植物Ⅴ类几丁酶苦瓜同源基因(McChi5)的克隆及特征分析

苦瓜是一种病害很少的蔬菜作物.用3′RACE方法从苦瓜叶片RNA中扩增了一个与烟草Ⅴ类几丁酶序列相似的片段,进一步用Y-RACE方法扩增了相应的5′端序列.经序列拼接,获得了植物Ⅴ类几丁酶苦瓜同源基因(McChi5)的全长cDNA基因.该基因全长1348bp,含有一个1044bp的ORF.推测的蛋白质由347个氨基酸组成,计算所得的分子量为38.3kD,等电点为5.77.同源性分析表明,McChi5蛋白与烟草V类几丁酶、拟南芥的推测几丁酶和类几丁酶蛋白、以及哺乳动物和细菌的一些几丁酶有序列相似性,并具有第18家族糖基水解酶的保守域.Southern blotting表明,在苦瓜基因组中存在2个拷贝的McChi5基因,同时也存在少数同源基因.RNA dot blotting分析表明,McChi5基因有组成性表达的特性,伤害处理对其表达的影响不明显.对McChi5基因可能的生物功能和应用作了进一步的讨论.     

单克隆抗体亲和层析法纯化重组溶葡萄球菌酶

溶葡萄球菌酶能够特异性杀灭金黄色葡萄球菌且不易产生耐药性, 有望成为治疗葡萄球菌属细菌引发感染的特效药物。为获得高纯度的重组溶葡萄球菌酶以达到药用标准, 本研究构建了一种以重组溶葡萄球菌酶单克隆抗体为配体的亲和层析纯化方法。纯化后的重组溶葡萄球菌酶纯度大于95%, 得率大于90%, 即使重复使用30多次, 纯化效率不变。且经比色法鉴定纯化后的重组溶葡萄球菌酶仍具有良好的活性。该方法步骤简单, 纯化效果好, 为生产高纯度重组溶葡萄球菌酶奠定了基础。     

纯化,测定植物中细胞分裂素的免疫亲和层析法和酶联免疫法

近年来微量的植物激素的定量分析方法有很大发展,Weiler将放射免疫技术引入细胞分裂素的测定,许多研究者对植物激素的免疫测定做了改进。细胞分裂素的酶联免疫吸附分析(ELISA)具有灵敏度高、特异性强、不需要昂贵设备、无放射性污染等优点,日益为各实验室采用。如何简化植物样品的纯化步骤,提高检测的选择性和灵敏度仍然是细胞分裂素免疫测定的限制因素。本     

用免疫亲和层析法纯化萝卜 PHGPx 天然蛋白

萝卜磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶 (RsPHGPx) 是一个定位于线粒体的蛋白质 . 为了阐明该蛋白质线粒体定位信号的准确切割位点,采用了免疫亲和层析方法纯化天然的 RsPHGPx. 用重组 RsPHGPx 蛋白免疫兔子获得了抗 RsPHGPx 的多克隆抗血清,以重组 RsPHGPx 蛋白为配体,采用亲和层析技术对抗血清进行了纯化,得到了单特异性的抗 RsPHGPx 的抗体 . 将纯化好的抗体偶联到一个 N- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 预先激活的琼脂糖柱子上,装配成一个以单特异性的抗 RsPHGPx 抗体为配体的免疫亲和层析柱 . 经过对纯化条件的摸索和优化,形成了一个简单、特异的一步法纯化方案 . 按照该方案,从萝卜幼苗线粒体总蛋白质提取物中纯化到一个分子质量与预期值相一致的特异蛋白质 . 免疫印迹分析表明,该蛋白质被抗 RsPHGPx 的抗血清特异识别 . 酶活性分析表明,该蛋白质具有显著的 PHGPx 活性 . 这些结果表明,纯化到的特异蛋白质是萝卜的 RsPHGPx 天然蛋白 . 这是首个关于定位于植物细胞器的 PHGPx 蛋白纯化的报道 . 这一结果为准确测定 RsPHGPx 信号肽的切割位点奠定了基础,并将有助于对植物 PHGPx 的亚细胞定位机制及其生理功能的深入研究 .     

高等植物几丁酶研究进展

几丁醇是一种分解聚N—乙酰胺基葡萄糖分子的糖苷酶,普遍存在于自然界。高等植物中,几丁酶虽然普遍存在,但迄今没有发现底物。因此,高等植物几丁酶的功能是个十分吸引人而又研究不多的问题。本文介绍高等植物几丁酶的分布、酶学性质,基因结构和可诱导性等研究结果。并介绍了几丁酶在植物抗真菌病中的作用的研究进展。     

亲和层析法分离纯化猪肺血管紧张素转换酶

亲和胶合成实验以双环氧化合物1,4-丁二醇-2-缩水甘油醚(1,4-butanediol diglycidyl ether)为活化体及连接臂,在硼氢化钠(NaBH)存在的碱性条件下,将载体Sepharose CL―4B与雷诺普利(lisinopril)共价连接在一起,成功合成亲和层析胶,并利用亲和层析胶对猪肺血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme, ACE）进行分离提纯.猪肺组织匀浆经1.6～2.6 mol/L硫酸铵分级沉淀、透析平衡、亲和柱分离等步骤,从200 g猪肺中提纯得到0.79 mg ACE蛋白,酶活力回收11.9％,比活力38.8 U/mg.与层析前的酶液比较,亲和层析一步提纯可达264倍;与肺匀浆液比较提纯达808倍.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳可见,提纯的猪肺ACE为一条带,分子质量约为180 ku.     

植物V类几丁酶苦瓜同源基因（McChi5）的克隆及特征分析

苦瓜是一种病害很少的蔬菜作物,用3′RACE方法从苦瓜叶片RNA中扩增了一个与烟草V类几丁酶序列相似的片段,进一步用Y－RACE方法扩增了相应的5′端序列,经序列拼接,获得了植物V类几丁酶苦瓜同源基因（McChi5)的全长cDNA基因,该基因全长1348bp,含有一个1044bp的ORF。推测的蛋白质由347个氨基酸组成,计算所得的分子量为38．3kD,等电点为5．77,同源性分析表明,McChi5蛋白与烟草V类几丁酶,拟南芥的推测几丁酶和类几丁酶蛋白,以及哺乳动物和细菌的一些几丁酶有序列相似性,并具有第18家族糖基水解酶的保守域,Southern blotting表明,在苦瓜基因组中存在2个拷贝的McChi5基因,同时也存在少数同源基因,RNA dot blotting分析表明,McChi5基因有组成性表达的特性,伤害处理对其表达的影响不明显,对McChi5基因可能的生物功能和应用作了进一步的讨论。     

亲和层析法纯化人绒毛膜促性腺激素

本文介绍了一种应用抗hCG β亚单位单克隆抗体亲和层析提纯hCG的方法。结果表明,该法具有简便、快速、经济、产品活性高等优点。hCG回收率为96％,免疫学活性17000IU/mg蛋白,生物学活性(小鼠子宫称重法)达到10 000U/mg蛋白以上。     

免疫亲和层析法纯化单链尿激酶型纤溶酶原激活剂

尿激酶原 (Ｐｒｏ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ,ｐｒｏ ＵＫ) ,也称单链尿激酶型纤溶酶原激活剂 (Ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎｕｒｏｋｉｎａｓｅ ｔｙｐｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ,ｓｃｕ ＰＡ) ,与ｔ ＰＡ一样是第二代溶栓药物。给药时 ,保持无活性的酶原状态 ,只激活被纤维蛋白吸附的纤溶酶原 ,而对游离的纤溶酶原没有作用 ,即只在血栓表面才能活化转变为双链尿激酶 (Ｔｗｏ ｃｈａｉｎｕｒｏｋｉｎａｓｅ ｔｙｐｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ,ｔｃｕ ＰＡ或ＵＫ) ,因而具有较高的特异性溶血栓作用[1 ] 。尿激酶原…     

Purification and Some Properties of Chitinase from Momordica charantia

Chitinase was purified from Momordica charantia L. by affinity chromatography. The purified enzyme showed single band on sodium dodecyl sulfate polyacrylamicle gel electrophoresis and the molecular weight was estimated as 35 kD. The enzyme was stable at temperatures up to 50℃ or less than 10 % loss of activity in 1 h. Its optimum temperature was about 45 ℃. Its suitable pH had a rather wide range from pH 4.4 to pH 6.8 and the optimum pH was about 6.2. The activity of the enzyme was similar in root and stem. In the lower leaves,the activity was higher than that of the upper.     

比色法测定苦瓜中的总皂甙

本试验通过对高氯酸和硫酸体系进行比较,选择香草醛-冰醋酸-高氯酸体系作为测定苦瓜皂甙的合适显色条件,并对体系中各个因素逐一考察,确定比色法测定苦瓜皂甙的条件为：0．2mL冰醋酸,0．8mL高氯酸,5％香草醛．冰醋酸溶液,70℃条件下反应20min。试验以苦瓜皂甙建立了苦瓜皂甙测定回归曲线,线性和稳定性可靠,平均加标回收率100．78％,变异系数为1．910％。     

HPLC-ELSD测定苦瓜皂甙的含量

本文用HPLCELSD法测定苦瓜中皂甙B的含量。色谱条件:色谱柱ZorbaxSBC18,4.6×150mm;检测器ELSD(EvaporativeLightScatteringDetector);柱温30℃;流动相:甲醇水(70:30);流速1.0mL/min,N2压力:2.0×105Pa。皂甙B的保留时间在为7.295min,在浓度为0.1058～5.290μg/μL之间有很好的线性关系(R2=0.9918)。平均加标回收率为100.27%(n=3),RSD=2.83%。实验结果表明此方法可以作为苦瓜皂甙的定量测定方法     

苦瓜离体培养过程中内源激素含量的变化

针对苦瓜（Momordica charantia）离体培养中外植体易于产生愈伤组织而难以再生不定芽的问题,本文采用酶联免疫吸附法,研究了苦瓜组织培养过程中不同发育阶段各外植体内源激素含量的变化,以探讨不定芽分化与激素水平变化之间的关系,以及苦瓜难以再生不定芽的内在制约因素。结果表明：（1）苦瓜外植体中LAA含量较高,而iPAs含量过低,是苦瓜易于产生愈伤组织而不定芽再生困难的主要原因;（2）不定芽的分化与IAA／iPAs的变化有密切的关系;（3）在离体培养过程中,保持外源细胞分裂素类物质（如ZT）的适当浓度并及时继代,有利于苦瓜不定芽的分化。     

苦瓜的核糖体失活蛋白

核糖体失活蛋白是一类专一修饰核糖体的大亚基rRNA从而抑制蛋白质生物合成的蛋白毒素,可分为Ⅰ-型和Ⅱ-型两种类型。苦瓜中含有多种Ⅰ-型核糖体失活蛋白,如α-苦瓜素,β-苦瓜素和MAP30等,这些蛋白成分具有抗肿瘤、抗病毒和抗艾滋病等功能,因而近年来引起人们广泛的关注。对苦瓜核糖体失活蛋白的研究进展和应用前景进行了综述。     

Study of Specific Protein on Sex Differentiation of Momordica charantia

In Momordica charantia L. the soluble protein profile of flower bud at hermaphroditic stage and three early developmental stages (the 7th, 10th and 13th day after initial budding) of male and female flowers were analysed with capillary electrophoresis. Some specific proteins related to sex differentiation were detected. The 11 kD protein, which appeared at the 7th day of budding and existed through the three developmental stages of the female flowers with little change of content, might be an "essential protein" for the expression of female flower differentiation program. Similarly, the 30 kD protein might be an "essential protein" for the expression of the male flower differentiation.     

苦瓜胚胎学研究

以石蜡制片法对苦瓜(Momordica charantia L.)进行了胚胎学研究。小孢子母细胞减数分裂时,胞质分裂为同时型,形成四面体型四分体和左右对称型四分体。成熟花粉为二细胞型。子房三室,双珠被,厚珠心,倒生胚珠。大孢子四分体为线形,合点端功能大孢子发育成为蓼型胚囊。中央细胞细胞质中有大量贮藏物质存在。极核在受精时融合。双受精过程属有丝分裂前配子融合类型。3个反足细胞随受精过程进行而退化。胚胎发生为柳叶菜型。核型胚乳,合点端具胚乳吸器。     

长白大苦瓜高效再生系统的建立

目的:长白大苦瓜是蔬菜新品种,其高效再生系统的建立有助于蔬菜的快速生产,克服季节性、地域性对蔬菜生产的影响。方法:通过不同激素之间的配比寻找合适的种子萌发、不定芽分化和生根培养基。结果:预处理可有效提高种子萌发率,并获得长势整齐、健壮的无菌苗。添加6-BA 0.5mg/L NAA 0.5mg/L的培养基诱导的不定芽分化率较高,而激素组合6-BA 2mg/L NAA 0.5mg/L则对诱导丛生芽具有较好的效果。添加NAA 0.5mg/L能使试管苗的生根率达到50%。经过3d炼苗,移入腐叶土和泥炭土比例为1∶1的基质土壤中就可以正常生长。结论:长白大苦瓜可以建立高效的再生系统,实现试管苗的快速生产。     

苦瓜核糖体失活蛋白的分离纯化及其抑制烟草花叶病毒活性

目的:探讨分离纯化苦瓜种子核糖体失活蛋白(RIP)的方法,并研究利用纯化后的RIP抑制烟草花叶病毒(TMV)的活性。方法:用盐溶液抽提总蛋白后,经30%～90%的(NH4)2SO4分级沉淀,制成粗提液。用CMSepharoseFastFlow离子交换层析结合SephadexG-75凝胶柱分离纯化RIP。结果与结论:经SDS-PAGE检测及RNAN-糖苷酶活性鉴定,确定最终得到的蛋白为苦瓜RIP;所纯化的RIP对感染黄瓜和番茄的TMV有明显的抑制作用,但RIP的浓度并不与其抑制TMV的活性呈正相关。     

Identification of triterpene biosynthetic genes from Momordica charantia using RNA-seq analysis

Cucurbitaceae plants contain characteristic triterpenoids. Momordica charantia, known as a bitter melon, contains cucurbitacins and multiflorane type triterpenes, which confer bitter tasting and exhibit pharmacological activities. Their carbon skeletons are biosynthesized from 2,3-oxidosqualene by responsible oxidosqualene cyclase (OSC). In order to identify OSCs in M. charantia, RNA-seq analysis was carried out from ten different tissues. The functional analysis of the resulting four OSC genes revealed that they were cucurbitadienol synthase (McCBS), isomultiflorenol synthase (McIMS), β-amyrin synthase (McBAS) and cycloartenol synthase (McCAS), respectively. Their distinct expression patterns based on RPKM values and quantitative RT-PCR suggested how the characteristic triterpenoids were biosynthesized in each tissue. Although cucurbitacins were finally accumulated in fruits, McCBS showed highest expression in leaves indicating that the early step of cucurbitacins biosynthesis takes place in leaves, but not in fruits.

Abbreviations: OSC: oxidosqualene cyclase; RPKM: reads perkilobase of exon per million mapped reads