应用反向PCR克隆慢病毒介导的转基因小鼠整合位点序列

目的：为分析慢病毒介导的转基因小鼠中外源基因整合位点的信息,应用反向PCR克隆整合位点序列。方法：小鼠基因组总DNA酶解和自连接后,针对慢病毒载体的特点在LTR附近设计一组特异的PCR引物,优化半巢式PCR的各种参数,提高整合位点序列克隆的效率。结果：克隆了分别携带绿色荧光蛋白（GFP）和转铁蛋白（TF）基因的慢病毒介导的转基因小鼠家系7只小鼠中10个外源基因整合位点序列。结论：本方法可用于慢病毒介导的转基因小鼠整合位点序列的克隆,为分析整合位点与外源基因表达之间的关系等提供了科学依据。     

CHO细胞基因组NW-003614092.1内稳定表达位点的发现*

目的:获得中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO)内稳定表达位点信息,为构建重组蛋白CHO稳定表达株、缩短研发时间线提供信息明确的稳定位点。方法:对慢病毒随机整合Zsgreen1基因的具有潜在稳定表达位点的CHO-K1-1d2细胞株进行连续传代培养,验证表达稳定性;通过染色体步移分析慢病毒载体整合位点,并利用CRISPR/Cas9技术验证位点的可编辑性。结果:CHO-K1-1d2细胞在连续贴壁培养20代、悬浮培养50代过程中,能够100 %发绿色荧光,且荧光强度稳定,能够稳定表达Zsgreen1蛋白;染色体步移分析测序结果表明,CHO-K1-1d2细胞中慢病毒载体整合于CHO细胞基因组NW-003614092.1上第1 159 463与1 159 467碱基间;共转染sgRNA与Cas9质粒后,测序结果表明,该位点可被CRISPR/Cas9技术编辑。结论:CHO细胞基因组NW-003614092.1内存在一个信息明确的、能够被CRISPR/Cas9技术编辑的稳定表达位点。     

慢病毒载体与造血干细胞介导的基因治疗

慢病毒载体不仅能感染造血干细胞 (HSCs) ,使携带的目的基因整合至HSCs基因组内 ,且能利用病毒携带的调控元件 ,使目的基因随HSCs细胞特异性表达 ,因此是一种有效的感染HSCs和进行基因治疗的工具。主要对慢病毒载体基因组特点、改建过程、慢病毒对干细胞的感染能力、慢病毒携带的目的基因在HSCs内的表达及调控等方面做了简要的综述     

噬菌体整合酶介导的位点特异性基因治疗

将治疗基因整合到患染色体上的特定位点并实现稳定的表达是基因治疗的关键,包括病毒载体和转座子系统在内的几种技术已经用于整合,但都存在治疗基因负载力较小及随机整合的应用障碍。来自链霉菌噬菌体中C31、R4及来自乳酸乳球菌噬菌体TP901-1的整合酶,能够识别有限数量的天然基因组序列(假att位点)．从而催化治疗基因位点特异性地整合进入高等真核生物基因组。这种新型的噬菌体整合酶系统在基因负载力及染色体的特异性整合方面具有很大的优越性。迄今为止,这种系统已经成功用于几种基因治疗的研究模型中．将会成为基因治疗的有用工具。     

用慢病毒载体制备转基因动物的研究进展

慢病毒是逆转录病毒的一种 ,具有逆转录病毒的基本结构 ,但也有不同于逆转录病毒的组份和特性 ,作为基因治疗载体发展起来 ,最近已用于转基因动物制备。慢病毒像其它逆转录病毒一样 ,其基因组经逆转录后能整合在宿主DNA上 ;由于病毒载体经改构后 ,不在宿主细胞增殖 ,不会导致寄主细胞的死亡 ,被它感染的或转化的动物细胞能够连续传代 ;这种载体的最大优势是能感染静止细胞和不产生嵌合体动物。详细介绍了慢病毒载体构建原理、近年慢病毒载体在转基因动物制备方法和应用研究的新进展。     

慢病毒载体转录通读率检测方法的建立

慢病毒载体作为一种有效的生物研究和基因治疗载体,近年来正受到广泛关注,而转录通读现象则是限制其被使用的主要生物安全性瓶颈之一.为了评估慢病毒载体在整合入染色体后的转录通读的实际情况,需要建立一种有效的检测转录通读率的方法.文中运用分子生物学等手段,将相关质粒瞬时转染入293T细胞,模拟野生型和自灭活型慢病毒载体整合入染色体后的情况,利用实时荧光定量PCR分别定量转录通读和总转录本在慢病毒载体上的特征序列,并计算出转录通读率;同时使用流式细胞计数等技术,检测转录通读后的GFP蛋白产物.两种检测结果均与理论相符,即自灭活型载体具有更高的转录通读率.说明文中所建立的方法有效可靠,为进一步评估和降低慢病毒载体的转录通读率,提高慢病毒载体的生物安全性的研究提供技术支持.     

原位染色检测慢病毒载体转录通读方法的建立

慢病毒载体作为基因导入系统已被多次应用于基因治疗试验当中,近年来受到了广泛关注。转录通读是慢病毒载体应用过程中存在的潜在不安全因素之一。为了进一步完善慢病毒载体转录通读的检测方法,使检测结果更加直观准确,在已建立的在转录水平检测其转录通读的基础上,进一步模拟病毒载体整合入基因组的状态,于原病毒载体3'-LTR后插入经密码子优化的Lac Z报告基因。经转染细胞后进行原位染色,发生通读现象的细胞会被染成蓝色,从而在蛋白质水平直观地体现慢病毒载体的通读情况,说明所建立的方法是准确可行的。所得结论与q RTPCR方法在转录水平检测的结果是平行相一致。原位染色检测法的建立为慢病毒载体转录通读的检测、提高慢病毒载体生物安全性的研究提供了技术支持。     

应用接头PCR克隆慢病毒介导的转基因小鼠整合位点旁侧序列

目的为鉴定慢病毒介导的转基因小鼠中外源基因的整合位点信息,应用接头PCR克隆整合位点旁侧序列。方法小鼠基因组总DNA酶解后与设计的接头片段连接,根据慢病毒的LTR序列设计巢式PCR引物,克隆转基因小鼠整合位点旁侧序列。结果成功克隆到转基因小鼠整合位点的旁侧序列,经过测序定位于小鼠染色体上。结论作为反向PCR的改进,本方法可用于转基因小鼠整合位点旁侧序列的克隆,为分析整合位点与外源基因表达之间的关系等提供了科学依据。     

人细胞基因组AAVS1位点基因定点整合率的荧光定量PCR检测方法

基因疗法是将基因导入靶细胞内,以纠正缺陷和异常基因引起的疾病的治疗方法。目前,多个基因治疗药物已经进入临床研究阶段或已上市,为癌症、罕见病、神经性疾病等多个领域的疾病治疗带来了希望。基因治疗中最关键的步骤就是如何将外源基因准确安全地导入宿主细胞。腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)载体是当前最受欢迎的人类基因治疗载体之一,它是唯一能定点整合到人类基因组特定位点的病毒载体。AAV定点整合的位点AAVS1 (the adeno-associated virus site 1)已经被证明是安全的基因整合位点。本实验以Rep蛋白介导基因定点整合至人T淋巴细胞基因组AAVS1位点,随后采用标准曲线定量的方法,对混合细胞克隆AAVS1位点的定点整合率进行定量。实验进行两轮PCR,首先通过常规PCR扩增包含ITR-AAVS1结合位点的序列,然后取标准品和检测样本第一轮PCR产物作为模板,进行第二轮定量PCR。通过本实验中的研究方法可以简单快速地定量分析AAVS1定点整合率。     

慢病毒载体的设计及应用进展

慢病毒载体是一类重组逆转录病毒载体,由于其结构和功能的特点作为一种重要的基因转移工具被应用于基因治疗和细胞分子生物学研究领域。目前,为进一步完善慢病毒载体的功能,研究者们从提高载体的生物安全性及增强外源基因的表达调控能力等方面对慢病毒载体进行了改建。本文对慢病毒载体的设计进展及应用进行了简要综述,展望了今后的研究前景。     

稳定表达HLA-A33蛋白细胞系的建立

旨在构建能稳定表达HLA-A33蛋白的细胞系,并观察其在细胞中的表达水平.首先克隆取得HLA-A33基因,并将其插入慢病毒载体,经酶切和测序鉴定,确定载体构建正确.通过慢病毒系统感染正常RD细胞,将HLA-A33基因整合进RD细胞的基因组.提取构建细胞系的基因组做PCR鉴定,并通过免疫荧光和蛋白免疫印迹法检测,结果显示,HLA-A33基因成功整合入RD细胞基因组中,且在重组细胞系中成功表达.该细胞系可为A33等位基因与HBV感染后的慢性化以及EV71感染的相关研究提供试验参考.     

利用Gateway技术构建慢病毒载体及其在鸡囊胚细胞中的表达

目的:建立慢病毒载体介导的外源基因在动物中表达的模式。方法:通过PCR扩增出带EGFP基因和特异性结合位点的DNA序列,并应用Gateway技术构建了带EGFP基因的pLenti6/v5-DEST慢病毒载体。利用磷酸钙介导慢病毒4质粒系统在包装细胞中转染,收集并浓缩产生的病毒颗粒,通过感染293FT细胞测定慢病毒滴度。结果:通过PCR扩增后测序分析,表明慢病毒载体构建正确。病毒滴度测定结果为2×107TU/mL。并用慢病毒对鸡囊胚细胞进行感染,获得了较强的表达效果。结论:慢病毒载体系统所产生的病毒颗粒对动物细胞具有较强的感染能力,为慢病毒载体在转基因家禽研究中的应用奠定了基础。     

慢病毒载体定量检测方法的研究进展

免疫疗法正在发展成为一种可用于多种恶性肿瘤的有效且侵入性较小的治疗方法。慢病毒载体(Lentiviral vectors,LVs)因其能够稳定地整合相对较大的外源DNA,并且有效地转导分裂细胞和非分裂细胞,已在免疫治疗中显现出巨大潜力。临床应用对慢病毒载体具有较高的质量要求,需要对最终产品进行严格的质量控制以保证其纯度、效力和安全性。其中慢病毒载体的定量检测是产品研发和质控的关键环节之一。文中总结了LVs定量检测的现有方法,包括流式细胞术(Fluorescence activated cell sorter,FACS)、P24酶联免疫法(P24 enzyme-linked immunosorbent assay,P24 ELISA)、实时荧光定量PCR方法 (Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)、纳米粒子跟踪分析(Nanoparticle tracking analysis,NTA)、可调电阻式脉冲传感(Tunable resistive pulse sensing,TRPS)和病毒计数仪(Virus counter,VC),并对其优缺点进行比较,对发展新的检测方法和存在的挑战进行了展望。     

CRISPR/Cas9介导的外源基因靶向插入鸡EAV-HP基因组

本研究旨在通过CRISPR/Cas9介导外源基因靶向插入鸡EAV-HP基因组。首先设计特异性引物并扩增鸡内源性病毒(EAV-HP)左右同源臂和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因表达盒,然后通过重叠延伸PCR技术将两个同源臂DNA连接至eGFP表达盒两侧,获得全长DNA片段LER,并克隆至pMD19-T载体,获得携带eGFP基因的供体载体pMDT-LER。随后在HEK293T细胞中验证供体载体pMDT-LER能成功表达eGFP后,将EAV-HP打靶载体和供体载体共转染至DF-1细胞,观察绿色荧光阳性细胞,提取细胞基因组,PCR检测外源基因eGFP成功整合至鸡基因组EAV-HP位点。最后,将转基因细胞DF-1传至第7代,用PCR和Western blotting检测eGFP在转基因细胞中稳定表达。文中初步验证外源基因eGFP能整合至鸡EAV-HP位点并稳定表达,为转基因鸡的研究提供新整合位点。     

基于人免疫缺陷病毒-1的慢病毒载体系统研究进展

慢病毒能够感染分裂细胞和非分裂细胞,因而被发展成为重要的转基因载体。慢病毒载体已经发展到了第三代,其安全性已经大为提高。经过结构优化的慢病毒载体已经用于转基因动物生产和基因治疗研究,而稳定包装细胞系的建立使得慢病毒的生产更为简便。     

中试制备临床级别第三代慢病毒

基因治疗是一个快速发展的领域,其中关于慢病毒介导的外源基因导入研究得最为广泛。随着研发技术的不断发展,在安全性方面慢病毒已经从第一代发展至第三代,而如何工程化获得高滴度慢病毒仍是当今技术一大瓶颈。运用Fibra-Cel片状载体作为HEK293T细胞载体基质,联合多个无菌细胞转瓶在滚瓶机上培养,对贴壁细胞进行规模放大化生产。通过对第三代慢病毒包装过程中影响慢病毒滴度的因素进行逐一筛选,使病毒滴度达到最优。研究结果成功运用Fibra-Cel片状载体作为HEK293T细胞粘附载体基质,作为一种贴壁细胞规模放大的方法,筛选出了利用滚瓶机制备第三代慢病毒的最优条件,规模化生产了3批慢病毒。在时间上,将慢病毒的生产时间从质粒转染到病毒收集的120 h缩短至54 h;在成本上,利用滚瓶机代替生物反应器实现了无需反复灭菌、全程一次性产品的安全有效低成本的运行,为慢病毒的规模化制备提供了技术上的支持,为临床应用奠定了坚实的基础。     

慢病毒载体转录“通读”改进研究进展

自2002年以来,在用γ-逆转录病毒载体治疗X连锁重度复合性免疫缺陷病 (X-SCID) 的10例病人中已有4例因载体整合在原癌基因lmo2等附近而得了白血病。这一事件提高了人们对基因治疗载体安全性的关注。与γ-逆转录病毒载体相比,慢病毒载体因尚未发现有整合在lmo2附近的现象,被认为是安全性较好的基因治疗载体。然而自灭活慢病毒载体与γ-逆转录病毒载体一样存在着转录“通读”的现象。近些年来,科学家们在改善自灭活慢病毒载体的通读率上做了一些工作并取得了一些积极成果。以下对慢病毒载体转录“通读”现象的发生机理和解决途径作了综合描述。     

广西巴马小型猪miR-122慢病毒表达载体的构建及胚胎水平表达

本实验的目的在于构建PLV-miR-122慢病毒载体并在293T细胞和猪胚胎细胞中进行验证。以广西巴马小型猪基因组DNA为模板,克隆miR-122前体及部分侧翼序列,利用T4连接酶将其连入PLV-CMV-MCS-EF1载体,构建PLV-miR-122慢病毒载体。在293T细胞中过表达PLV-miR-122,通过胞质注射生产转PLV-miR-122的猪胚胎。双酶切和测序结果证明成功构建了PLV-miR-122重组载体,将重组载体转染293T细胞,经胞质注射后观察到其在猪胚胎早期和囊胚期均有绿色荧光表达。本实验成功构建了猪miR-122慢病毒表达载体,在293T细胞中过表达同时生产出转miR-122的阳性胚胎,为后续研究miR-122的功能奠定基础。     

新型小发卡RNA慢病毒表达载体的构建及抗乙型肝炎病毒应用评价

目的:设计用于表达新型小发卡RNA(sh RNA)的慢病毒载体,并考察其用于抗乙型肝炎病毒(HBV)的可行性。方法:对慢病毒载体骨架SapⅠ位点进行突变,并将用于表达新型sh RNA的结构亚克隆到改造后的慢病毒载体;设计靶向HBV保守序列的sh RNA并克隆到该慢病毒载体,包装含有sh RNA序列的重组慢病毒并定量,考察单个及多个sh RNA结构串联对慢病毒滴度的影响;将重组慢病毒感染HBV稳定转染肝细胞系Hep G2.CW(MOI=3),用杀稻瘟菌素筛选稳定克隆1周后,将其重新消化,并以1×105/孔接种于24孔板,于铺板96 h后取细胞上清检测HBs Ag、HBe Ag表达水平和HBV DNA的含量。结果:构建了一种用于表达新型sh RNA的慢病毒载体,并通过设计靶向HBV保守序列的sh RNA实现了HBV复制的高效抑制;发现多个sh RNA串联效果优于单个sh RNA。结论:构建的新型sh RNA慢病毒表达载体可作为防治慢性病毒感染如HBV感染的潜在有效手段之一,值得进一步研究。     

转MSTN干扰载体细胞株的获得及外源基因整合情况的研究

转基因细胞株的建立能够为转基因体细胞克隆技术奠定重要基础。该实验利用MSTN干扰载体,转染鲁西黄牛胎儿成纤维细胞,获得5个相应的转基因单克隆细胞株。采用Realtime PCR和高效热不对称互交式PCR（hiTAIL-PCR）技术检测细胞克隆中MSTN表达载体的拷贝数及其在牛基因组中的整合位点。结果表明,荧光定量PCR有效检测到5个细胞克隆中质粒的拷贝数分别为2.26±0.32、1.52±0.25、25.68±1.02、8.43±0.73和6.72±0.10。hiTAIL-PCR对整合位点的检测结果表明,质粒片段在插入到基因组的过程中进行了重组,其与基因组的结点处有2或4个共同的碱基序列。该研究探索MSTN干扰载体在牛胎儿成纤维细胞中的整合机制,以期获得遗传背景清楚的转基因细胞作为体细胞核移植的重要材料,为高产转基因肉牛新品种的培育提供重要的理论和实验基础。