中国野生葡萄葛蘲叶绿体DNA质粒文库的构建

限制性内切酶ＢａｍＨＩ水解中国野生葡萄葛（ＶｉｔｉｓｆｌｅｘｕｏｓａＴｈｕｎｂ）的叶绿体ＤＮＡ（ｃｐＤＮＡ）,电泳分离为３４条带,最大为１１．７ｋｂ,最小为０．２３ｋｂ,分别用ｐＵＣ和ｐＢＲ３２２质粒克隆所得片段,转化大肠杆菌,并从转化菌中提取质粒ＤＮＡ,经酶切电泳分析证明含有葛ｃｐＤＮＡ经ＢａｍＨＩ水解的不同片段,从而构建了葛ｃｐＤＮＡ的ＢａｍＨＩ质粒文库。     

用PCR扩增和克隆鸡传染性贫血病毒全基因组DNA

根据已发表的序列,分别在鸡贫血病毒（ＣＡＶ）环形基因组ＤＮＡ（全长２．３ｋｂ）的ＥｃｏＲＩ位点和ＢａｍＨＩ位点的两侧选择适当序列合成两对引物,用ＰＣＲ技术,从斑点杂交检测到病毒核酸的ＣＡＶ感染的ＭＤＣＣＲＰ１细胞基因组ＤＮＡ中,分别扩增出包含ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ分割开的病毒基因组两部分（１．５ｋｂ和０．８ｋｂ）约１．５ｋｂ和约１．２５ｋｂ的两个片段。再将其中相应序列拼接克隆进ｐＵＣ１８载体,获得包含ＣＡＶ全基因组序列ＤＮＡ片段的克隆质粒ｐＣＡＶ２．４。酶切分析表明,该质粒具有预期的ＢａｍＨＩ位点、ＰｓｔＩ位点、ＨｉｎｄⅢ位点,而预期的ＥｃｏＲＩ位点消失。重组质粒插入ＤＮＡ片段的两端序列分析表明,质粒ｐＣＡＶ２．４是包含ＣＡＶ全基因组序列的重组质粒,插入ＤＮＡ片段序列中的ＥｃｏＲＩ位点序列发生了一个碱基突变。     

麦迪霉素4″—O—丙酰基转移酶（mpt）基因结构的研究

对含有麦迪霉素４″－Ｏ－丙酰基转移酶（ｍｐｔ）基因的ＢａｍＨＩ－ＢａｍＨＩ８．０ｋｂ的ＤＮＡ片段进行限制性酶切分析,绘制出了含有２１个酶切位点的限制性酶切图谱。以含有碳霉素异戊酰基转移酶基因（ＣａｒＥ）的２．４ｋｂ ＤＮＡ片段为探针,经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分子杂交,将ｍｐｔ定位于一个ＥｃｏＲＩ－ＥｃｏＲＩ－ＰｓｔＩ３．０ｋｂ的ＤＮＡ片段上,将该片段克隆至大肠杆菌／链霉菌穿梭质粒载体ｐＷＨＭ３     

人巨细胞病毒的分子克隆及其特异性DNA探针的制备

从人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）培养物中提取ＨＣＭＶ并抽提其ＤＮＡ,经限制性内切酶ＢａｍＨＩ完全消化后,与质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ－ＳＫ重组建立了ＨＣＭＶ的ＤＮＡ文库,从此文库。中随机筛选出两个重组质粒（ｐＣＭＶ－１和ｐＣＭＶ－２）,用ＢａｍＨＩ分析证明其中所含的病毒ＤＮＡ片段的大小分别为１．０ｋｂ和７．５ｋｂ,将这两种质粒大量扩增纯化后,用光生物素进行标记作为探针,证明其只与ＨＣＭＶ反应,与正常人细胞ＤＮＡ及Ⅰ型和Ⅱ型单纯疤疹病毒ＤＮＡ无交叉反应。     

生米卡链霉菌丙酰化酶基因定位及其核苷酸序列测定

我们已往的工作已经确定在重组质粒ｐＩＪＭ９中,生米卡链霉菌来源的４．１６ｋｂ插入ＤＮＡ片段带有丙酰化酶基因,为了进一步确定该基因在４．１６ｋｂ插入片段中的位置,我们以ＢａｍＨＩ对ｐＩＪＭ９进行酶切,在此基础上进行缺失重组亚克隆,在所获得的转化子中,Ｎｏ．５转化子含重组质粒ｐＩＪＭ９５,分子量为５．０ｋｂ,插入ＤＮＡ片段为０．５３ｋｂ,以Ｎｏ．５转化子对螺旋霉素进行生物转化实验,其转化产物经薄层层析     

具有真细菌基因启动子活性的盐生盐杆菌质粒DNA片段

利用大肠杆菌启动子探测质粒ｐＫＫ２３２－８为载体、用两组限制性内切酶ＢａｍＨＩ－ＳａｌＩ和ＨｉｎｄⅢ－ＳａｌＩ分别消化盐生盐杆菌Ｊ７（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｈａｌｏｂｉｕｍ）的质粒ｐＨＨ２０５,在体外进行重组,转化Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１感受态细胞,在含氨苄青霉素和氯霉素的选择平板上筛选转化子,并从随机挑选的２０株转化子中,获得抗氯霉素水平达到１１０μｇ／ｍｌ的转化子Ｔ１和Ｔ２,所含重组质粒分别被命名为ｐＪＨ和ｐＪＢ。经限制性酶切分析及杂交分析表明,ｐＪＨ质粒上插入了一段来源于ｐＨＨ２０５质粒的ＤＮＡ片段,其大小为８００ｂｐ左右。通过重新转化实验进一步表明,该ＤＮＡ片段在大肠杆菌中具有启动子功能,从而证明,在古细菌（盐生盐杆菌）的质粒ＤＮＡ中存在具有真细菌（大肠杆菌）基因启动子活性的ＤＮＡ片段。     

Bax基因cDNA的分子克隆研究

细胞编程死亡（ｐｒｏｇｒａｍｅｄｃｅｌｌｄｅａｔｈ）是细胞生理性死亡的一种主要形式。Ｂａｘ具有抑制细胞编程死亡的作用。本研究采用ＰＣＲ方法,从人肿瘤细胞ＨＬ—６０ｃＤＮＡ文库中扩增出若干个ｂａｘｃＤＮＡ片段,然后将它们分别与ＰＧＥＭ—Ｔ测序质粒载体连接,并转化到大肠杆菌ＪＭ１０９中去。用蓝／白法筛选重组菌落,经酶切分析及ＰＣＲ鉴定,获得了插入片段大小约为０．４ｋｂ及１．１ｋｂ的ＢａｘｃＤＮＡ重组质粒ＰＢａｘｌ和ｐＢａｘ２。这些片段的测序及表达工作正在进行之中。     

马立克氏病病毒（MDV）814株B抗原基因的克隆及部分序列分析

提取感染鸡胚成纤维细胞ＭＤＶ－Ｉ弱毒株８１４病毒ＤＮＡ为模板,根据ＲＢＩＢ株ｇＢ基因５′及３′两端核苷酸离列设计引物,利用ＰＣＲ技术扩增了我国ＭＤＶ－Ｉ弱毒株８１４ｇＢ基因（２．９ｋｂ）将扩增片段平末端克隆到载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ中ＥｃｏＲＶ位点,经ＢａｍＨＩ,ＨｉｎｄＩＩＩ酶切鉴定得到不同插入方向的重组质粒。构建圹增片段的酶切图谱及部分序列分析证明与ＲＢＩＢ株ｇＢ基因无差异,显示了极高的     

环状芽孢杆菌C-2几丁酶基因的克隆

环状芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ）Ｃ２总ＤＮＡ经ＰｓｔＩ部分酶切后分离２～１０ｋｂ的片段,插入质粒ｐＵＣ１９的ＰｓｔＩ位点,转化大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）,利用几丁质平板从约８０００个重组子中筛选到一个几丁酶基因阳性克隆（命名为ｐＣＨＴ１）。用１２种限制酶对重组质粒进行的酶切分析表明,重组质粒中的插入片段长３０ｋｂ,其中各有一个ＫｐｎＩ,ＳａｃＩ和ＳｓｐＩ位点。把该克隆片段反向插入ｐＵＣ１９的ＰｓｔＩ位点所得到的重组子同样具有几丁酶基因表达活性,说明此片段含有一个完整的几丁酶基因,其自身的启动子能被大肠杆菌转录系统所识别。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实了该片段来自于Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓＣ２基因组,且以单拷贝形式存在,它不能与来自于其它７株几丁酶产生菌的总ＤＮＡ杂交。     

蚕豆叶绿体atpE基因的克隆,测序和表达

蚕豆叶绿体的ａｔｐＥ和ａｔｐＢ基因在叶绿体ＤＮＡ ＫｐｎＩ酶切的第九条（约４．０ｋｂ）片段上,此片段被克隆到载体ｐＵＣ１８中,构成重组质粒ｐＵＫ１。用玉米叶绿体ａｔｐＥ基因作探针对ｐＵＫ１的ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ等的酶切产物进行杂交,确定了蚕豆叶绿体的ａｔｐＥ在ＣｌａＩ酶切的约０．９ｋｂ的片段上。根据ｐＢｕｌｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）ＤＮＡ多聚接头Ｆ引物和Ｒ引物测序,得到ε亚基基因的完整核苷酸序列。     

枯草杆菌启动子—信号肽序列的克隆及序列分析

利用含红霉素抗生基因和缺启动子－信号肽序列的氨苄青霉素抗性基因的双功能质粒ｐＧＰＢ１４为探针载体,克隆了枯草杆菌的启动子－信号肽序列并对克隆的片段进行序列分析。枯草杆菌染色体ＤＮＡ经Ｓａｕ３Ａ酶解后与ＢａｎＨＩ酶切的质粒ｐＧＰＢ１４连接,转化大肠杆菌Ｃ６００,筛选抗氨苄青霉素及抗红霉素的转化子,从双抗性转化子中提取重组质粒并经酶切分析,显示克隆的ＤＮＡ片段在０．２７－１．５ｋｂ之间。用Ｓａｎｇｅｒ     

点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶基因克隆与序列测定

点状产气单胞菌点状亚种（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｃａｔａ ｓｕｂｓｐ．ｐｕｎｃｔａｔａ）具有脯氨酰内肽酶（ｐｒｏｌｙｌ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＰＥＰ）活性。将其染色体ＤＮＡ有Ｅｃｏ ＲⅠ部分酶切后回收８－１６ｋｂ的ＤＮＡ片段,与ＥｃｏＲⅠ消化载体ｐＵＣ１８连接后转化Ｅ．ｃｏｉｌ ＤＨ５α,用该酶的专一性底物Ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ－Ｇｌｙ－β－ｎａｐｈｔｈｙｌａｍｉｄｅ从质粒库中     

绿色木霉纤维素酶CBHⅡ基因的结构研究

实验经限制性酶切和双向Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交将重组质粒ｐＣＢＨＩＩ－１４的１４ｋｂ外源片段上的绿色木霉纤维素酶ＣＢＨＩＩ基因定位于４．４ｋｂ的ＥｃｏＲＩ片段上,将该片段克隆于质粒ｐＵＣ１９,获得重组质粒ｐＣＢＨＩＩ。通过限制性分析构建了ｐＣＢＨＩＩ上４．４ｋｂＥｃｏＲＩ片段的物理图谱。在此基础上用质粒制作该片段的亚克隆,采用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法测定了含绿色木霉纤维素酶ＣＢＨＩＩ基因的４０７４ｂｐ的ＤＮＡ序列,由ＧＴ－ＡＧ规则和ｃＤＮＡ序列推知该结构基因由４个外显子和３个内含子组成,总长１６１３ｂｐ,５′端存在与一般真核基因类似的两个特征性调控序列,但３′端不存在真核基因通常具有的特征序列而存在功能未明的短重复序列和嘧啶富集区。并对纤维素酶基因间的同源性和可能的功能作了初步的探讨。     

费氏中华根瘤菌与耐盐有关的DNA片段的亚克隆和测序

将费氏中华根瘤菌（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｆｒｅｄｉｉ）ＫＴ１９与耐盐有关的２３ｋｂ ＤＮＡ片段用ＢａｍＨⅠ酶切成大小不同的长度,分别与质粒ｐＭＬ１２２连接,然后转化大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｓ１７－１,筛选出３个转化子。以这些转化子为供体,ＲＴ１９的盐敏感突变株ＲＣ３－３为受体,分别进行二亲本杂交,筛选到接合子ＢＲ２,得到４．４ｋｂ与耐盐有关的ＤＮＡ片段。根据其物理图谱,酶     

变铅青链霉菌66中对噬菌ΦHAU3显示抗性的基因（ψHAU3￣R）的核苷酸定序和分析

杂合质粒ｐＩＪ８３１０是链霉菌低拷贝质粒ｐＩＪ９２２１携带了１０．８ｋｂ来自变铅青链霉菌ＪＴ４６菌株,编码对噬菌体ΦＨＡＵ３抗性的ＤＮＡ片段。已知Ｔｎ４５６０插到该克隆中３ｋｂ的ＥｃｏＲＩ或３．３ｋｂ的ＢａｍＨＩ片段（这两个片段之间有２．５ｋｂ的重叠区）上,中断了ΦＨＡＵ３抗性基因的表达。已将３．０ｋｂ的ＢｃｏＡＩ片段分别以两种不同的取向克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）上。核苷酸序列分析揭示出一个１．３ｋｂ的ＯＲＦ的存在,其所编码的４７８个氨基酸组成的蛋白与λ噬菌体的ｅａ５９基因所编码的氨基酸序列显示了高度的同源性,其氨基酸序列的同一性高达３７％,相似性达５８％,而λ噬菌体的ｅａ５９基因是编码赖ＡＴＰ和单键ＤＮＡ的核酸内切酶Ｉ的,该区域与λ的复制无关。此外,这段具有高度同源性的ＤＮＡ区域的Ｇ＋Ｃ％只有６０％,低于变铅青霉菌ＤＮＡＧ＋Ｃ％的平均值（７４％）。     

枯草杆菌启动子－信号肽序列的克隆及序列分析

利用含红霉素抗性基因和缺启动子－信号肽序列的氨苄青霉素抗性基因的双功能质粒ｐＧＰＢ１４为探针载体,克隆了枯草杆菌的启动子－信号肽序列并对克隆的片段进行序列分析。枯草杆菌染色体ＤＮＡ经Ｓａｕ３Ａ酶解后与ＢｏｍＨＩ酶切的质粒ｐＧＰＢ１４连接,转化大肠杆菌Ｃ６００,筛选抗氨苄青霉素及抗红霉素的转化子,从双抗性转化子中提取重组质粒并经酶切分析,显示克隆的ＤＮＡ片段在０．２７－１．５ｋｂ之间。用Ｓａｎｇｅｒ的双脱氧链终止法测定了１０个克隆片段的ＤＮＡ顺序,结果表明,克隆的片段都含有启动子、核糖体结合优点及信号肽序列。克隆片段可以在大肠杆菌和枯草杆菌中恢复氨苄青霉素抗性的表型。β－内酰胺酶活力测定结果证明：大肠杆菌的酶活力主要积累在周质空间内而枯草杆菌的酶活力主要分泌到胞外。     

犬细小病毒中国内蒙株VP2基因克隆及序列分析

从我国内蒙古地区流行的犬细小病毒病病犬的肠溶物中分离提纯犬细小病毒（ＣＰＶ）。提取病毒基因组ＤＮＡ,并以此ＤＮＡ为模板,采用人工合成的引物进行ＰＣＲ扩增,ＰＣＲ产物经ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ双酶切后,克隆于ｐＵＣ１９质粒的ＢａｍＨＩ／ＳａｃＩ位点。重组质粒ｐＵＣＶＰ２经ＰＣＲ鉴定、限制酶切分析和序列分析,结果表明：获得了犬细小病毒内蒙株（ＣＰＶ－ＩＭ）ＶＰ２基因的全长克隆,ＶＰ２基因全长１７５５ｎｔ,     

嗜麦芽假单胞菌酪氨酸酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

酪氨酸酶基因（ｍｅｌ）编码的酪氨酸酶是合成黑色素的关键酶。用鸟枪法分离嗜麦芽假单胞菌的ｍｅｌ基因：以ｐＵＣ１８为载体,Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１为受体菌,在加有一定量的Ａｍｐ和Ｌ－ｔｙｒ的酪素平板上筛选到分泌可溶性黑色素的转化子,所含重组质粒ｐＷＳＹ约７００ｂｐ的外源ＤＮＡ片段上携有ｍｅｌ基因,该片段无ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｃｌＩ等酶的识别位点。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实此片段确实     

重组α—乙酰乳酸脱羧酶的表达及部分酶学特性

用聚合酶链式反应方法以短芽胞杆菌基因组ＤＮＡ为模板,克隆出０．９７ｋｂ的ＤＮＡ片段,经ＤＮＡ测序证明α－乙酰乳酸脱羧酶基因。将该基因重组到质ｐＢＶ２２０中,构建了重组表达质粒ｐＢＶＹＩ,转化大肠杆菌ＤＨ５α后,经筛选得到了能表达０６３３－ＡＬＤＣ活性的转化子细胞。     

霍乱弧菌染色体基因文库的构建

利用限制性内切酶Ｓａｎ３Ａ将霍乱弧菌１７８（埃尔托生物型,小川血清型）染色体ＤＮＡ进行部分酶切后,分离２０～５０ｋｂ的ＤＮＡ片断,与经过ＢａｍＨＩ酶切的柯斯质粒ｐＨＣ７９连接重组,通过体外包装系统形成噬菌体颗粒,感染受体菌Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１,构建成霍乱弧菌１７８染色体基因文库。为霍乱弧菌中未知基因的克隆及其它研究打下了基础。