Isolation of protoplasts from edible fungi

Summary Mycelium from the periphery of actively growing colonies on cellophane and from shake flask cultures was used for the isolation of protoplasts from strains ofAgaricus bisporus,Auricularia auricula, Lentinus edodes, Pleurotus sajor-caju, Volvariella bombycina andV. volvacea. The mycelial cells were treated with two mycolytic enzymes, Novozym 234 or lywallzyme. Protoplasts were produced from all the edible fungi tested.Pleurotus sajor-caju gave the highest yield (3.84×10⁷/ml), followed byAu. auricula (7.46×10⁶/ml),Ag. bisporus (2.16×10⁶/ml) andV. volvacea (1.92×10⁶/ml), when treated with lywallzyme.Agaricus bisporus gave the smallest yield of protoplasts when Novozym 234 was used. The effects of different molarities of osmotic stabilizers were also studied. The cellophane method is simple and quick and can be used as a screening procedure. The yields of protoplasts obtained from liquid cultures were usually higher than those from cellophane cultures.

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Aislamiento de protoplastos a partir de setas comestibles

Resumen Para el aislamiento de protoplastos de cepas deAgaricus bisporus, Auricularia auricula,Lentinus edodes, Pleurotus sajor-caju, Volvariella bombycina, y V. volvacea se utilizo micelio periferico de colonias que estaban en crecimiento activo en celofan y en frascos de agitación. Las celulas del micelio se tratarón con dos enzymas mycoliticos: Novozym 234 y lywallzyme. Todas las setas comestibles ensayadas produjerón protoplastos. Mediante tratamiento con lywallzyme la mejor cosecha de protoplastos la proporcionoP. sajor-caju (3.84×10⁷/ml) seguido porAu. auricula (7.46×10⁶/ml),Ag. bisporus (2.16×10⁶/ml) yV. volvacea (1.92×10⁶/ml). Con Novozym 234Ag. bisporus fué la de menor rendimiento. También se estudiarón los efectos de distintos estabilizadores osmoticos a diferentes molaridades.

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Isolement de protoplastes à partir de champignons comestibles

Résumé Du mycélium prélevé à la périphérie de colonies dévoloppées sur cellophane ou à partir de cultures liquides agitées a été utilizé pour la préparation de protoplastes d'Agaricusbisporus,Auricularia auricula, Lentinus edodes, Pleurotus sajor-caju, Volvariella bombycina etV. volvacea. Les cellules mycéliales ont été traitées par deux enzymes mycolytiques, Novozym 234 et lywallzyme. Par traitement avec le lywallzyme, des protoplastes ont été obtenus avec tous les champignons comestibles étudiés,P. sajor-caju donnant le rendement le plus élevé (3.84×10⁷/ml), suivi parAu. auricula (7.46×10⁶/ml,Ag. bisporus (2.16×10⁶/ml etV. volvacea 1.92×10⁶/ml). Avec le Novozym 234,Ag. bisporus a donné le rendement en protoplastes le moins élevé. Les effets de différentes molarités de stabilisateurs osmotiques ont également été étudiés. La méthode de la cellophane est simple et rapide et peut être employée comme procédé de degrossissage. Les rendements en protoplastes obtenus à partir des cultures liquides sont habituellement plus élevés que ceux à partir des cultures sur cellophane.

     

Induction of L-phase variants from protoplasts ofClostridium thermocellum

Summary Stable protoplasts ofClostridium thermocellum were prepared by combined treatment using glycine and lysozyme as the protoplasting agents and raffinose as the osmotic stabilizer. These protoplasts gave rise to L-form colonies on an hypertonic rich medium.

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Resumen Se prepararon protoplastos estables a partir deClostridium thermocellum mediante un tratamiento combinado utilizando glicina y lisozima como agentes protoplastizantes y rafinosa como estabilizante osmótico. Estos protoplastos originaron colonias de formas L en un medio rico e hiper tónico.

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Résumé Des protoplastes stables deClostridium thermocellum ont été préparés par un traitement combiné à base de glycine et de lysozyme comme agents générateurs de protoplastes et de raffinose comme stabilisateur osmotique. Ces protoplastes ont donné naissance à des colonies de forme L dans un milieu riche hypertonique.

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Based on a paper presented at the First Latin American Congress on Biotechnology, Tucumán, Argentina, October 4–8, 1987.     

Glucoamylase production byAspergillus awamori on rice flour medium and partial characterization of the enzyme

Summary Aspergillus awamori ATCC 22342 was selected from 12 strainsof Aspergillus spp.and Rhizopus spp. as the best producer of amylase. Optimal growth conditions for the enzyme production in shake flasks were provided by: a medium containing 60 g/1 rice flour, 0.075% (w/v) NaNO₂ and 0.075% (v/v) corn-steep liquor, a temperature of 30° C and initial pH value of 6.5. The enzyme was characterized as a glucoamylase with a molecular weight of 49,000. Maximum enzyme activity occurred at 45 C and pH 5.8. The enzyme was stable at 40° C and lost 70 and 90% of activity when heated for 30 min at 50 and 60°C, respectively. Thermal inactivation was slowed in the presence of starch. Michaelis-Menten constants for soluble starch and dextrin were estimated as 12.5 and 33.3 mg/ml, respectively. This enzyme may be used for the production of glucose-rich syrups from rice starch.

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Producción de glucoamilasa por Aspergillus awamori en harina de arroz y caracterización parcial del enzima

Resumen Aspergillus awamori ATCC 22342 se seleccionó entre 12 cepas deAspergillus spp. y deRhizopus spp. como el mejor productor de amilasa. La condiciones óptimas de crecimiento para la producción del enzima en frascos de agitación fueron las siguientes: un medio con la composicion siguiente: 60 g/1 de harina de arroz, 0.075% (m/v) NaNO₂ y 0.075% (v/v) de extracto de maíz (corn steep liquor); una temperatura de 30°C y un pH inicial de 6.5. El enzima fue caracterizado como una glucoamilasa de peso molecular 49,000. La máxima actividad enzimática se obtuvo a 45°C con un pH de 5.8. El enzima era estable a 40 C pero perdió un 70 y un 90% de su actividad cuando se calentó durante 30 min a 50 y 60° C respectivamente. La inactivación térmica fue más lenta en presencia de almidón. Las constantes de Michaelis-Menten para almidón soluble y para dextrina se estimaron como 12.5 y 33.3 mg/ml respectivamente. Este enzima puede utilizarse para la producción de jarabes ricos en glucosa a partir de almidón de arroz.

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Production de glucoamylase par Aspergillus awamori cultivé sur milieu à la farine de riz et caractérisation partielle de l'enzyme

Résumé Aspergillus awamori ATCC 22342 a été sélectionné parmi 12 souches d'Aspergillus spp. et deRhizopus spp. comme étant le meilleur producteur d'amylase. Les conditions optimales de croissance pour la production d'enzyme en fioles agitées sont: un milieu contenant 60 g/1 de farine de riz, 0.075% (w/v) de NaNO₂ et 0.075% (v/v) de liqueur de corn steep, une température de 30° C et un pH initial de 6.5. L'enzyme a été caractérisé comme étant une glucoamylase de poids moléculaire 49,000. L'activité maximum de l'enzyme se situe à 45°C et pH 5.8. L'enzyme est stable à 40°C et perd 70 et 90% de son activité par chauffage pendant 30 min à 50 et à 60°C, respectivement. L'inactivation thermique est ralentie en présence d'amidon. Les constantes de Michaelis-Menten pour l'amidon soluble et pour la dextrine ont été éstimées, respectivement, à 12.5 et 33.3 mg/ml. Cet enzyme peut être utilisé pour la production de sirops riches en glucose à partir d'amidon de riz.

     

Production of ethanol by aZymomonas sp strain,free and immobilized in pectin

Summary AZymomonas sp strain, alcohol tolerant, isolated from spontaneously fermenting sugarcane juice, was tested for the production of ethanol in batch, free and immobilized in pectin. CaCl₂ was used during the preparation of the beads and also added to the fermentation medium to improve the stability of the beads. It was found that immmobilization, as well as CaCl₂ above 1 gl^–1 impaired fermentation to some extent. As theZymomonas-pectin beads maintained their fermentative capacity and mechanical stability during about 40 successive batch fermentations, this opens up the possibility of using them for the continuous production of ethanol. The role of free cells as well as the effect of the preincubation of the beads on fermentation are also discussed.

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Resumen Una cepa deZymomonas alcohol tolerante, aislada de jugo de caña de azúcar en fermentación espontánea, fue utilizada para ensayos de producción en lote de etanol, tanto libre como inmovilizada en pectina. En este último caso se utilizó CaCl₂ en la preparación de las perlas como así también como componente del medio de fermentación, con el objeto de aumentar la estabilidad de las perlas. Los resultados obtenidos indican que tanto la inmovilización como una concentración de Cl₂Ca en el medio superior a 1 g/l perjudicaron en cierto grado la fermentación. Las perlas deZymomonas-pectina mantuvieron la actividad fermentativa y estabílidad mecánica durante 40 fermentaciones en lote sucesivas, abriendo la posibilidad de su utilización en la producción continua de etanol. También se analiza la influencia sobre la fermentación de las células libres y de la preincubación de las perlas.

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Résumé Une souche deZymomonas sp., tolérante à l'éthanol, isolée d'un moût spontanné de canne à sucre, a été testée pour sa faculté de produire de l'éthanol en milieu non renouvelé, à l'état libre ou à l'état immobilisé dans la pectine. On s'est servi du CaCl₂ pour la préparation des billes. Le CaCl₂ a également été ajouté au milieu de fermentation pour améliorer la stabilité des billes. Tant l'immobilisation que la présence du CaCl₂ au delà de 1 g par litre inhibent la fermentation jusqu'à un certain point. Mais le fait que les billes deZymomonas dans le pectine conservaient leur capacité fermentative et leur stabilité mécanique pendant environ 40 fermentations successives en milieu non renouvelé, ouvre la possibilité de les utiliser néanmoins en production continue d'éthanol. On discute aussi le rôle dans la fermentation des cellules libres ainsi que l'effet de la préincubation des billes.

     

Production of ethanol by a flocculentSaccharomyces sp. in a continuous upflow reactor using sucrose,sugar-cane juice,and molasses as the carbon source

Summary A flocculentSaccharomyces sp., isolated from spontaneously fermenting sugar-cane juice, was used to produce ethanol in a continuous upflow reactor. Media of different composition were tested using the same fermentation conditions. The best results were obtained fermenting either sugar-cane juice or molasses. The differences observed could be due to the influence of the medium composition on the growth rate and on the expression of the flocculent capacity of the yeast, both factors which modified the cell biomass concentration within the reactor.

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Resumen Una cepa floculante deSaccharomyces, aislada de jugo de caña de azúcar, se utilizó para producir etanol fermentando medios de distinta composición en un reactor continuo de flujo ascendente. Los mejores resultados se obtuvieron con jugo de caña de azúcar y con melaza. Las diferencias observadas según el mosto utilizado pueden deberse a la influencia de la composición del medio sobre la velocidad de multiplicación y capacidad foculante de la levadura, modificando de esta manera la concentración de biomasa dentro del reactor.

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Résumé Une souche floculante deSaccharomyces isolée du jus de canne à sucre a été utilisée pour produire l'éthanol, dans un réacteur continu à flux ascendant, par fermentation de milieux de culture de différentes compositions. Les meilleurs résultats ont été obtenus avec le jus de canne à sucre et les molasses. Les différences qu'on a vues selon le moût utilisé peuvent être dues à l'influence de la composition du milieu sur la vitesse de multiplication et la capacité floculante de la levure, donnant une modification de la concentration de biomasse dans le réacteur.

     

Cassava starch fermentation pattern ofRhizopus oligosporus

Summary Rhizopus oligosporus UQM 145F was grown on cassava starch medium without a preliminary treatment of starch. The fermentation pattern ofR. oligosporus is shown to be influenced significantly by the medium composition, pH of the growth culture and the size of the spore inoculum. By varying the carbon, nitrogen and mineral salt concentrations, it was found that either glucose accumulated due to excess hydrolysis of starch or single cell protein production became dominant. In the case of the carbon source, increases in the concentration of starch led to higher biomass values, but lower rates of protein production. These observations led to a new formulated medium, resulting in an 82.9% cassava starch utilization and a true protein yield of 5.32 g/100 g initial substrate. The response ofR. oligosporus to inorganic compounds such as (NH₄)₂SO₄, urea, NaCl and MgSO₄ indicates an interesting fermentation control system.

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Resumen Rhizopus oligosporus UQM 145F se hizo crecer en un medio a base de almidón de casava sin que hubiera pasado por un tratamiento previo con almidón. Se demostró que el patrón de fermentación seguido porRh.oligosporus estaba significativamente influenciado por: la composición del medio, su pH y el tamaño del inóculo. Al variar las concentraciones de carbono, nitrógeno y sales minerales se observó que predominaba la acumulación de glucosa o bien la producción de proteínas unicelulares. Un incremento en la fuente de carbono aumentó la biomasa pero disminuyó el ritmo de producción de proteínas. Estas observaciones permitieron elaborar un nuevo medio de cultivo que resultó en la utilización del 82.9% del almidón de casava con un rendimiento en proteínas de 5.32 g/100 g de sustrato inicial. La respuesta deRh. oligosporus a compuestos inorgánicos como sulfato amónico, urea, cloruro sódico y sulfato magnésico indican la existencia de un sistema de control de la fermentación muy interesante.

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Résumé On a fait croîtreRhizopus oligosporus UQM 145 F sur un milieu à base d'amidon de manioc sans traitement préalable de l'amidon. Le profil de fermentation parR. oligosporus apparaît être influencé de manière significative par la composition du milieu, le pH de la culture en croissance et la taille de l'inoculum de spores. En variant les concentrations en carbone, en azote et en sels minéraux, on remarque la prédominance tantôt de la protéine unicellulaire, tantôt de l'accumulation de glucose. Un accroissement en concentration conduit à des valeurs plus élevées de la biomasse mais en une moindre production de protéines. Ces observations ont abouti à une nouvelle formulation du milieu avec pour résultat une utilisation à 82.9% de l'amidon de manioc et un rendement vrai en protéines de 5.32 g/100 g de substrat initial. La réponse deR. oligosporus aux composés inorganiques comme le sulfate d'ammonium, l'uréi, le chlorure de sodium et le sulfate de magnésium sont indicateurs d'un système très intéressant de contrôle de la fermentation.

     

A single-step purification of an extracellular fungal laccase

Summary A single-step purification procedure forNeurospora crassa laccase is reported. It used Celite chromatography which permits the concentration of the extracellular enzyme from large culture volumes. This method is useful to isolate any fungal or plant laccase as well as other coppercontaining proteins. This work also takes advantage of the 100-fold induction of the enzyme by low concentrations of cycloheximide.

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Resumen Aquí se reporta un procedimiento de purificación en un solo paso para le enzima lacasa deNeurospora crassa. Consiste en el empleo de la cromatografía en Celite que permite la concentración de la enzima exocelular de grandes volúmenes de cultivo. Este método es útil para aislar cualquier lacasa de hongos o plantas así como otras proteínas que contienen sobre. En este trabajo, hemos aprovechado también la inducción de la enzima en más de 100 veces por bajas concentraciones de cicloheximida.

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Résumé Nous rapportons ici une procédure de purification en une étape de la laccase deNeurospora crassa. Elle consiste à employer la chromatographie sur Celite qui permet la concentration de l'enzyme exo-cellulaire à partir de grands volumes de milieu de culture. Cette méthode permet d'isoler n'importe quelle laccase fungique ou de plante ainsi que d'autres protéines à cuivre. Dans le présent travail, nous avons aussi tiré parti de l'induction au centuple de l'enzyme par de faibles concentrations en cycloheximide.

     

Hydrolysis of rice straw to fermentable sugars byTrichoderma enzymes

Summary ATrichoderma sp. (IMB-Tr) isolated from rice straw possessed cellulolytic and xylanolytic activity, comparable to those produced byTrichoderma reesei QM 9414 (a proven cellulolytic fungus). IMB-Tr produced 2.9 and 1.9 times, respectively, greater -glucosidase activity compared toT. reesei when grown on microcrystalline cellulose and rice straw. Percentage enzymic hydrolysis increased with increase in the sodium hydroxide concentration used in the pretreatment of rice straw and with the increase of enzyme concentration used in the hydrolysis. The extracellular enzyme fraction ofT. reesei possessed greater hydrolytic power than that of IMB-Tr. However, when a combined enzyme preparation from the two organisms was used, an appreciable degree of synergism was observed; an increase in reducing sugars up to 39% was seen. The reducing sugar produced by enzymic hydrolysis was mainly glucose, xylose and cellobiose. Fermentation of a 4.8% (w/v) sugar hydrolysate (produced by the enzymic hydrolysis of rice straw) bySaccharomyces cerevisiae produced 10.7 g/l of ethanol compared to 18.8 g/l produced by the fermentation of 4.8% (w/v) pure glucose.

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Resumen Se ha aíslado a partir de paja de arroz una cepa deTrichoderma sp. (IMB-Tr) que posee actividades celulolíticas y xilanolíticas comparables a las deTrichoderma reesei QM 9414 (un hongo probadamnete celulolítico). IMB-Tr produjo 2.9 y 1.9 veces más actividad -glucosidásica queT. reesei cuando ambos se hicieron crecer en celulosa microcristalina y en paja de arroz respectivamente. El porcentaje de hidrolisis enzimática se incrementó con el aumento en la concentración del hidróxido sódico empleado en el pretratamiento de la paja de arroz y con el aumento de la concentración enzimática utilizada en la hidrolisis. La fracción extracelular enzimática deT. reesei poseía un mayor poder hidrolítico que la de IMB-Tr, sin embargo cuando se usó un preparado enzimático combinado de ambos microorganismos se obtuvo un apreciable efecto sinérgico, observándose un incremento de hasta un 39% de los azucares reductores producidos. Estos azucares fueron principalmente glucosa, xilosa y celobiosa. La fermentación de un 4.8% (p/v) del hidrolisado azucarado (producido por la hidrolisis enzimática de la paja de arroz) porSaccharomyces cerevisiae produjo 10.7 g/l de etanol comparado a 18.8 g/l obtenidos de la fermentación de 4.8% (p/v) de glucosa pura.

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Résumé Une souche deTrichoderma sp. (IMB-Tr), isolée à partir de paille de riz, a une activité cellulolytique et xylanolytique comparable à celle deTrichoderma reesei QM 9414 (champignon cellulolytique reconnu). L'activité -glucosidase d'IMB-Tr cultivé sur cellulose micro-cristalline ou sur paille de riz est, respectivement, 2.9 et 1.9 fois plus élevée que celle deT. reesei. Le pourcentage d'hydrolyse enzymatique croit avec la concentration de la soude employée pour le pré-traitement de la paille et avec la concentration d'enzyme utilisée pour l'hydrolyse. La fraction exocellulaire de l'enzyme a une activité hydrolysante plus élevée dans le cas deT. reesei que dans celui de IMB-Tr. Cependant, si on emploie un mélange des activités enzymatiques des deux organismes, on constate une nette synergie et un accroissement des sucres réducteurs allant jusqu'à 39%. Les sucres réducteurs obtenus par hydrolyse enzymatique comprennent principalement du glucose, du xylose et du cellobiose. La fermentation parSaccharomyces cerevisiae d'un hydrolysat enzymatique de paille de riz contenant 4.8% (poids/vol.) de sucres fournit 10.7 g/l d'éthanol, au lieu de 18.8 g/l obtenus par fermentation de glucose pur à la même concentration.

     

Some factors influencing permeability of cell walls/membranes of the osmotolerant yeastSaccharomyces rouxii grown in the presence and absence of 18% NaCl

Summary Saccharomyces rouxii is an essential micro-organism in the soy sauce/Japanese shoyu/Japanese miso fermentations. Its major activity occurs under conditions of high NaCl content, up to 18% or higher when the pH of the substrate is below 5.0.Saccharomyces rouxii grew much more rapidly and to higher cell population levels in the absence of added salt than with 18% (w/v) NaCl at either pH 7.0 or 4.5. Cells grown with 18% salt were smaller than those grown without added salt. Lower surface area combined with a thicker membrane decreased passive permeability. Growth in the presence of salt resulted in higher content of crude protein, total lipids, phosphatidyl choline and glycerol. The lipid content of the cells reflected the osmotic pressure whether it was caused by NaCl or sugar concentration in the medium. On the other hand, the cells grown in the presence of 18% NaCl contained much less K⁺ and retained potassium and sodium less efficiently. The triosephosphate isomerase (TPI) activity of cells grown in 18% NaCl medium was consistently higher than that of cells grown without added salt.

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Resumen Saccharomyces rouxii es un microorganismo esencial en los procesos fermentativos japoneses shoyu miso y de obtención de salsa de soja. La parte más importante de la actividad de esta levadura se desarrolla en medios con una elevada concentración de sal (hasta más de 18%) y pH inferiores a 5.0.Saccharomyces rouxii creció más rapidamente y alcanzó concentraciones celulares mayores en un medio sin sal que en un medio con 18% de sal, tanto a pH 7.0 como a pH 4.5. Las células desarrolladas en el medio con sal fueron de tamaño inferior que las obtenidas en el medio sin sal. La menor superficie de estas últimas combinada con un mayor espesor de su membrana celular resultan en una disminución del transporte pasivo. El contenido proteíco de las células desarrolladas en el medio sin sal fue de 36.0% contra 49.5% en las células obtenidas en el medio con 18% de NaCl y 43% en células desarrolladas en medios con un contenido en sal entre 6 y 12%. Las células obtenidas en un medio sin sal retuvieron de forma similar su contenido en Na⁺ y K⁺ independientemente de la solución de lavado y de la temperatura empleadas. El contenido de Na⁺ fue de 0.04–0.06 mg Na/g de materia seca y el de K⁺ 7.78–10.04 mg K/g de materia seca. Las células desarrolladas en un medio con adición de sal contenían menor cantidad de K⁺ (0.48–4.77 mg/g de materia seca) variando con las condiciones de lavado. Se observó que las células obtenidas en el medio con 18% de NaCl contenían más lípidos totales (10.13%) comparadas con las células desarrolladas sin sal (6.22%). La cantidad total de fosfatidilcolina y sus liso derivados fue de 72% para las células del medio salado contra 58% en las células sin sal. El contenido lipídico de las células refleja la presión osmótica, ya sea esta producto de la concentración de NaCl o de azucar. Al incrementar el contenido en sal de el medio desde 0–6% hasta 12–18% el contenido intracelular de glicerol aumentó proporcionalmente de 0.429–1.014 hasta 1.107–1.668 mg%. El contenido en triosafosfatoisomerasa de las células crecidas en el medio con 18% NaCl fue de 66.94 unidades/mg de proteína comparado con 42.82 unidades/mg de proteína en las células obtenidas en el medio sin adición de sal.

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Résumé Saccharomyces rouxii est un micro-organisme essentiel dans la fermentation des sauces de soja japonaises (shoyu, miso). Son activité optimale nécessite des concentrations en NaCl élevées, allant jusqu' à 18% (poids/volume), ou même davantage lorsque le pH du substrat est inférieur à 5,0. A pH 7,0 ou 4,5,S. rouxii se développe beaucoup plus rapidement et abondamment en présence qu'en l'absence de sel. Les cellules cultivées en présence de NaCl sont plus petites que celles cultivées sans sel. Du fait à la fois de leur surface moindre et de leur membrane plus épaisse, leur perméabilité passive est diminuée. Leurs teneurs en protéine brute, lipides totaux et glycérol sont sensiblement plus élevées. La teneur des cellules en lipides est déterminée par la pression osmotique, que celle-ci dépende de la concentration du milieu en NaCl ou en sucre. D'autre part, les cellules cultivées avec 18% de NaCl contiennent beaucoup moins de K⁺ et retiennent moins bien le potassium et le sodium que les cellules cultivées sans sel. L'activité triose-phosphate isomérase des cellules cultivées avec 18% de NaCl est supérieure à celle des cellules cultivées sans addition de sel.

     

Rhizobium biomass production in batch and continuous culture with a malt-sprouts medium

Summary The growth of nine strains of four different species ofRhizobium (R. leguminosarum, R. meliloti, R. phaseoli andR. japonicum) was studied with media containing malt sprouts extract (MSE), in place of yeast extract (YE), as source of nitrogen and growth factors. The results obtained in batch cultures indicated that all the strains grew well in MSE medium. In the case of fast-growing strains the biomass increased with increase in the concentration of MSE in the medium, but with the slow-growing strains, likeR. japonicum, growth was inhibited completely by using a concentration of MSE (containing 3.75% w/v of solids) of 40% v/v. With all the strains the concentration of cells attained was greater than 5×10⁹ cells/ml, which clearly indicates that MSE is a suitable component of media, and one which can be used instead of YE. The results of continuous culture experiments showed that a high productivity of cells (15.3×10⁸ cells/ml/h) could be obtained using MSE medium.

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Producción de Rhizobium en cultivos batch y continuo sobre medio conteniendo extracto de raiz de malta

Resumen Se estudió el crecimiento de nueve cepas de cuatro especies diferentes deRhizobium (R. leguminosarum, R. meliloti, R. phaseoli y R. japonicum) en medios de cultivo conteniendo extracto de raíz de malta (ERM), en reemplazo de extracto de levaduras (EL), como fuente de nitrógeno y factores de crecimiento. Los resultados obtenidos en cultivos en batch indicaron que todas las cepas crecieron bien en los medios con ERM. En el caso de las cepas de crecimiento rápido la biomasa se incrementó con la concentración de ERM en el medio de cultivo, pero con las cepas de crecimiento lento(R. japonicum) el desarrollo celular se inhibió completamente para concentraciones de ERM (conteniendo 3,75% p/v de sólidos) de 40% v/v. Con todas las cepas empleadas la concentración celular alcanzada fue superior a 5×10⁹ cél/ml, lo que indica claramente que el ERM es un adecuado componente para los medios de cultivo que puede reemplazar al EL. Los resultados de los experimentos realizados en sistema continuo mostraron que se puede alcanzar una alta productividad (15,3×10⁸ cél/ml/h) utilizando un medio de cultivo suplementado con ERM.

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Production de Rhizobium en culture discontinue et continue sur milieu à base de germes de malt

Résumé La croissance de neuf souches appartenant à quatre éspèces différentes deRhizobium (R. leguminosarum, R. meliloti, R. phaseoli etR. japonicum) a été étudiée avec des milieux contenant, comme source d'azote et de facteurs de croissance, un extrait de germes de malt (MSE) au lieu d'extrait de levure (YE). Les résultats obtenus en culture discontinue (batch) montrent que toutes les souches poussent bien en milieu MSE. Dans la cas des souches à croissance rapide, la biomasse augmente proportionnellement à la concentration de MSE dans le milieu. Par contre, pour les souches à croissance lente, commeR. japonicum, la croissance est complètement inhibée lorsque la concentration en MSE (contenant 3.75% w/v de solides) atteint 40% (v/v). Avec toutes les souches, on obtient une concentration en cellules supérieure à 5×10⁹/ml, ce qui indique clairement que le MSE convient bien et peut être utilisé à la place de YE. Les expériences réalisées en culture continue montrent qu'on peut obtenir avec le milieu MSE une productivité en cellules très élevée (15.3×10⁸ cellules/ml/h.).

     

Ecology of microalgae in a high rate pond for piggery effluent purification in Singapore

Summary An integrated system for the collection, treatment and utilisation of piggery wastewater has been developed in Singapore which uses the cultivation of microalgae in high rate ponds to achieve reduction of BOD₅ and COD₅ of the effluent as well as producing single cell protein. A wide range of algal flora occurs in the ponds;Oocystis, Micratinium, Scenedesmus, Ankistrodesmus, Chlorella andOscillatoria spp were identified. Total algal counts, recorded from 1979 to 1981, ranged up to 10⁷ per ml of pond water. There were considerable variations in the algal population and in the predominating species. No discernible pattern was evident. Consequently pond operations were frequently disturbed by these fluctuations in population which in turn was attributed to the heterogeneous composition of the piggery waste, to variable weather conditions and to predation by larger organisms particularlyMoina. After passing through the ponds, the total suspended solids were removed by a novel dissolved air flotation method which gave a clear effluent showing an 87% reduction in BOD₅ value.

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Resumen En Singapur se ha desrrollado un sistema integrado para le recogida, tratamiento y utilización de aguas residuales de pocilgas. Este sistema usa el cultivo de microalgas en estanques, de caudal rápido afin de reducir las DBO₅ y DCO₅ del efluencte produciendo asimismo proteínas celulares. La flora de algas producida en estos estanques es amplia y variada, habiendose identificado:Oocystis, Micratinium, Scenesdemus, Ankistrodesmus, Chlorella y Oscillatoria. Los recuentos totales de algas tomados desde 1979 a 1981 llegaron a alcanzar 10;⁷ por ml de agua del estanque. Se observaron variaciones considerables tanto en la población total de algas como en las especies predominantes sin que se pudiese, determinar un patrón de variación característico. Estas fluctuaciones en la población, causantes de frecuentes alteraciones en el funcionamiento del estanque, se atribuyeron a la composición heterogenea de los resuduos, a las variaciones climáticas y la predación por otros organismos particularmenteMoina Después de su paso por los estanque los solidos suspendidos totales se eliminaron mediante un nuevo método de flotación con aire disuelto, obteniendose un efluente limpio con una reducción de la DBO₅ del 87%.

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Résumé Un système intégré pour la collecte, le traitement et l'utilisation d'eaux résiduaires de porcherie a été développé à Singapoure. Il utilise la culture de micro-algues tant pour la réduction accélérée en lagune de la DBO₅ et de la DCO de l'effluent que pour la production de protéines uni-cellulaires. On trouve une large gamme de flore algale dans les lagunes; des espèces d'-Oocystis, deMicratinium, deScenedesmus, Ankistrodesmus, deChlorella etd'Oscillatoria out été identifiées. Les comptages totaux d'algues, enregistrées de 1979 à 1981, ont donné jusqu' à 10⁷ cellules par ml d'eau de la lagune. On a observé des variations considérables de population algale tant quantitatives que qualitatives. On ne discernait pas de spectres évidents. En conséquence, les opérations lagunaires ont été fréquemment perturbées par ces fermentations en population, qui, à leur tour, ont été attribuées à la composition hétérogène de l'effluent de porcherie, aux conditions atmosphériques et climatiques variables et à la prédation par des organismes plus conséquents, plus particulièrement desMoina. Après passage par les lagunes, les solides totaux en suspension ont été enlevés par une méthode nouvelle de flottation à l'air dissous, qui a donné un effluent limpide, présentant une réduction de DBO₅ de 87%.

     

Response of groundnut (Arachis hypogaea L) toRhizobium inoculation in the field: Problems and prospects

Summary A successfulRhizobium inoculant strain needs to be more competitive than native soil rhizobia in forming nodules and to be effective in fixing nitrogen. Persistence of the strain from one season to the next will be an added advantage, since it eliminates the need to inoculate every season. Earlier studies indicated that groundnut,Arachis hypogaea, seldom responds toRhizobium inoculation in soils already containing rhizobia which nodulate groundnut. However, the results of seven years of research at ICRISAT have opened up the prospect of inoculating groundnut in such soils. These experiments indicate that inoculating with sufficient numbers of an effectiveRhizobium strain, NC 92, applied as a liquid slurry below the seed, increased yields of certain groundnut cultivars. Similar results were reported from other research centres in India. Inoculation with NC 92 for two consecutive seasons increased the proportion of nodules formed by this strain, from 25–32% in the first season to 41–54% in the second season, indicating that this strain can persist in the field for the following season. This paper also discusses results of experiments relating to host cultivar specificity and some possible problems in applying this information to farmers' fields. Strain NC 92 also produces a siderophore, an iron chelating compound, which may help in the iron nutrition of the plant.

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Resumen Respuesta del maní (Arachis hypogaeaL.)a la inoculación con Rhizobiumen el campo. Problemas y perspectivas.La inoculación conRhizobium para tener exito debe de realizarse con una cepa que sea competitivamente mejor que las cepas nativas del suelo en cuestión, en relación a la habilidad para formar nódulos y a la eficacia en la fijación de nitrógeno. La persistencia de la cepa de una temporada para otra es una caracteristica deseable ya que elimina la necesidad de reinocular cada temporada. Estudios previos indicaban que el maní (Arachis hypogaeae) raras veces responde a la inoculación conRhizobium en suelos que ya contienenRhizobium especificos. Sin embargo los resultados de siete años de investigaciones en ICRISAT han abierto nuevas perspectivas para la inoculación del maní en dichos suelos. Esta experiencias indican que la inoculación, en cantidades suficientes de una cepa deRhizobium eficaz (NC 92) aplicada en forma de liquido viscoso bajo la semilla incrementa el rendimiento de ciertos cultivars de mani. Resultados semejantes se han observado en otros centros de investigación en India.La inoculación de la cepa NC 92 durante dos años consecutivos incrementó la proporción de nódulos formados desde 25–32% en la primera temporada hasta 41–54% en la segunda indicando pues la persistencia de dicha cepa en el suelo de una a otra temporada. Este trabajo también evalua los resultados de investigaciones relacionando la especificidad del inóculo con la posible problemática que conlleva la aplicación de esta informacion por el agricultor.

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Résumé Réponse de l'arachide (Arachis hypogeaL.)à l'inculation de Rhizobiumdans les champs. Problèmes et perspectives.Pour être couronnée de succès, une souche deRhizobium inoculée doit supplanter les rhizobiums natifs du sol en ce qui concerne la formation de nodules et doit fixer l'azote efficacement. La persistance de la souche d'une saison à l'autre, rendant inutile la répétition saisonnière de l'inoculation, est un avantage supplémentaire. Des études antérieures ont montré que l'arachide (Arachis hypogea) ne répond que rarement à l'inoculation dans des sols contenant déjà des rhizobiums capables de noduler cette plante. Cependant, les résultats de sept années de recherches éffectuées à l'ICRISAT ont ouvert des possibilités quant à l'inoculation dans ce type de sols. Ces expériences montrent qu'une bouillie liquide d'une souche efficace deRhizobium (NC 92), répandue en quantité suffisante sous les graines, augmente le rendement de certains cultivars d'arachide. Des résultats similaires ont été rapportés par d'autres centres de recherches en Inde. L'inoculation de NC 92 pendant deux saisons consécutives a augmenté la proportion des nodules formés par cette souche de 25 à 32% pour la première saison, et de 41 à 54% pour la seconde, ce qui indique que cette souche peut persister dans le sol d'une saison à l'autre. Dans cet article sont également discutés les résultats d'expériences concernant la spécificité de l'hôte et quelques problèmes concernant l'utilisation de ces informations par les agriculteurs. La souche NC 92 produit aussi un sidérophore, agent complexant du fer pouvant jouer un rôle dans le métabolisme de ce métal chez la plante.

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Submitted as ICRISAT J. A. No. 475.     

Isolation of a hydroxyproline-secreting pigment-deficient mutant ofNostoc sp. by metronidazole selection

Summary A pigment-deficient mutant ofNostoc sp. was induced by N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine and selected in a medium containing metronidazole. It formed chains of heterocysts, grew more slowly than the control, and excreted hydroxyproline into the medium, imparting a pinkish-brown colour to the cultures.

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Aislamiento de un mutante do Nostoc sp. deficiente en pigmentos y secretor de hidroxiprolina en un medio selectivo con metronidazol

Resumen Un mutante pigmento-deficiente deNostoc sp. fue inducido mediante N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina y seleccionado en un medio conteniendo metronidazol. La cepa mutante creció más lentamente que la control formando cadenas de heterocistos y excretando hidroxiprolina al medio lo cual confirió una coloración rosa-parduzca a los cultivos.

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Isolement par sélection avec le métronidazole d'un mutant de Nostoc sp. excrétant de l'hydroxyproline et déficient en pigment

Résumé Un mutant deNostoc sp. déficient en pigment a été induit par la N-méthyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine et sélectionné dans un milieu contenant du métronidazole. Ce mutant forme des chaînes d'hétérocystes, pousse plus lentement que le contrôle, et excréte de l'hydroxyproline dans le milieu, conférant aux cultures une coloration brun rosâtre.

     

Isolation and characterization of an amylolytic yeast:Candida edax

Summary A new amylolytic yeastCandida edax CBM20 was isolated from soil. The strain was able to grow at 37°C and pH 4.5 on a soluble starch (mineral salts) medium with a maximum specific growth rate of 0.59 h^–1 and a cell yield of 0.58 g per gram utilized starch. The strain synthesized high activities of intra- and extra-cellular -amylase and glycoamylase.Candida edax CBM20 is considered to be a good candidate for single-cell protein production from starch.

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Resumen Se ha aislado una nueva levadura amilolítica,Candida edax CBM 20 a partir del suelo. La cepa puede crecer a 37°C y a pH 4.5 en un medio mineral con almidón soluble, obteniendose una tasa de crecimiento máxima de 0.59 h^–1 y un rendimiento celular de 0.58 g por gramo de almidón utilizado. La cepa sintetiza elevades actividades de -amilasa y de glucoamilasa tanto intra como extracelulares. Se considera aCandida edax como un buen candidato para la producción de proteínas celulares a partir de almidón.

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Résumé Une nouvelle levure amylolytique,Candida edax CBM20, a été isolée à partir du sol. La souche peut pousser à 37°C et pH 4,5 sur un milieu minéral contenant de l'amidon soluble avec un taux de croissance maximum de 0.59 h^–1 et un rendement cellulaire de 0,58 g par g d'amidon utilisé. La souche synthétise de fortes activités -amylase et glucoamylase, toutes les deux intra-et extra-cellulaires.Candida edax CBM20 est considérée comme un bon candidat pour la production de protéines d'organismes unicellulaires à partir d'amidon.

     

Tolerance ofRhizobium phaseoli to acidity,aluminium and manganese

Summary Strains ofRhizobium phaseoli were evaluated with respect to their ability to grow or survis when subjected to various stresses common to soils of the tropics. These stresses included low pH, high Al and Mn. In liquid culture 10 strains ofR. phaseoli all grew well at pH 5.0, a few strains grew at pH 4.5 and one at pH 4.0. Some strains grew at pH 4.0 after repeated transfer to medium at this pH, but this characteristic remained stable for only one strain, S-442, which combined a tolerance to low pH with an improved tolerance to Al and Mn compared to the parent strain P-442. Survival studies of S-442 and P-442 in three acidic Brazilian soils, at their natural pH (4.2–4.6) and when limed to near neutral pH, showed little difference in numbers after a 21–30 day period. Only a one log cycle decrease in numbers of P-442 occurred in the Erechim soil that had a 185 mol/l Al concentration in the soil saturation extract. Strains ofR. phaseoli were screened for their ability to grow in liquid culture at pH 5.0 in the presence of Al up to 100 mol/l (16 strains) and Mn up to 320 g/ml (13 strains). Strains differed in relative tolerance to both Al and Mn with some strains being capable of excellent growth at the highest concentrations of Al and Mn employed. With the exception ofR. phaseoli (C-12) the ability to tolerate high levels of Mn did not show any relationship to Al tolerance. It was concluded that soil stress factors need not have a serious impact on survival ofR. phaseoli in soils because sufficient variability in tolerance to these factors occurs naturally among strains.

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Resumen Se evaluaron cepas deRhizobium phaseoli en relación con su habilidad para crecer o sobrevivir bajo las condiciones de stress que son habituales de suelos tropicales. Estas condiciones comprenden bajos pH y altas concentraciones de Al y Mn. Diez cepas deR. phaseoli crecieron bien, en cultivo líquido, a pH: 5; tan solo algunas lo hicieron a pH: 4.5 y únicamente una cepa creció a pH: 4.0. Aunque varias cepas consiguieron crecer a pH: 4.0, tras transferencias sucesivas a un medio con dicho pH, esta característica solo logró establizarse en la cepa S-442 que combinó esta tolerancia a la acidez con un incremento en la tolerancia a Al y Mn comparada con la cepa parental P-442. Se realizaron estudios sobre la supervivencia de las cepas S-442 y P-442 en tres suelose ácidos del Brasil, en estado natural (pH: 4.2–4.6) y neutralizados con cal. Se observaron pocas diferencias cuantitativas al cabo de un periodo de 21–30 dias un solo ciclo Log de P-442 mostró una disminución numérica en un suelo denominado Erechim que contenía 185 mol/l de Al medido en extracto de pasta saturada. Se estudió la capacidad de cepas deR. phaseoli para crecer en cultivo liquido a pH: 5.0 en presencia de hasta 100 mol/l de Al (16 cepas) y 320 g/ml de Mn (13cepas), algunas de estas cepas fueron capaces de crecer a las máximas concentraciones de Al y Mn utilizadas. ExceptuandoR. phaseoli (C-12) la tolerancia a niveles altos de Mn no estaba correlacionada con la tolerancia al Al. Se concluyó que estos factores edáficos de stress no deberían de tener efecto alguno en la supervivencia deR. phaseoli en suelo, ya que existe una variabilidad natural de tolerancias a dichos factores suficiente para garantizar esta supervivencia.

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Résumé Des souches deRhizobium phaseoli ont été téstées pour leur aptitude à se développer et à survivre lorsqu'elles soumises à diverses contraintes habituelles dans les sols tropicaux, c'est à dire des pH acides et à de fortes teneurs en Al et Mn. En culture liquide, 10 souches deR. phaseoli ont toutes poussé à pH 5,0, un petit nombre à pH 4,5 et une seule à pH 4,0. Certaines souches parviennent, après repiquages répétés, à se developper à pH 4,0; mais ce caractère ne s'est stabilisé que dans le cas d'une seule souche (S-442), qui présente à la fois une résistance à l'acidité et une tolérance accrue à Al et Mn par rapport à la souche originelle P-442. L'étude de la survie de S-442 et P-442 dans trois sols brésiliens acides, à leur pH naturel (4,2–4,6) et après chaulage à pH neutre, n'a montré au bout de 21 à 30 jours que de faibles différences numériques. Dans le sol d'Erechim, où la concentration en Al est de 185 mol/l, on n'a constaté dans l'extrait de sol à saturation qu'une diminution de la population d'un seul facteur logarithmique. Des souches deR. phaseoli ont été téstées pour leur aptitude à pousser en milieu liquide à pH 5,0 et en présence de concentrations allant jusqu'à 100 mol/l d'Al (16 souches) et 320 g/l de Mn (13 souches). Les souches différent en ce qui concerne leur résistance à la fois à Al et à Mn, certaines étant capables de se développer très bien aux concentrations en Al et Mn les plus élevées. A l'exception deR. phaseoli C-12, la tolérance aux fortes concentrations en Mn ne présente aucune corrélation avec la résistance à Al. En conclusion, les facteurs d'agression n'ont pas d'effet important sur la survie deR. phaseoli dans le sol, étant donné que le tolérance des souches à ces facteurs peut varier de façon suffisante.

     

Production of fuel ethanol from cassava

Summary Ethanol production from fresh cassava roots using a low-temperature process was evaluated on a pilot-plant scale. The application of low-temperature cooking to cassava starch followed by a dual enzyme action resulted in an ethanol yield comparable to that of a traditional high-temperature cooking process. Pressurized distillation gave a satisfactory recovery efficiency of ethanol but was slightly lower than that obtained from atmospheric pressure distillation. Over 40% of the normal steam consumption was saved by adopting the low-temperature cooking and pressurized distillation systems in the cassava-to-ethanol process. The yield of anhydrous ethanol varied with the starch content in fresh cassava roots and was in the range of 185 to 200 liters per tonne.

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Resumen La producción de etanol a partir de raices frescas de cassava como materia prima, empleando un procedimiento a baja temperatura, ha sido evaluada a la escala de planta piloto. El empleo de baja temperatura en el tratamiento del almidón de cassava, sequido de una doble acción enzimática ha resultado en un rendimiento de etanol comparable al obtenido con el procedimiento tradicional de elevada temperatura. La destilación bajo presión ha presentado un rendimiento de etanol satisfactorio, aunque ligeramente inferior al obtenido en la destilación a la presión atmosférica. Se ahorro más de un 40% de consumo de energía en forma de vapor de agua al adoptar el tratamiento del almidón a baja temperatura y el proceso de destilación bajo presión en la producción de etanol a partir de cassava. El rendimiento de etanol anhidro varió según el contenido de almidón de la materia prima, oscilando entre 185 a 200 litros pot tonelada de cassava.

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Résumé La production d'éthanol à partir de racines fraîches de cassava comme matière première, à basse température, a été évaluée à l'échelle de plante d'essai. L'utilisation de température basse pour le traitement de l'amidon de cassava, suivi d'une double action enzymatique, a résulté en un rendement d'éthanol comparable a celui obtenu par le procédé traditionel a température élevée.: La destilation sous pression s'est présentée satisfaisante en ce qui concerne le rendement en éthanol. Cependant, celui-ci s'est montré légèrement inférieur à celui obtenu par destilation à la pression atmosphérique. Une économie d'énergie en forme de vapeur d'eau de plus de 40% a été le résultat de l'emploi de basse temperature pour le traitement de l'amidon de cassava et du procédé de destilation sous pression dans la production d'éthanol à partir de racines de cassava. Le rendement en éthanol anhydre a varié selon le contenue en amidon de la matière première, en oscillant entre 185 et 200 litres par tonne de racines de cassava.

     

World culture collections ofRhizobium

Summary Reliable and efficientRhizobium germplasm banks are essential for the development of research and for practical application. The second edition of the World Catalogue ofRhizobium Collections lists 64 institutions in 38 countries holding some 3000 effective, tested strains. MIRCENs Culture Collections are playing an important role in this way and in the dissemination of valuable strains for legume inoculation. Constraints for development are: adequate facilities and equipment, trained personnel, co-ordination of effort. Recommendations are: preparation of an inventory on technical aspects, new directives for training and for next edition of the Catalogue, establishment of specialized germplasm banks.

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Resumen Los bancos de germoplasma deRhizobium son esenciales tanto para el desarrollo de la investigación como para el de las aplicaciones prácticas. La segunda edición del catálogo mundial de las colecciones deRhizobium cuenta con 64 instituciones repartidas en 38 países con un total de más de 3000 cepas de probada eficacia. Las colecciones de cultivos de los MIRCEN tienen un papel importante tanto en su valor intrínseco como en la distribución de cepas eficaces para la inoculación de leguminosas. Los principales problemas con los que se enfrenta su desarrollo son: facilidades adecuadas y equipamientos; personal cualificado y coordinación de esfuerzos. Las recomendaciones son: preparación de inventarios sobre aspectos técnicos; nuevas directrices para la formación de personal y para la edición de catálogos; establecimiento de bancos de germoplasma especializados.

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Résumé Des collections deRhizobium fiables et efficaces sont essentielles à la fois pour la recherche et pour les applications agricoles. La deuxième édition du catalogue mondial des collections deRhizobium comporte 64 institutions, situées dans 38 pays, et environ 3.000 souches testées. Les collections de cultures des MIRCEn jouent un rôle important sur le plan scientifique et en ce qui concerne la distribution de souches utilisées pour l'inoculation des légumineuses. Leur développement est soumis à des difficultés concernant les installations et l'équipement, le personnel qualifié, et la coordination des efforts. Il est recommandé de faire l'inventaire des aspects techniques et de formuler de nouvelles directives pour la formation technique, pour la prépartion d'une nouvelle édition du catalogue, et pour l'établissement d'une banque de gènes spécialisée.

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Invited paper presented at the VII International Conference on the Global Impacts of Applied Microbiology, Helsinki, 12–16.8.1985. Session 2     

Nutrient optimization for cellulase biosynthesis by a newly isolatedCellulomonas sp.

Summary A cellulolytic bacterium has been isolated from soil and identified as aCellulomonas sp. Optimization of media components and environmental factors led to a 17-fold increase in cellulase activity within 40 h. The trace elements Zn²⁺, Co²⁺ and Cu²⁺ caused severe inhibition, which could be reduced by the addition of EDTA. The enzymes endoglucanase, exoglucanase and xylanase were always present irrespective of the carbon source used.

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Resumen Se ha aíslado e identificado comoCellulomonas sp. una bacteria cellulolítica del suelo. Mediante la optimización de los componentes del medio de crecimiento y de los factores ambientales se consiguió un incremento de 17 veces de la actividad cellulásica en 40 horas. Los elementos traza Zn²⁺, Co²⁺, y Cu²⁺ causaron una severa inhibición que pudo reducirse gracias a la adición de EDTA. Independientemente de la fuente de carbono utilizada los enzimas endoglucanasa, exoglucanasa y xilanasa se encontraron siempre presentes en el medio.

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Résumé Une bactérie cellulolytique a été isolée à partir du sol et identifiée commeCellulomonas sp. L'activité cellulase en 40 h a été accrue 17 fois par optimisation des constituants du milieu et des conditions de culture. Des traces de Zn²⁺, Co²⁺, et Cu²⁺ déterminent une sévère inhibition, qui peut être réduite par l'addition d'EDTA. Les enzymes endoglucanase, exoglucanase et xylanase sont toujours présentes, quelque soit la source de carbone utilisée.

     

Rapid method for isolation and purification of protoplasts from epidermal tissue ofVicia faba L. leaves

Summary A method has been developed for isolating and purifying epidermal and guard cell protoplasts (ECPs and GCPs) from leaves ofVicia faba L. This method has three essential characteristics: 1) requires only small quantities of initial plant tissue; 2) is rapid, being based on a two-step enzymatic digestion and purification by discontinuous density gradient centrifugation using Percoll, and 3) gives a high viability of purified protoplasts. The procedure yielded about 6% ECPs and 10% GCPs on the basis of their occurrence on epidermal foliar tissue, the final suspension of protoplasts being 100% pure. Cell viability was assessed by the ability of each protoplast type to accumulate neutral red in their vacuoles. Values of 90% and 95% were obtained for ECPs and GCPs respectively. The complete lack of cell wall after enzymatic treatment was checked at the light microscope level by the absence of Calcofluor fluorescent staining of cellulosic material. Representative counts for purified ECPs and GCPs obtained at the interfaces of 20/30% and 40/80% Percoll gradients were 1.32×10⁵ and 3.7×10⁵ elements/ml, which represents a yield of 930 and 2,200 protoplasts/cm² of epidermal tissue respectively. The integrity of the plasma membrane and organelles after the isolation procedures was confirmed by transmission electron microscopy and by the ability of protoplasts to exclude Evans blue.

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Resumen Se ha desarrollado un método para el aislamiento y purifición de protoplastos de células epidérmicas y células guardianas (PCEs PCGs) de hojas deVicia faba L. Este método posee tres características esenciales: 1) solamente requiere pequeñas cantidades de tejido vegetal inicial; 2) rapidez, en base a una digestión enzimática de sólo dos etapas y centrifugación en gradiente discontinuo de Percoll, y 3) la elevada viabilidad de los protoplastos purificados. Este método permitió obtener ca. 6% de PCEs y 10% de PCGs sobre la base de su ocurrencia en el tejido epidérmico foliar, con una pureza del 100% para las suspensiones finales de protoplastos. Se determinó la viabilidad de cada tipo celular por su habilidad de acumular rojo neutro en sus vacuolas, obteniéndose valores de 90% y 95% para PCEs y PCGs respectivamente. Se determinó la ausencia total de pared celular después del tratamiento enzimático mediante microscopía de fluorescencia con Calcofluor, específico para sustancias celulósicas. El recuento de PCEs y PCGs purificados — obtenidos en las interfases 20/30% y 40/80% del gradiente de Percoll — fue de 1,32×10⁵ y 3,7×10⁵ elementos/ml, lo cual representó un rendimiento de 930 y 2200 protoplastosi cm² de tejido epidérmico respectivamente. La integridad de la membrana plasmática y de las organelas fue confirmada por microscopía electrónica de transmisión y por la habilidad de los protoplastos de excluir azul de Evans.

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Résumé Une méthode a été développée pour l'isolement et la purification de proto-plastes épidermiques (ECPs) et de cellules de garde (GCPs) de feuilles deVicia faba L. Cette méthode présente trois caractéristiques essentielles: 1) Elle ne requiert que de petites quantités du tissu végétal originel; 2) elle est rapide, car elle se base sur une digestion enzymatique en deux étapes et une purification dans un gradient discontinu de densité utilisant le Percoll, et 3) elle fournit une forte proportion de protoplastes prufiés bien vivants. La procédure fournit environ 6% d'ECPs et 10% de GCPs sur la base de leur présence dans le tissue foliaire épidermique et d'une suspension pure à 100% de protoplastes. La viabilité des cellules a été testée par la capacité de chaque type de protoplaste d'accumuler de rouge neutre dans ses vacuoles. On a obtenu des valeurs de 90% et de 95% respectivement pour les ECPs et les GCPs. L'absence totale de paroi cellulaire après le traitement enzymatique a été vérifiée au microscope optique par l'absence de fluorescence après coloration du matériel cellulosique par le calcofluor. Des comptages typiques pour les ECPs et les GCPs purifiés obtenus aux interfaces 20/30% et 40/80% des gradients de Percoll ont donné 1.32×10⁵ et 3.7×10⁵ éléments/ml, ce qui représente des rendements respectifs de 930 et de 2200 protoplastes par cm² de tissue épidermique. L'intégrité de la membrane plasmique et des organites après les procédures d'isolement a été confirmée par microscopie électronique à transmission et par la papacité de protoplastes d'exclure le bleu d'Evans.

     

Response ofWestiellopsis prolifica andAnabaena sp. to salt stress

Summary The response of a salt-tolerantWestiellopsis prolifica ARM 366 and a sensitiveAnabaena C-10 to NaCl was studied. While the former could tolerate up to 400mm NaCl, the latter was highly sensitive to concentrations above 50mm NaCl. Under salt stress, the tolerantW. prolifica showed an increased nitrogen demand as exemplified by high nitrogenase activity, and growth inhibition at higher concentrations of NaCl did not appear to be a direct consequence of inhibition of nitrogen fixation. One of the striking responses to Na⁺ challenge by the tolerantW. prolifica was the excess production of extracellular polysaccharides which adsorbed the bulk of the Na⁺. The influx of Na⁺ into the cell was comparatively small.

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Resumen Se estudió la respuesta al NaCl deWestiellopsis prolifica ARM 366, organismo tolerante a la sal, y deAnabaena C-10 que es sensible. El primero pudo tolerar concentraciones de hasta 400mm NaCl, sin embargo Anabaena C-10 se mostró extremadament sensible a concentraciones superiores a 50mm de NaCl. Bajo condiciones de estrés salinoW. prolifica mostró un incremento en la demanda de N₂, como se deduce de la elevada actividad nitrogenásica; la inhibición del crecimiento a concentraciones superiores de NaCl no se pudo relacionar directamente con la inhibición de la fijación de nitrógeno. Una de las respuestas más sorprendentes deW. prolifica frente al Na⁺ fue la producción de un exceso de polisaccaridos extracelulares que absorbieron gran parte del Na⁺. El flujo de Na⁺ hacia la célula fue, pues, comparativemente pequeño.

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Résumé On a étudié la réponse au NaCl d'une souche halo-tolérante deWestiellopsis prolifica (ARM 366) et, d'une souche halo-sensible d'Anabaena (C-10). Alors que la première tolère jusqu'a 400mm NaCl, la seconde est hautement sensible aux concentrations supérieures à 50mm. Soumise à un choc de salinité, la souche halo-tolérante deW. prolifica présente une demande d'azote accrue, comme le montre une activité nitrogénase élevée, et l'inhibition de la croissance par une forte concentration en NaCl ne parait pas être la conséquence directe d'une inhibition de la fixation d'azote. Une réponse remarquable deW. prolifica à l'agression par Na⁺ est la production en excès de polysaccharides exo-cellulaires, qui absorbent la plus grande partie du Na⁺. La pénétration de Na⁺ dans la cellule est relativement faible.