犬冠状病毒大熊猫株纤突蛋白全基因的克隆与序列分析

在国内首次对犬冠状病毒大熊猫野毒株(CCVDXMV)纤突蛋白基因进行了克隆和序列测定。该基因全长4362bp,编码1453个氨基酸,N端前18个氨基酸为推测的信号肽序列,后1435个氨基酸构成成熟蛋白。与GenBank中已发表的11个CCV毒株s基因相比,s基因核苷酸序列同源性在40．2％-99．5％之间;推导的氨基酸序列同源性在15．9％-99．O％之间。DXMV株s基因变异区主要集中在该基因前1／2处,其中350．370、439．478、1718．1818三个区域碱基变异较大,而1060．1700区却十分保守。基于s全基因及其蛋白的聚类分析表明,DXMV株与K378、NVSL和USpatent株亲源关系最近。推导的DXMV株s蛋白氨基酸序列潜在的N-联糖基化位点与CCV强毒V54相同,为34个,比Insavc．1弱毒多一个;其中第566．568位糖基化位点为多数强毒拥有而弱毒没有的。另外,DXMV株S蛋白疏水性及抗原表位与其它毒株有一定的差异,这些差异对DXMV株致病性和免疫原性等影响尚待进一步的研究。     

犬冠状病毒大熊猫株纤突蛋白全基因的克隆与序列分析

在国内首次对犬冠状病毒大熊猫野毒株(CCV DXMV)纤突蛋白基因进行了克隆和序列测定.该基因全长4362bp,编码1453个氨基酸,N端前18个氨基酸为推测的信号肽序列,后1435个氨基酸构成成熟蛋白.与GenBank中已发表的11个CCV毒株S基因相比,S基因核苷酸序列同源性在40.2%～99.5%之间;推导的氨基酸序列同源性在15.9%～99.0%之间.DXMV株S基因变异区主要集中在该基因前1/2处,其中350-370、439-478、1718-1818三个区域碱基变异较大,而1060-1700区却十分保守.基于S全基因及其蛋白的聚类分析表明,DXMV株与K378、NVSL和US patent株亲源关系最近.推导的DXMV株S蛋白氨基酸序列潜在的N-联糖基化位点与CCV强毒V54相同,为34个,比Insavc-1弱毒多一个;其中第566-568位糖基化位点为多数强毒拥有而弱毒没有的.另外,DXMV株S蛋白疏水性及抗原表位与其它毒株有一定的差异,这些差异对DXMV株致病性和免疫原性等影响尚待进一步的研究.     

犬冠状病毒纤突蛋白基因的测序与比较分析

采用双脱氧链终止法测定了首次分离于我国犬脾脏和肠内容物的两株犬冠状病毒(CCV) CCV YS1和CCV CI1,以及从美国引进的CCV NL-18株P_1、P_2和P_3、P_4引物间(见上文,两引物间核苷酸片段大小分别为57 bp和343 bp)的部分纤突蛋白(S)基因序列,并用DNASIS和PROSIS计算机软件进行了比较分     

SARS冠状病毒E蛋白基因的克隆与表达

E蛋白是存在于SARS病毒表面的一个小分子蛋白,在病毒的出芽过程中有重要的作用。为建立一种检测SARS病毒抗原的新方法,将E蛋白全基因序列分段合成,用连接酶连接后插入pET—GST载体,转化大肠杆菌BL21进行融合表达,结果得以成功表达GST-E融合蛋白;为SARS病毒致病机理研究和疫苗及诊断试剂的研制打下了基础。     

不同型犬腺病毒纤突蛋白基因序列的比较分析

根据已发表的CAV纤突基因序列,用PCR方法,对4个CAV-2毒株和4个CAV-1毒株的纤突基因进行了扩增和测序,测定的核苷酸序列经推导得到分别编码543和542个氨基酸的CAV纤突蛋白全序列.测定的CAV2比较表明我国流行的CAV-2 SY强毒株与国外标准强毒株Toronto A26/61株柏同,其驯化致弱的毒株与驯化前相比在1134位发生碱基颠换.测定的CAV-1比较表明我国流行的CAV-1株与标准强毒RI261株差异相对较大,而国内CAV-1毒株互相之间相对差别较小.CAV-2与CAV-1纤突基因的同源性为80.48%.     

不同型犬腺病毒纤突蛋白基因序列的比较分析

根据已发表的ＣＡＶ纤突基因序列,用ＰＣＲ方法,对４个ＣＡＶ－２毒　株和４个ＣＡＶ－１毒株的纤突基因进行了扩增和测序,测定的核苷酸序列经推导得到分别编　码５４３和５４２个氨基酸的ＣＡＶ纤突蛋白全序列。测定的ＣＡＶ－２比较表明：我国流行的ＣＡＶ－２　ＳＹ　强毒株与国外标准强毒株Ｔｏｒｏｎｔｏ　Ａ２６／６１株相同,其驯化致弱的毒株与驯化前相比在１１３４位　发生碱基颠换。测定的ＣＡＶ－１比较表明：我国流行的ＣＡＶ－１株与标准强毒ＲＩ２６１株差异相对　较大,而国内ＣＡＶ－１毒株互相之间相对差别较小。ＣＡＶ－２与ＣＡＶ－１纤突基因的同源性为８０．４８％。     

重组痘病毒表达SARS冠状病毒纤突蛋白及其免疫原性分析

对牛痘病毒弱毒株表达的SARS冠状病毒纤突蛋白(Spike protein,S)的免疫原性进行分析与比较.以减毒痘病毒(WR株)为载体重组了SARS冠状病毒全长S基因(rWR-SARS-S).SDS-PAGE和Western blot试验表明,迁移率约为190kD的重组SARS S蛋白可在HeLa细胞中表达,而且可以被鸡抗SARS全病毒高免血清识别,具有特异免疫反应原性.进一步研究表明,rWR-SARS-S感染的细胞在IFA试验中可与鸡抗SARS的高免血清发生特异反应,具有良好的敏感性和特异性.以104PFU的rWR-SARS-S免疫BALB/c小鼠产生的抗体在间接ELISA试验中可以被S蛋白识别,产生特异抗原抗体反应.利用痘病毒表达的SARS冠状病毒S蛋白具有良好的抗原性和生物学活性,可替代SARS冠状病毒全病毒,为研究安全、敏感和特异的重组诊断抗原奠定了重要基础.     

猪源冠状病毒TGEV中国分离株纤突蛋白生物信息学分析

以猪源冠状病毒(Porcine coronavirus) TGEV 纤突蛋白基因序列为基础,利用生物软件对TGEV中国分离株纤突蛋白进行N-糖基化位点、跨膜螺旋、进化树、二级结构及抗原位点的预测和分析.结果显示所有TGEV毒株可分为3个基因型,4株中国分离株分别归属于以上3个基因型,属于Ⅰ型的中国株TSX在跨膜螺旋的氨基酸及二级结构上与其他中国株有明显的差异,而同属于Ⅲ型中国毒株SC-Y和TH- 98在跨膜螺旋的氨基酸及二级结构上非常接近,而所有中国分离株抗原表位没有明显差别,表明TGEV在中国没有显著的变异.     

SARS冠状病毒的刺突蛋白

严重急性呼吸系统综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)是由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(SARS corona-vims,SARS-CoV)引起的呼吸系统疾病。SARS-CoV的刺突蛋白(spike protein)具有S1和S2两个独特的功能结构域,研究发现两者都是进行疫苗和抗体研究的理想和有效的靶点。对非典疫苗的研究生产非常有价值,对预防和治疗SARS也有重大意义。     

登革病毒NS3全基因的扩增与克隆

登革热(DF)、登革出血热及登革休克综合征(DHF/DSS)是由登革病毒所致的两种不同临床类型的急性传染病,广泛流行于全球热带及亚热带地区.DHF/DSS以高热、出血、休克、高病死率为主要特征,近年来其发病率有迅速增加的趋势,已成为严重影响人类健康的公共卫生问题.     

登革病毒NS3全基因的扩增与克隆

登革热(ＤＦ)、登革出血热及登革休克综合征(ＤＨＦ/ＤＳＳ)是由登革病毒所致的两种不同临床类型的急性传染病,广泛流行于全球热带及亚热带地区。ＤＨＦ/ＤＳＳ以高热、出血、休克、高病死率为主要特征,近年来其发病率有迅速增加的趋势,已成为严重影响人类健康的公共卫生问题。迄今,ＤＨＦ/ＤＳＳ的发病机制仍不清楚,亦无有效的特异性预防方法[1]。登革病毒属于黄病毒科的黄病毒属,有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个血清型,基因组为单股正链ＲＮＡ,全长约11ｋｂ,编码三种结构蛋白和七种非结构蛋白。基因组顺序为5′ＣＰｒＭＥＮＳ1ＮＳ2ａＮＳ2ｂＮＳ3Ｎ…     

SARS冠状病毒N蛋白基因的克隆、表达及活性测定

利用PCR基因扩增法,以SARS冠状病毒全基因质粒为模板,获得N蛋白相应抗原基因,构建了表达载体pBV220／SARS-N,并在E．coli中获得高效表达。用纯化后的N蛋白抗原包被测定板,通过间接ELISA法对阴阳性血清进行活性测定,结果表明,在46份阳性血中有41份被测出,检出率为89．13％。本研究克隆并表达了SARS冠状病毒N蛋白,为进一步研制SARS病人抗体检测试剂和SARS疫苗奠定了基础。     

SARS冠状病毒Nsp14基因的克隆与表达

对SARS冠状病毒的非结构蛋白Nsp14的基因全长进行了克隆表达。根据公布的SARS冠状病毒的非结构蛋白Nsp14的基因序列设计引物,用PCR的方法把该基因从SARS冠状病毒的cDNA片段中扩增出来,经限制性内切酶BamHI与XhoI双酶切后插入到原核表达载体pET30a( )中,建成重组载体pET30a-Exo。重组载体转化大肠杆菌并进行诱导表达,通过原核表达的方法得到了该蛋白。这为该蛋白的进一步研究奠定了基础。     

昆虫杆状病毒衣壳主蛋白基因的PCR扩增,克隆和定位

用ＰＣＲ技术成功地扩增了苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）的衣壳主蛋白基因（ｖｐ３９基因）,并克隆了该基因,利用纯的ｖｐ３９基因探针,在低严谨杂交条件下,已将粘虫核型多角体病毒（ＬｓＮＰＶ）的ｖｐ３９基固定位在ＰｓｔＩ－Ｆ,ＢａｍＨＩ－Ｃ,ＥｃｏＲＩ－Ｃ,ＸｈｏＩ－Ｄ,Ｉ,ＥｃｏＲＶ－Ｈ,Ｘ等片段上。ＰＣＲ反应时,在扩增出预期的包括完整ｖｐ３９基因的１４０６ｂｐ片段的同时也扩增出一条Ｃａ．４００ｂｐ的片段,本文讨论了ＰＣＲ的特异性扩增和非特异性扩增。     

鸡传染性支气管炎病毒H株纤突蛋白S1基因的克隆及其在毕赤酵母中表达

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)河南分离株H,经SPF鸡胚增殖,差速离心纯化病毒,SDS-蛋白酶K法抽提病毒RNA。参照IBV Bcaudette株纤突蛋白S1基因序列设计并合成引物,以其进行RT—PCR,成功地扩增出IBV H株S1基因。扩增产物经Bst YⅠ Hae Ⅲ和Pst Ⅰ酶切分析,结果表明,IBV H株S1基因的RFLP图谱与M41株S1基因的完全一致,初步断定IBV H株为Mass血清型。将IBVH株S1基因克隆于pGEM—T载体中进行序列分析,结果表明该基因全长为1611bp(从ATG到S前体蛋白裂解位点),与标准株M41和Beaudette的S1基因序列相比较,同源率分别达到97．39％和97、27％。将IBV H株S1基因亚克隆到pPICZ—A表达载体,转化毕赤酵母中,SDS—PAGE实验证实了IBV H株S1基因在毕赤酵母中得以表达,进一步用鸡抗IBV血清做Westernblot检测．证实了表达产物的抗原特异性。     

犬冠状病毒S蛋白主要抗原区基因片断的表达及免疫原性

应用Pichiapastoris酵母表达了犬冠状病毒大熊猫野毒株(CCV DXMV)S蛋白主要抗原区基因片断.用特异性引物扩增出CCVDXMV株S1基因片断,并将其克隆到pGEM-T载体中得到pTS1.用KpnI和NotI双酶切pTS1回收目的基因S1定向克隆到pPICZαA中,构建出重组质粒pPICZ αAS1.将pPICZαAS1用SacI内切酶线性化后,电转化感受态GS115酵母细胞,用PCR法筛选阳性重组子.用1%的甲醇诱导重组酵母菌,取培养物上清进行重组蛋白的检测.结果重组酵母菌培养物上清用SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为106kDa大小的重组蛋白,Western-blot证实该重组蛋白可以与CCV多克隆抗体发生特异性血清学反应.凝胶薄层扫描分析表明,3株重组酵母菌在1%甲醇诱导144h后,重组蛋白S1表达量约占培养物上清总蛋白量的6.6-8.6%左右.用重组蛋白S1免疫BALB/C小鼠3次后,小鼠血清CCV中和抗体可达18-116,表明重组S1蛋白具有一定的免疫原性.     

犬冠状病毒S蛋白主要抗原区基因片断的表达及免疫原性

应用Pichia pastoris酵母表达了犬冠状病毒大熊猫野毒株(CCV DXMV)S蛋白主要抗原区基因片断。用特异性引物扩增出CCV DXMV株S1基因片断,并将其克隆到pGEM-T载体中得到pTS1。用KpnI和Notl双酶切pTS1回收目的基因S1定向克隆到pPICZCαA中,构建出重组质粒pPICZCαAS1。将pPICZCαASl用SacI内切酶线性化后,电转化感受态GS115酵母细胞,用PCR法筛选阳性重组子。用1％的甲醇诱导重组酵母菌,取培养物上清进行重组蛋白的检测。结果重组酵母菌培养物上清用SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为106kDa大小的重组蛋白,Westem-blot证实该重组蛋白可以与CCV多克隆抗体发生特异性血清学反应。凝胶薄层扫描分析表明,3株重组酵母菌在1％甲醇诱导144h后,重组蛋白S1表达量约占培养物上清总蛋白量的6．6-8．6％左右。用重组蛋白S1免疫BALB／C小鼠3次后,小鼠血清CCV中和抗体可达1：8-1：16,表明重组S1蛋白具有一定的免疫原性。     

大熊猫SRY基因的PCR扩增和克隆

本文采用人ＳＲＹ基因的一对引物,通过ＰＣＲ扩增获得了雄性大熊猫ＳＲＹ基因片段。表明大熊猫存在与人ＳＲＹ基因同源的相应基因,将ＰＣＲ产物与载体ｐＵＣ－Ｅｃｏ－Ｔ连接后,用以转化ＪＭ１０９菌,经过与人ＳＲＹ基因探针菌落杂交筛选获得了大熊猫ＳＲＹ苈在克隆,命名为ｐＡＭＹ０．６,其插入片段为相应于人ＳＲＹ基因保守区在内的一段约６０９ｂｐＤＮＡ。此外,还制作和比较分析了人和大熊猫基因片段的限制酶图谱。     

犬传染性肝炎病毒Hexon蛋白Loop1、Loop2基因的克隆与表达

犬传染性肝炎病毒（ICHV）主要的中和抗原表位位于六邻体蛋白Loop1、Loop2上。本次研究参考Genebank发表的基因序列设计引物,提取ICHV基因组DNA,,分别PCR扩增六邻体蛋白（Hexon）的Loop1、Loop2基因片段,用T4酶连接在一起,克隆入原核表达载体pET28a中,测序显示本室保存病毒分离株Loop1与CLL株、RI261株和Toronto A26/61株核苷酸序列同源性分别为100%、100%和83.8%;Loop2与CLL株、RI261株和Toronto A26/61株核苷酸序列同源性分别为88.1%、88.1%和99.3%,推导的氨基酸序列同源性分别为93.6%、93.6%和98.6%。转化BL21工程菌,实现了重组Loop蛋白在大肠杆菌中的高效表达,其表达的重组蛋白以包涵体形式存在,分子量约为36kDa,并且利用镍柱纯化重组蛋白,纯度达95%以上。本实验为建立新的犬传染性肝炎病毒基因工程产品奠定了良好的基础。     

犬传染性肝炎病毒Hexon蛋白Loop1、Loop2基因的克隆与表达

腺病毒主要的中和抗原表位位于六邻体蛋白Loop1、Loop2上,目前的研究主要集中在人腺病毒,犬传染性肝炎病毒（即犬腺病毒Ⅰ型）尚未见报道。本次研究参考Genebank发表的基因序列设计引物,提取ICHV基因组DNA,分别PCR扩增六邻体蛋白（Hexon）的Loop1、Loop2基因片段,用T4酶连接在一起,克隆入原核表达载体pET28a中,测序显示本室保存病毒分离株Loop1与CLL株、RI261株和TorontoA26/61株核苷酸序列同源性分别为100%、100%和83.8%;Loop2与CLL株、RI261株和TorontoA26/61株核苷酸序列同源性分别为88.1%、88.1%和99.3%,推导的氨基酸序列同源性分别为93.6%、93.6%和98.6%。转化BL21工程菌,实现了重组Loop蛋白在大肠杆菌中的高效表达,分子质量约为36kDa,并且利用镍柱纯化重组蛋白,纯度达95%以上。用重组蛋白免疫BALB/c小鼠后,以间接ELISA法测定血清抗病毒抗体效价达1：320以上,western blot鉴定免疫血清与ICHV特异性结合。本实验为建立新的犬传染性肝炎病毒基因工程产品奠定了良好的基础。