Taq DNA耐热聚合酶在大肠杆菌中的克隆和高表达

从水生栖热菌(Thermus aquaticus)YT-1中分离得到的Taq DNA 聚合酶是一种广泛应用于PCR的耐热DNA聚合酶。由于天然菌株酶产量较低,培养条件要求严格,酶的纯化过程极为繁琐而使产品成本较高,因而促使人们构建适合于大规模生产的基因工程菌株。已有人分别通过不同的途径,使用不同的载体,成功地在大肠杆菌菌株中表达了Taq 耐热DNA聚合酶基因。我们通过与前人不同的途径,把这一基因克隆到大肠杆菌的载体质粒pJLA503上并使其得以高表达,为降低生产成本和进一步研究该酶的各种特性提供了有利条件。     

嗜热菌Thermus sp.YBJ-1的分离和淀粉酶基因的克隆

从西藏热泉水样分离得到一株嗜热菌(YBJ-1),其16S rDNA(1511bp)序列与栖热菌(Thermus scotoductus ITI-252T)的同源性为98％。通过PCR技术将Thermus sp．YBJ-1的淀粉酶基因(amyT)全长开放阅读框克隆到T载体。分析表明,amyT的ORF全长为1767bp,编码588个氨基酸。推导的氨基酸序列与嗜热脂肪芽孢杆菌的阿尔法环糊精酶(Bacillus stearothermophilus alpha-eyclodextrinase)和栖热菌Thermus sp．IM6501的麦芽糖淀粉酶(Thermus sp．IM6501 mahogenic amylase)分别有99％和96％的同源性,与嗜热脂肪芽孢杆菌的新普鲁兰酶(neopullulanase)的同源性为81％。     

一种喜温酶能加速DNA定序

Cetus公司的一些研究人员已注意到一些能在天然温泉水中生长的异常细菌,并从中发现有一种耐热酶可以改进其一项新的DNA扩增技术。这项技术有希望对艾滋病(AIDS)和其它一些疾病作出更好的DNA探针诊断。DNA扩增技术需要一系列重复循环。每次循环中都有一步需要高温,因高温能使需要反应的DNA聚合酶试剂失活。所以,每次循环都必须添加额外的DNA聚合酶。利用一种喜温水生栖热菌(Thermus aquaticus)的耐热DNA聚合酶     

腾冲热海一株栖热菌裂解性噬菌体的分离及其特征

【目的】Thermus(栖热菌)属是嗜热细菌中比较古老的类群,本研究探索从腾冲热海热泉分离栖热菌噬菌体,并初步分析其特征。【方法】采用"双层平板法"从云南腾冲热海碱性热泉中分离纯化栖热菌噬菌体;对噬菌体及其宿主进行电镜形态观察,并进行噬菌体基因组限制性酶切片段多态性分析、噬菌体生理特征及蛋白组成分析。【结果】从腾冲热海热泉分离获得1株裂解性噬菌体,其宿主菌TC10通过16S rRNA基因序列分析鉴定为Thermus属菌株。此噬菌体为长尾型,头部直径67nm,尾管长837nm、宽10nm,最适感染温度为65℃-70℃,最适感染pH值为7.6,对氯仿不敏感,其形态与分离自俄罗斯勘察加半岛热泉的栖热菌噬菌体P23-45和P74-26有一定的差异,蛋白组成差异显著,为一株新的栖热菌噬菌体,命名为TTSP10(Tengchong Thermus Siphoviridae Bacteriophage)。     

高温放线菌的多样性

高温微生物能在高温环境下生存,并能维持其自身生理生化过程的酶系和化合物的稳定性[1].自1969年发现水生栖热菌(Thermus aquaticus)以后[2],高温菌就引起微生物学家的极大关注.高温菌两个显著的特点决定了其在现代分子生物学和工业应用上的重要价值:一是热稳定性功能分子;二是生长极快且会自溶,能在高温条件下发酵而不易受污染.     

LCR将引致诊断学革命

聚合酶链反应(PCR)的分枝——连接酶链反应(LCR)因其易于自动化并可得出定量结果,在诊断学中可能比PCR更有效。此两种方法均以DNA扩增和水生栖热菌(Thermus aquaticus)的耐高温酶为基础,只是在LCR中使用的是DNA接连酶。PCR利用包括目标序列在内的寡核苷酸片段(OFs)进行扩增,而LCR所用的OFs是实际存在于目标序列中的OFs。因此,用PCR法扩增的序列是不确定的,必须经过进一步鉴定,而用LCR法只扩增特定的OFs,所以扩增和检测一步完成。     

红色亚栖热菌TPS/TPP海藻糖合成途径中相关基因的克隆、表达及功能鉴定

通过构建红色亚栖热菌(Meiothermus ruberCBS-01)的基因组DNA文库,克隆得到该嗜热菌海藻糖合成途径中的磷酸海藻糖合成酶(TPS)和磷酸海藻糖磷酸酯酶(TPP)基因。以pET21a为表达载体,将磷酸海藻糖合成酶和磷酸海藻糖磷酸酯酶在大肠杆菌中进行表达并纯化,利用薄层层析的方法验证了这两个酶的活性。同时,本研究检测了红色亚栖热菌在各种环境压力下细胞内含物成分的变化情况,发现在高渗环境压力的诱导下,该菌会在胞内积累大量的6-磷酸海藻糖,而并非海藻糖,这为进一步研究TPS/TPP和TreS途径在细胞体内的作用奠定了基础。     

重组嗜热栖热菌海藻糖合酶制备海藻糖的工艺条件优化

海藻糖具有独特的生物活性,在多种行业应用广泛。海藻糖合酶能够专一性催化麦芽糖一步生成海藻糖。本文通过PCR扩增获得了来源于Thermus thermophilus ATCC33923的海藻糖合酶基因Tre S,构建了基因工程菌E.coli BL21(DE3)/p ET-24a(+)-Tre S。工程菌在摇瓶中发酵28 h时,胞内海藻糖合酶酶活达到最高值为6.4 U/m L。进一步研究了该重组酶制备海藻糖的影响因素,发现当以10%麦芽糖为底物,初始反应p H 7.5,加酶量为15 U/g麦芽糖,40℃,150 r/min反应24 h,转化率达到最高值,为49.0%。当底物浓度提高至20%~40%时,转化率为45.4%~46.2%。     

一个产生L-乳酸脱氢酶的嗜热菌的新种——非解朊栖热菌

从广东省阳江、电白和韶关等地55—95℃的温泉中采集水样,经分离得到21株G-,不产生芽孢的高温菌。它们都能产生L—乳酸脱氢酶。根据表观特征,DNA的同源性和G十cmol％等特征可归人栖热菌属(Thermus)。但对葡萄糖不产酸和不液化明胶等表型特征不同于已发表的种。又根据该群内的DNA／DNA杂交结果,有高的同源性(大多在80％以上),而与已发表的种仅有40.5—70.7％的同源性。结果表明可成立一独立的类群,建议为栖热菌属的一个新种,因具不液化明胶的特性,命名为非解朊栖热菌(Thermus nonproteolyticus Cai ＆Yaagsp nov.)。以菌株HG—42为模式株,保藏于中国科学院微生物研究所。     

嗜热栖热菌α-葡萄糖苷酶基因的表达及酶学性质研究

用PCR方法从嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)HB27中扩增出编码α-葡萄糖苷酶基因hbg,将其克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET28a( )上,电击转化E.coliBL21(DE3),获得高效表达hbg基因的大肠杆菌重组菌。重组菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表达蛋白相对分子质量约为59kD,与预期分子量相符。经镍柱和阴离子交换柱纯化的重组表达的α-葡萄糖苷酶HBG最适温度为95℃,最适pH值为5.0。     

一株产异淀粉酶栖热菌的生长和产酶初步研究

异淀粉酶是一类在工业中有重要应用价值的淀粉酶,从云南梁河温泉水样中分离筛选到1株产异淀粉酶的菌株,初步鉴定为栖热菌(Thermus)。该菌在8~19 h为对数生长期,17 h生长最快,20 h后进入稳定期,产酶伴随菌体生长同时发生,进入稳定期后产酶迅速提高,39 h产酶量达最高,初始酶活达4.14 u/mL。     

海藻糖微生物酶法合成机制的研究*

来源于嗜酸热古菌芝田硫化叶菌 (Sulfolobusshibatae)B1 2的麦芽寡糖基海藻糖合酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖海藻糖水解酶 (MTHase)基因在大肠杆菌中获得表达。将获得纯化的两个酶 ,分别以麦芽寡糖和淀粉为转化底物 ,在pH5 5 ,6 0℃条件下合成海藻糖。从反应产物分析结果可知 ,两个酶合成海藻糖时能利用的最小底物是麦芽四糖 ,海藻糖产率与麦芽寡糖链长正相关。同时还发现两个酶都具有轻微的α 1 ,4 葡萄糖苷酶活性 ,能在麦芽寡糖还原末端水解α 1 ,4糖苷键     

云南温泉高温菌的研究Ⅲ保山县摆洛塘温泉中的极端嗜热细菌

用1~#、7~#PPY三种培养基,从保山摆洛塘温泉(86℃,pH7.0)分离到生长温度范围为35—75℃的极端嗜热细菌4株,即“YN8617”、“YN8618”、“YN86290”,YN86291”。经鉴定,“YN3617”和“YN86291”为Bacillus stearother mophilus,“YN86290”为Becillus caldolyticus;“YN3618”暂定为“Extremely thermophilic strains of B.Coagulans”。没有分离到水生栖热菌属(Thermus)的细菌。     

海藻糖微生物酶法合成机制的研究

来源于嗜酸热古菌芝田硫化叶菌(Sulfolobus shibatae)B12的麦芽寡糖基海藻糖合酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖海藻糖水解酶(MTHase)基因在大肠杆菌中获得表达。将获得纯化的两个酶,分别以麦芽寡糖和淀粉为转化底物,在pH5.5,60℃条件下合成海藻糖。从反应产物分析结果可知,两个酶合成海藻糖时能利用的最小底物是麦芽四糖,海藻糖产率与麦芽寡糖链长正相关。同时还发现两个酶都具有轻微的α-1,4-葡萄糖苷酶活性,能在麦芽寡糖还原末端水解α-1,4糖苷键,生成葡萄糖分子,其反应最小底物分别是麦芽三糖和四糖。推测海藻糖合成酶可能有两个不同的催化活性中心。     

重组极耐热木聚糖酶和重组极耐热漆酶协同漂白麦草浆

利用来自海栖热袍茵的重组极耐热木聚糖酶XynB和来自嗜热栖热菌Thermus thermophilus HB27的重组极耐热漆酶Tth-laccase对麦草浆进行协同漂白。结果表明,当未漂浆经XL漂序处理(X:重组木聚糖酶用量20 U/g绝干浆,pH 5.8,温度90℃,浆浓8%,处理时间2 h;L:重组漆酶用量3 U/g绝干浆,pH 4.5,温度90℃,浆浓8%,处理时间1.5 h),可获得最佳漂白效果。与对照浆比较,XL处理使浆料白度提升11.5%ISO,卡伯值降低6.9。双酶协同处理在改善浆料可漂性的同时,对纸浆纤维强度无负面影响。在后续过氧化氢漂白段中,当漂终白度相近时,XL预处理浆可节省约50%H_2O_2消耗量。     

从嗜热栖热菌中提取超氧物歧化酶的研究

嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)ATCC 27634是一种适于75—80℃高温中生长的微生物。该菌超氧物歧化酶为一胞内酶,分子量为80000,由181个氨基酸组成。本试验对其发酵、破菌、Rnasel酶解、硫酸铵盐析、滤除小分子物质、上DE-32Ⅰ、DE-32Ⅱ柱分离等条件进行了一系列研究,提取到了热稳定性较商的Mn²⁺-SOD,比活力为3000u/mg,回收率达78.0%。     

耐热古菌芝田硫化叶菌海藻糖生成相关酶的基因克隆、表达和序列分析

从耐热古菌海藻糖芝田硫化叶菌B12中分别克隆出海藻糖生成相关酶——麦芽寡糖基海藻糖合酶的基因treY和麦芽寡糖基海藻糖基水解酶的基因treZ,测定了其核苷酸序列并进行了表达.其中treY编码的蛋白质有728个氨基酸、分子质量为86 ku;treZ编码的蛋白质有559个氨基酸、分子质量为65 ku.它们与已报道的其他微生物的两个海藻糖生成相关酶的基因进行同源性比较,treY和treZ的同源性分别为93%和76%（硫矿硫化叶菌P2）、97%和95%（硫矿硫化叶菌KM1）、63%和66%（嗜酸热硫化叶菌ATCC33909）、48％和50%（节杆菌Q36）、48%和52%（根瘤菌M11）、50%和52％（短杆菌）.通过PHYLIP软件进行这些基因序列的分类聚类计算,获得这几种微生物间两个酶类的蛋白质系统进化树;经过氨基酸序列比较分析还发现,所有的海藻糖生成相关酶都含有糖苷酶家族13中几个高度保守的α-淀粉酶催化活性区,推测这些海藻糖生成相关酶都可能有着共同的进化来源.     

亚栖热菌透性化细胞的耦合固定化研究

将海藻酸盐凝胶包埋法与交联法和聚电解质静电自组装覆膜法相耦合,对含有海藻糖合酶活性的亚栖热菌的透性化细胞进行了固定化研究。结果表明,利用重氮树脂和聚苯乙烯磺酸钠对海藻酸凝胶微球交替覆膜,可以显著提高凝胶微球在磷酸盐缓冲液中的稳定性,以碳二亚胺对固定化细胞进行交联处理则可以提高固定化细胞中海藻糖合酶的热稳定性。透性化细胞经包埋－交联－覆膜耦合固定化后,酶活回收率为32％,最适酶反应pH值由6.5左右升至7.0左右,最适反应温度未变,仍为60℃。所得固定化细胞间歇反应时,催化麦芽糖转化为海藻糖的转化率可达60％,重复使用4次（每次50℃、反应24h）,酶活损失小于20％,转化率可保持在50％以上。     

利用定点突变分析海藻糖合酶的功能

我们通过对来自红色亚栖热菌(Meiothermus ruber) CBS-01中的海藻糖合酶(Trehalose synthase)序列比对及三维模型构建, 我们构建了D200G/H165R, R227C, R392A三个定点突变体, 检测其对麦芽糖及海藻糖的转化能力。结果发现: 在50°C时, D200G/H165R、R392A基本失去其原有活性, 而R227C产生海藻糖的能力降低。37°C时, D200G/H165R失去转化能力, 而R392A及R227C保有部分能力。因此我们推测, R392位点可能是维持酶的结构及热稳定性的关键位点, 而D200位点在反应过程中也起重要作用。     

耐高温海藻糖合酶产生菌鉴定及生长特性研究

目的:从蒙古一处高温温泉水中分离产耐高温海藻糖合酶的嗜热菌株,并确定该菌株的分类学地位。方法:通过研究其形态特征、培养特征、生理生化特征和16S rDNA序列,根据《伯杰氏细菌鉴定手册》进行菌种分类鉴定,同时并对其生长特性进行初步研究。结果:筛选出的嗜热菌株SN02004-01具有芽孢杆菌的典型特征,其16S rDNA序列与GenBank中的Bacillus sp.E26311的亲缘关系最近,二者的16S rDNA序列相似性为99.9%;该菌的最适pH、最适生长温度分别为pH7.0、65℃。结论:极端环境(高温)中也存在具有产生耐高温海藻糖合酶的嗜热微生物。