外所进行的临床前研究中发现rhPTH(1-34)有致大鼠骨肉瘤样毒性,而…     

藻胆体核亚基ApcD定点突变及体内重组功能研究

在对Anabaena sp.PCC7120藻胆体核亚基ApcD结合色素PCB的体内重组中,发现色素蛋白在提纯前后最大吸收峰和荧光峰发生了红移,从提纯前的605nm及633nm变为提纯后的650nm及665nm.为了研究该现象的原因,构建了ApcD的8个突变体,重组结果显示:突变体ApcD(Y88I)色素蛋白在提纯后的吸收光谱和荧光光谱较提纯前均多出一个峰,分别为668nm,690nm;ApcD(W59Q)、ApcD(Y73A)、ApcD(W87E)色素蛋白在提纯前后的吸收光谱和荧光光谱一致;ApcD(M126S)、ApcD(Y116S)、ApcD(M160T)色素蛋白在提纯前后的吸收光谱一致,而提纯后的荧光峰位置较提纯前分别红移了5nm、7nm和10nm;ApcD(M115I)色素蛋白在提纯前后的吸收光谱和荧光光谱均发生了红移,从提纯前的605nm和633nm变为提纯后的638nm和655nm.这些色素蛋白在酸性尿素溶液变性条件下的最大吸收峰始终在662nm,表明辅基色素仍然是藻蓝胆素;在对PCB-ApcD、PCB-ApcD(Y116S)及PCB-ApcD(M160T)的圆二色谱分析发现,该两个氨基酸的突变均...     

淋巴因子和干扰素

910878 天然的人干扰素-ω-1的提纯和特性;信号肽酶的2个交替切割位点[英]/Bender/Adolf.G.R.…// J.Biol.Chem.-1990,265(16).-9290～9295[译自DBA,1990,9(15),90—08730]由Sendai病毒诱导的人周缘血白细胞、用对磷酸盐缓冲的生理盐水透析和用单克隆抗体OMG-4、CNBr活化的Sepharose-4B免疫吸附剂层析法提纯了人     

亲和层析法分离纯化猪肺血管紧张素转换酶

亲和胶合成实验以双环氧化合物1,4-丁二醇-2-缩水甘油醚(1,4-butanediol diglycidyl ether)为活化体及连接臂,在硼氢化钠(NaBH)存在的碱性条件下,将载体Sepharose CL―4B与雷诺普利(lisinopril)共价连接在一起,成功合成亲和层析胶,并利用亲和层析胶对猪肺血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme, ACE）进行分离提纯.猪肺组织匀浆经1.6～2.6 mol/L硫酸铵分级沉淀、透析平衡、亲和柱分离等步骤,从200 g猪肺中提纯得到0.79 mg ACE蛋白,酶活力回收11.9％,比活力38.8 U/mg.与层析前的酶液比较,亲和层析一步提纯可达264倍;与肺匀浆液比较提纯达808倍.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳可见,提纯的猪肺ACE为一条带,分子质量约为180 ku.     

《重组DNA产物》

该书分十一个部分:①重组DNA技术:分离、克隆及其基因表达;②从生长激素抑制素到人类胰岛素;③酵母;外源蛋白生产时的另一种微生物;④人干扰素的基本知识⑤对来自人干扰素重组DNA生物学特性的临床前景的估价;⑥由细菌产生的人α干扰     

Cetus公司对第三种遗传工程蛋白质进行试验

Cetus 公司宣布开始进行人肿瘤坏死因子(TNF)的临床试验,肿瘤坏死因子是从人免疫系统提取的一种蛋白质,在治疗某些癌症方面可能证明是有用的。肿病坏死因子是 Cetu公司开始对人进行试验的第三种治疗蛋白质。其它两种蛋白质是前白细胞素(R)(人重组体白细胞间素-2)和 BETASERON(R)(人重组体β干扰素)。Cetus 公司生产的肿瘤坏死因子是应用先进的基因工程技术生产的肿瘤坏死因子的类似     

人线粒体转录终止因子3基因RNA干扰表达载体的构建筛选与干扰效果评价

目的:构建人线粒体转录终止因子3(MTERF3)基因的短发夹RNA(shRNA)干扰表达载体,并在mRNA和蛋白质水平对其干扰效率进行验证,以检测和筛选出干扰效率最优的shRNA表达载体。方法:根据人MTERF3基因全长cDNA序列,利用Oligoengine在线软件设计4个shRNA序列,合成4条互补寡核苷酸链,退火成双链后克隆至psiU6.1载体,得到4个重组干扰质粒psi-MTERF3-1～psi-MTERF3-4,并通过PCR和DNA测序对其进行鉴定;将重组干扰质粒利用脂质体介导瞬时转染He La细胞,转染48 h后采用real time RT-PCR检测4个干扰质粒对MTERF3 mRNA表达水平的影响,采用Western印迹检测其对MTERF3蛋白表达水平的情况,并筛选出最有效的shRNA干扰质粒。结果:PCR鉴定和DNA测序鉴定证实重组质粒中已插入目的DNA序列;real time RT-PCR和Western印迹结果表明4个重组载体均可以显著降低人MTERF3基因mRNA和蛋白质的表达水平(P0.05),其中以pSi-MTERF3-4的干扰效率最优,对MTERF3 mRNA表达的抑制率为70.1%,对MTERF3蛋白表达的抑制率为72.2%。结论:在人宫颈癌He La细胞系筛选出有效干扰MTERF3基因表达的shRNA序列,构建了针对MTERF3基因的RNA干扰真核表达载体且能够有效抑制目的基因的表达,为进一步研究人MTERF3在宫颈癌发生发展中的作用机制提供了实验基础。     

淋巴因子和干扰素

由大肠杆菌得到了N一末端含Cys--Tyr一Cys的纯的重组体人干扰素-y(r IFN一y).这种重组蛋白在SDS一PAGE上出现两条泳动速度很相近的电泳     

人ANKRD49基因真核表达载体的构建及其功能的初步研究和RNA干扰靶点的鉴定

目的: 克隆人ANKRD49基因并构建其真核表达重组体,利用构建成功的ANKRD49真核表达重组体对其进行功能的初步研究,并筛选和鉴定其RNA干扰靶点. 方法: 提取人肺腺癌细胞株A549总RNA,逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)对ANKRD49进行扩增,扩增产物与真核表达载体p3×Flag-CMV-14同时进行双酶切,酶切产物连接后转化入感受态细胞Top10,阳性重组质粒p3×Flag-CMV-14/ANKRD49经菌液PCR、双酶切和测序鉴定正确后,用脂质体法(Lipofectamine^TM 2000)转染人胚肾细胞(HEK 293T),免疫印迹(Immunoblotting)和免疫荧光技术检测表达产物.免疫荧光法检测ANKRD49在宿主细胞内的定位.MTT法检测ANKRD49对宿主细胞的增殖作用.设计并合成针对人ANKRD49基因的RNA干扰靶点序列,与p3×Flag-CMV-14/ANKRD49共转染HEK 293T细胞后,Immunoblotting鉴定ANKRD49的RNA干扰靶点. 结果: RT-PCR结果显示,从A549细胞中扩增出约720 bp的片段.菌液PCR、双酶切及测序结果显示重组质粒p3×Flag-CMV-14/ANKRD49构建成功且序列正确.免疫荧光和Immunoblotting结果显示,在转染p3×Flag-CMV-14/ANKRD49的细胞中有ANKRD49的表达,蛋白质相对分子质量(Mr)约为27kDa,而转染空质粒组未见表达.MTT结果显示,ANKRD49对细胞增殖没有影响.共转染实验结果显示,1号和4号RNA干扰序列可以有效降低人ANKRD49的表达. 结论: 成功构建了真核表达重组体p3×Flag-CMV-14/ANKRD49,该蛋白质位于细胞核,不参与细胞增殖;同时鉴定出该基因的2个有效干扰靶点,为进一步研究其功能奠定了基础.     

一种食用菌提取物y3对烟草花叶病毒的钝化作用及其机制

测定了从食用菌毛头鬼伞(Coprinus comatus)中提纯的y3蛋白对烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)的钝化作用,结果表明y3对TMV有较强的体外钝化作用,在心叶烟枯斑寄主上对TMV的抑制中浓度约为2.0μg/mL;y3在pH9.0时较稳定;TMV与y3混合后用RNase处理,测得侵染率为61.74%,比未用RNase处理的对照降低了38.26%,说明y3具有一定的体外脱衣壳作用;另外电镜观察发现y3可使部分TMV粒体发生裂解,变短.     

疫苗

891283用化学亲和柱层析法分离提纯含乙型肝炎表面抗原的pre一52〔英万Lin,J.Y.…了Appl,Bioehern.Biotechnol一19吕7,15(3)。一255一263〔译自DBA,2988,7(15),88一08895〕 需要快速而有效的分离纯化乙型肝炎表而抗原(HBsAg)的多肤p31和p68,可用重组DNA技术来生产这些多肤。从人血清蛋白制备多体人血清蛋自(P HSA),透析后在Sepharose4B往上纯化。交联pHSA和活化的Sep}iafose续B,制备pHSA一Sepha,,05。4B(pHSA一S一4B)亲和柱。HBsAg慢性携带者的血浆单独离心,以硫酸按分部。透析HBsAg沉淀物,过羚磷灰右柱,再使HJBsAg荆一!…     

Micro-CT观察重组人甲状旁腺素在骨折愈合过程中的作用

目的使用Micro-CT,探讨重组人甲状旁腺激素(rh PTH)在2月龄雄性大鼠骨折愈合过程中的作用。方法应用2月龄雄性SD大鼠建立单侧闭合性股骨骨折内固定模型,随机分为甲状旁腺素治疗组和对照组,术后分别皮下注射重组人甲状旁腺素(1-34)10μg/(kg.d)或等剂量生理盐水安慰剂(对照组),分别于术后第2、7、14、21和42天取双侧股骨标本,分别行X线检查和Micro-CT观察,并进行骨结构的定量分析。结果术后第21天,甲状旁腺素组骨折断端两侧的骨痂之间连续性良好,骨折线已模糊不清。甲状旁腺组较对照组,在术后第42天骨体积(bone Volume,BV)、骨体积分数(BV/TV)、骨密度(bone mineral density,BMD)和骨小梁模式因子(trabecular bone pattern factor,Tb.Pf)明显高于对照组;而骨小梁分离度(trabecular separation,Tb.Sp)和各向异性的程度(degree of anisotropy,DA)低于对照组。结论低剂量重组人甲状旁腺激素可提高大鼠骨折BV、BV/TV、Tb.Pf和BMD而降低Tb.Sp和DA,从而促进骨折的愈合。     

淋巴因子和干扰素

863322?一千扰素克隆和表达的载体及其转化的细菌和制备过程〔专,法〕/S。。rmoyer,P.…了European Patent Appl.EP01遵6462.Pub,26,06.55,APpl.FR 8319777,filed 09.12.83〔译自CBA, 1985,(9),3045〕 只翻译了该文的题目。(邓永鸿) 863323重组的,一干扰素,有关重组DNA 以及含这些千扰素的药物〔专,英万Gray,P .W‘.…了European Patent Appl.EP 0146354.Pub.26.06.85。Appl.US 562009, filed 16.12.83〔译自CBA,1985,(9), 3046〕 该专利披露了一些新的、稳定的重组v-千扰素,其在人体内显示有一定程度的抗病毒和抗增生活性,还…     

燕麦嗜酸菌鞭毛素的提纯及其活性检测

为阐明燕麦嗜酸菌(Aaa)鞭毛素作为一种病原相关分子模式(PAMP)诱导水稻免疫反应(PTI)的作用机理,采用机械震荡、丙酮沉淀以及离子交换层析进行了蛋白提纯,并用DAB染色法对其诱导水稻产生H2O2的能力进行了测定。结果表明,上述提纯方法的组合使用有效地提纯了分子量约为45 kD的鞭毛素,经浸润接种处理后诱导了水稻叶组织H2O2的产生。因此,Aaa鞭毛素提纯蛋白可用于后续的水稻PTI机理分析。     

水蛭素抑制人脐静脉内皮细胞基质金属蛋白酶-2的生成及活化

研究凝血酶对人脐静脉内皮细胞表达基质金属蛋白酶的影响及重组水蛭素的作用。将原代培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的第2～5代分组后与凝血酶(4．0ku／L)共同温育,同时分别加入水蛭素(6．0ku/L)和肝素(6．0ku／L),在不同时间,用逆转录聚合酶链反应和免疫组织化学分析的方法评价基质金属蛋白酶-2的表达情况。结果显示凝血酶促进血管内皮细胞产生和活化基质金属蛋白酶-2。重组水蛭素可以有效地阻断凝血酶的上述作用。     

大肠杆菌中融合表达人β防御素-3基因的研究

目的 为了在大肠杆菌中融合表达人β防御素-3基因。方法 根据大肠杆菌对精氨酸密码子使用的偏爱性,设计搭桥引物,并通过PCR扩增法合成了人β防御素的全基因序列,克隆进pGEX-4T-2中构建pGEX-4T-2-hBD-3融合表达载体。将表达载体转化E.coli宿主菌DH5α,进行IPTG诱导表达。将菌体反复冻溶使细胞膜穿孔,释放可溶性蛋白。融合蛋白GST-hBD-3经凝血酶切割。结果 研究得到了重组人防御素蛋白,琼脂孔穴扩散抑菌法检测表明,重组人β防御素3对金黄色葡萄球菌有抗菌活性,抑菌效价为0.843 U。结论 人β防御素-3基因在大肠杆菌中得到了融合表达。     

E1 Tor生物型霍乱弧菌溶血素的遗传和生物化学的研究

<正> 以前,我们从E1 Tov生物型OI群霍乱弧菌提纯了溶血素,发现这是一种分子量为60000的蛋白,它与非OI群霍乱弧菌溶血素在生物学、物理化学和免疫学上都难以区别之。