碳青霉烯类耐药弗劳地枸橼酸杆菌耐药及毒力基因的分析

目的对临床分离的碳青霉烯类耐药弗劳地枸橼酸杆菌(carbapenem resistant Citrobacter freundii, CRCF)进行耐药及毒力基因分析,为控制CRCF感染提供依据。方法收集昆明医科大学第一附属医院2016年1月至2017年12月22株CRCF,通过VITEK2 Compact系统对菌株进行细菌鉴定及药敏试验,用PCR检测菌株耐药及毒力基因的携带情况。结果药敏结果显示,菌株对青霉素类、头孢菌素类及碳青霉烯类抗生素的耐药率均为100%,对氨曲南、环丙沙星、左氧氟沙星、庆大霉素、四环素、复方新诺明及呋喃妥英等抗生素呈现出不同程度的耐药;22株菌株耐药基因检测结果显示,KPC-2、IMP、NDM-1、TEM、SHV和CTX等阳性率分别为27%、32%、82%、82%、23%和27%,携带2种或以上耐药基因的阳性率为91%;18株菌株毒力基因检测结果显示,ureA、wabG、ycf和uge等阳性率依次为41%、23%、14%和14%,未检测到IroN、allS、KfuB、iutA、ybtS、VatD及fimH等毒力基因。结论该院CRCF碳青霉烯类耐药性主要由NDM-1基因介导,而其毒力主要与脂多糖相关,多重耐药毒力强的CRCF应引起临床高度重视。     

一株弗劳地枸橼酸杆菌中检出新ampC基因

目的探讨1株耐亚胺培南弗劳地枸橼酸杆菌的耐药机制。方法采用浓度梯度法（Etest）检测对抗菌药物的最低抑菌浓度（MIC）。通过金属酶初筛试验（协同法）检测金属酶;改良Hoged试验检测碳青霉烯酶;头孢西丁三维试验检测AmpC酶;聚合酶链反应（PCR）检测耐药基因;DNA测序决定基因型;接合试验检测耐药基因的转移性。结果弗劳地枸橼酸杆菌临床分离株NC118对亚胺培南的MIC为〉16μg/ml,金属酶初筛试验阴性,Hoged表型确证试验碳青霉烯酶阳性,AmpC酶阳性,PCR扩增及测序显示含有blaKPC-2、blaAmpC基因,该菌株所产AmpC酶基因与CMY-45型AmpC酶（GenBank：ACU00152.1）比较有5个氨基酸发生了改变,该blaCMY-2-like基因为一个新型的AmpC酶基因。结论在弗劳地枸橼酸杆菌中发现一种新的ampC基因（blaCMY-49）。     

住院病人感染枸橼酸杆菌临床分布及其耐药性分析

目的:调查我院院内枸橼酸杆菌的临床分布特点,产生高活性β-内酰胺酶情况及其耐药性.方法:对2001年6月～2002年12月间临床分离的43株枸橼酸杆菌分析,采用改良三维试验方法检测其β-内酰胺酶表型,K-B法检测耐药性.结果:43株枸橼酸杆菌以弗劳地枸橼酸杆菌为主,主要分离于老年人痰标本.有4株产ESBLs阳性,3株同时高产AmpC酶和ESBLs.结论:产高活性β-内酰胺酶枸橼酸杆菌在我院内比较普遍.     

346株鲍曼不动杆菌临床分布及耐药率分析

目的了解鲍曼不动杆菌引起医院感染的特点以及对抗菌药物的耐药性的变化趋势。方法应用美国BD公司Phoenix^TM100全自动细菌和药敏系统鉴定仪对所分离的364株鲍曼不动杆菌进行鉴定和药敏试验,并进行统计学分析。结果 346株鲍曼不动杆菌来自痰液、伤口分泌物、中段尿、静脉血及大便,分别占58.96%、30.92%、5.49%、4.34%、0.29%。药敏结果显示鲍曼不动杆菌对多粘菌素和米诺环素敏感性最高,耐药率低于10.4%。结论加强鲍曼不动杆菌的耐药监测,了解其耐药性变迁,可合理指导用药,有效控制鲍曼不动杆菌耐药菌株的产生。     

人粪便中枸橼酸杆菌菌种分布特点

枸橼酸杆菌属 (Citrobacter )细菌又称柠檬酸杆菌 ,是人体及动物粪便中的正常菌群之一 ,也是水体污染的重要细菌学指标之一。近年来 ,由于分子细菌学的发展 ,枸橼酸杆菌属细菌由原来的 3个种进一步分类到目前 11个种。粪便作为枸橼酸杆菌的重要贮菌场所 ,对其中的菌种分布了解可增加我们对枸橼酸杆菌的认识。为此 ,我们对部分住院病人和食堂体检人员的粪便中枸橼酸杆菌进行生理生化分类鉴定 ,结果报告如下。1　材料与方法1.1　材料　粪便为随机选择的住院病人和食堂体检人员送检标本 ,共 2 6 1份。1.2　方法　将标本接种 S.S平板 ,35℃过…     

弗劳地枸橼酸盐杆菌基因种与小儿腹泻关系、耐药性的研究

从１４５７例腹泻患儿大便中分离出１６４株弗劳地枸橼酸盐杆菌复合群的菌株,而对照组中分离率仅４．２６％,具统计学差异。为探讨其致病性,采用不耐热性肠毒素,耐热性肠毒素基因探针,菌液直接ＬＴ－ＰＣＲ,家兔肠袢结扎和刚果红结合试验检测细胞的腹泻毒力因子,证实４７．１％的菌株产生ＬＴ,系腹泻重要毒力因子,不具侵袭性因子。     

弗劳地枸椽酸盐杆菌复合群基因种的生化鉴定

用Ｂｒｅｎｎｅｒ等的方法对从小儿腹泻大便中分离的４０株弗劳地枸椽酸盐杆菌进行基因种的鉴定和分析。７５％的细菌可被准确鉴定,共鉴定出４个基因种。弗劳地枸椽酸盐杆菌（Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉ）居首位（５６．７％）,依次为布拉基枸椽酸盐杆菌（Ｃ．ｂｒａａｋｉ）（２０．０％）,杨格枸椽酸盐杆菌（Ｃ．ｙｏｕｎｇａｅ）（１３．３）和沃克马尼枸椽酸盐杆菌（Ｃ．ｗｅｒｋｍａｎｉ）（１０．０％）     

用固定化弗劳地柠檬酸杆菌XP05从溶液中回收铂

比较了5种固定弗劳地柠檬酸杆菌XP05菌体的方法,其中明胶海藻酸钠包埋法为固定菌体的最佳方法。扫描电子显微镜观察表明,XP05菌体较均匀地分布于包埋基质中。固定化XP05菌体吸附Pt^4＋受吸附时间、固定化菌体浓度、溶液的pH值和Pt^4＋起始浓度的影响。吸附作用是一个快速的过程;吸附Pt^4＋的最适pH值为1.5;在50～250 mg P^4＋/L范围内,吸附量与Pt^4＋起始浓度成线性关系,吸附过程符合Langmuir和Freundlich吸附等温模型。在Pt^4＋起始浓度250 mg/L、固定化菌体2.0 g/L、pH 1.5和30℃条件下,振荡吸附60 min, 吸附量为35.3 mg/g。0.5 mol/L HCl能使吸附在固定化菌体上的Pt解吸98.7%。从废铂催化剂处理液回收铂的结果表明,在Pt^4＋起始浓度111.8 mg/L、固定化菌体4.0 g/L、pH 1.5和30℃条件下,振荡吸附60 min, 吸附量为20.9 mg/g。在填充床反应器中,在Pt^4＋起始浓度50 mg/L、流速1.2 ml/min、固定化菌体1.86 g的条件下,饱和吸附量达24.7 mg/g; 固定化XP05菌体经4次吸附解吸循环后吸附率仍达78％。     

临床分离嗜血杆菌的菌群分布及其耐药性分析

目的调查中山大学附属第一医院嗜血杆菌的临床分布及耐药性情况。方法按照标准方法分离嗜血杆菌并进行药物敏感试验及其检测：结果共分离出146株嗜血杆菌,嗜血杆菌对青霉素敏感率仅为14％,对氨苄西林、头孢克洛、头孢丙烯、莫西沙星、阿奇霉素的敏感率分别为77．9％,98．2％,98．2％,68．7％,98．3％。结论头孢克洛、头孢丙烯、阿奇霉素是治疗嗜血杆菌感染的有效抗生素,应加强对嗜血杆菌的培养及耐药性监测工作。     

连续11年深圳地区鲍曼不动杆菌感染的临床分布及耐药趋势分析

目的 了解医院鲍曼不动杆菌的耐药性变迁和临床分布特点,为合理应用抗菌药物和预防控制医院感染提供依据.方法 回顾性分析2001年1月到2011年12月临床标本中分离的l 613株鲍曼不动杆菌资料;用WHONET 5.4分析鲍曼不动杆菌的分离率和耐药率变迁.结果 鲍曼不动杆菌感染主要发生在ICU和呼吸内科,分别占43.89％和24.49％;痰标本所占比例最高(70.30％).鲍曼不动杆菌、多药耐药鲍曼不动杆菌的分离率及对临床常用的15种抗菌药物耐药率总体呈上升趋势;并且2009年呈飞跃式上升且2010和2011年居高不下,201 1年分离出泛耐药鲍曼不动杆菌,分离率高达57.55％.临床常用药氨苄西林/舒巴坦、头孢哌酮/舒巴坦和米诺环素近三年的耐药率和中介率也明显升高.结论 鲍曼不动杆菌的耐药形势严峻,多药耐药鲍曼不动杆菌和泛耐药鲍曼不动杆菌比例明显增加,重症监护病房和呼吸科是预防控制的重点科室.     

弗氏柠檬酸杆菌植酸酶的分离纯化及其酶学性质研究

从弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)中分离纯化了一种植酸酶并进行了酶学性质研究,其反应最适pH为4.0~4.5,最适温度为40℃,在37℃下以植酸钠为底物的Km值为0.85nmol/L,Vmax为0.53IU/(mg.min),具有较好的抗胰蛋白酶的能力。酶蛋白的分子量大小约为45kDa,成熟酶蛋白N端序列为QCAPEGYQLQQVLMM。     

单亲灭活柠檬酸杆菌与奇球菌原生质体融合

利用单亲灭活原生质体技术对柠檬酸杆菌和奇球菌原生质体进行了融合,考察了原生质体制备条件与融合中的影响因素。试验表明,随着溶菌酶浓度,酶解时间的增加和温度的上升,原生质体的形成率呈上升趋势,而再生率则逐渐下降。另外,正交试验结果表明,在PEG(6000)浓度40%、融合时间10min、融合温度42°C、pH值为8的条件下促融,最大融合频率可达2.74×10-7。筛选出来的融合子传代10次,性状稳定。进一步研究发现融合子在铀溶度为85mg/L时,比柠檬酸杆菌耐受性好;融合子和亲本吸附比较试验中,融合子总体吸附性能比柠檬酸杆菌略高。研究结果为耐辐射基因工程菌的构建提供了基础。     

Mutations in the gyrA and parC genes associated with fluoroquinolone resistance in clinical isolates of Citrobacter freundii

We determined partial sequences of the gyrA and parC genes of Citrobacter freundii type strain, and then examined 38 C. freundii clinical strains isolated from patients with urinary tract infections for the association of alterations in GyrA and ParC with susceptibility to fluoroquinolones. Our results suggest that in C. freundii DNA gyrase may be a primary target of quinolones, that an amino acid change at Thr-83 or Asp-87 in GyrA is sufficient to decrease susceptibility to fluoroquinolones, and that accumulation of changes in GyrA with the simultaneous presence of an alteration at Ser-80 or Glu-84 in ParC may be associated with the development of high-level fluoroquinolone resistance in C. freundii clinical isolates.     

弗氏柠檬酸菌甘油脱水酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

以弗氏柠檬酸菌（Citrobacter freundii）基因组DNA为模板,通过PCR得到甘油脱水酶（glycerol dehydratase）基因dhaB、dhaC、dhaE,克隆到表达载体pSE380上,得到重组质粒pSn-dhaBCE。将此重组质粒转化到E．coli JM109中,重组菌株SDS-PAGE结果显示有明显的61kD、22kD、16kD三条特异性蛋白条带出现。重组菌株经诱导表达,酶活力为11．59U／mL。     

弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定与PCR-SSCP分析

利用营养琼脂、MaC培养基从草鱼肠道中分离到3株细菌,暂时编号为TC-1、TC-2和TC-3,通过形态学观察、生理生化特征、药敏试验、动物试验、构建系统发育进化树及PCR-SSCP分析等系统鉴定,结果表明3株菌株均为弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）,其中TC-2菌株对小鼠、斑马鱼有致病性;3株杆菌均对头孢噻肟、头孢曲松、洛美沙星、诺氟沙星等多种药物敏感;系统发育分析表明,3株弗氏柠檬酸杆菌16S rDNA序列与DSM30039模式株同源性分别为99.59%、99.47%和99.53%,且位于系统发育树的同一分支;进一步采用V3区PCR-SSCP分析结果显示弗氏柠檬酸杆菌SSCP图谱中菌株间带型存在差异。     

Cloning of a haemolysin from Citrobacter freundii and its expression in phylogenetically related bacteria

Abstract The determinants for a haemolysin from an extraintestinal isolate of Citrobacter freundii have been cloned and expressed in both Escherichia coli K12 and phylogenetically related bacteria. Compared with E. coli , where the haemolytic determinants are encoded in 7.5 kb, the hemolysin determinants of C. freundii are located on a 2.5-kb Hin dIII fragment in the recombinant plasmid PJP71. Chicken embryo tests indicate that this haemolysin does contribute to the pathogenicity of C. freundii .     

弗氏柠檬酸菌dhaT基因的克隆表达、序列分析、酶的纯化及特性研究

1,3-丙二醇（1,3-propanediol,1,3-PD）是一种重要的化工原料,越来越受到广泛的关注。以弗氏柠檬酸菌(Citrobacter freundii)基因组DNA为模板,通过PCR得到1,3-丙二醇氧化还原酶(1,3-propanediol dehydrogenase,PDOR) 的基因dhaT,序列显示与来源于C.freundii DSM 30040 (Genbank U09771)相应基因的相似性为78%。将此基因构建于表达载体pSE380,得到重组质粒pSE-dhaT。重组质粒转化到宿主菌E.coli JM109中进行了表达,重组酶通过镍柱及Sephacral S-300进行纯化,重组酶SDS-PAGE结果显示有非常明显的单一的42kDa特异性蛋白条带出现。以丙醛为底物测定重组酶还原反应的最适温度为37℃、最适pH为8.0,对丙醛的Km值为10.05mmol/L,最大反应速度Vmax为37.27umol/ min /mg;以1,3-PD为底物测定重组酶氧化反应的最适温度为25℃、最适pH为10.5,对1,3-PD的Km值为1.28mmol/L,最大反应速度Vmax为25.55umol/min/mg。重组酶的还原反应比活为49.50U/mg,氧化反应比活为79.72U/mg。该酶同样具有假定的结合Fe2+的G-X-X-H-X-X-A-H-X-X-G-X-X-X-X-X-P-H-G模体保守结构。此研究为工程菌高效生产1,3-PD奠定了基础。