灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）基因组中T-DNA整合模式分析

摘要：【目的】研究灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）基因组中T-DNA插入位点的整合模式特征。【方法】利用农杆菌（Agrobactirium tumfacience）介导法构建灰葡萄孢菌T-DNA插入突变体库。利用热不对称交错PCR（TAIL-PCR）技术对转化子中T-DNA的旁侧序列进行扩增和克隆,对获得的旁侧序列进行比对分析。【结果】T-DNA插入在灰葡萄孢菌基因组非编码区的占69%,插入在外显子的占30%。T-DNA在插入的过程中发生了碱基缺失、增加等重组现象,其中左边界（left border,LB）整合到基因组碱基缺失较少,有的保持完整,而右边界（right border,RB）及其近邻的T-DNA区域缺失碱基较多。T-DNA的插入位点还发现有额外的序列插入。【结论】对灰葡萄孢菌中插入T-DNA的整合模式的分析为开展该菌的功能基因组学奠定了基础。     

农杆菌介导转化黑曲霉分生孢子及产孢缺陷突变子T-DNA插入位点分析

【目的】利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA系统,建立转化黑曲霉(Aspergillus niger)分生孢子的方法,构建T-DNA插入突变子文库,为黑曲霉基因组功能注释研究打下基础。【方法】采用携带二元质粒载体pCAMBIA1301的农杆菌EHA105,诱导转化黑曲霉分生孢子,筛选具有潮霉素抗性的突变子。分析抗性稳定突变子菌株的表型,采用反向PCR方法分析T-DNA插入位点相邻位置的序列,并推测突变基因可能具有的功能。【结果】实验获得具有稳定潮霉素抗性转化子193株,转化率为5.6×102转化子/108分生孢子。部分转化子表型出现较为明显改变,其中一株不能产孢,对其T-DNA插入位点序列分析比对结果显示,突变基因属于超级转运家族(major facilitator superfamily,MFS)。【结论】本研究建立的农杆菌转化黑曲霉分生孢子平台,结合T-DNA插入突变位点分析,可以为黑曲霉基因组功能注释研究提供一种简便有效的途径。     

根癌农杆菌介导的灰葡萄孢菌遗传转化研究

以pCAMBIA1300-N载体为骨架, 成功构建了以绿色荧光蛋白(gfp)为报告基因, 潮霉素(hph)为抗性筛选标记的载体pKPG, 并利用根癌农杆菌介导转化系统, 成功获得了能表达绿色荧光蛋白的重组灰葡萄孢菌。通过PCR检测转化子的绿色荧光蛋白基因和潮霉素抗性表达框, 观察菌丝和分生孢子的荧光表型, 以及gfp基因的Southern杂交验证, 结果表明：被测转化子基因组中均成功整合了目的基因片段。     

灰葡萄孢分生孢子产生相关基因的克隆及功能分析

[目的]克隆灰葡萄孢分生孢子产生相关基因,并研究其功能,为进一步研究灰葡萄孢分生孢子产生机理和灰葡萄孢侵染及致病机理奠定基础.[方法]通过筛选灰葡萄孢ATMT突变体库,获得一株不能产生分生孢子的突变菌株BCt78,采用PCR和Southern Blotting技术,对突变菌株BCt78进行分子鉴定.利用TAIL-PCR技术获得T-DNA插入位点的侧翼序列;将所获得侧翼序列与灰葡萄孢基因组数据库中的已知基因序列进行BLAST分析,推测出T-DNA的插入位点;通过PCR进一步验证T-DNA的插入位点,利用RT-PCR技术确定突变基因;最后对突变菌株的菌落形态、生长速度、胞壁降解酶活力、粗毒素的生物活性、对番茄叶片的致病能力及部分致病相关基因的表达情况进行研究.[结果]TAIL-PCR结果证实T-DNA插入到灰葡萄孢BCIG 12707.1基因的ATG起始密码子区;RT-PCR结果证实突变基因为BCIG_12707.1,该基因DNA全长为135 bp,编码一个44个氨基酸的假定蛋白(Hypothetical protein).突变菌株在PDA培养基上菌落呈灰白色,生长速度减慢,不能产生分生孢子及菌核;对番茄叶片的致病性增强,且胞壁降解酶(PG、PMG和Cx)活力增强;突变菌株中参与细胞壁降解的角质酶基因cutA和多聚半乳糖醛酸酶基因Bepg1,信号转导途径基因(PKA1、PKA2、Bac、Bmp3),产毒素基因BcBOT2(Sesquiterpene synthase),漆酶基因Lac1,跨膜蛋白基因Btp1表达都增强.[结论]BC1G_ 12707.1基因在灰葡萄孢分生孢子产生、菌核形成及致病力等方面起重要作用.     

农杆菌介导的获取疏绵状嗜热丝孢菌插入突变体体系的建立

[目的]建立疏绵状嗜热丝孢菌的稳定遗传转化体系并获得插入突变体.[方法]利用农杆菌介导的方法建立疏绵状嗜热丝孢菌的遗传转化体系 ;分别通过Southern杂交、克隆转移DNA(T-DNA)侧翼序列来确定T-DNA在疏绵状嗜热丝孢菌基因组中的拷贝数和插入位点.[结果]成功建立了可靠的疏绵状嗜热丝孢菌的遗传转化体系.共培养过程中使用萌发孢子是成功建立疏绵状嗜热丝孢菌遗传转化体系的必要条件.疏绵状嗜热丝孢菌萌发的孢子与农杆菌在28℃共培养48h时,转化效率最高.乙酰丁香酮(AS)在农杆菌预培养及疏绵状嗜热丝孢菌萌发的孢子与农杆菌的共培养阶段都是必需的,且在共培养阶段当AS浓度为500 μM时转化效率最高.Southern杂交验证表明,79.2％的转化子为T-DNA单拷贝插入,且通过热不对称PCR (TAIL-PCR)分析得出T-DNA在该菌基因组中的插入位点是随机的.通过该转化系统筛选到部分表型突变体.[结论]我们首次报道了利用ATMT技术成功转化嗜热真菌-疏绵状嗜热丝孢菌,证明了该方法是一种简单有效的获得插入突变体的方法,并为该嗜热真菌进行基因定位提供了工具.     

农杆菌介导转基因植物T-DNA的整合方式

农杆菌介导的遗传转化已被广泛应用于植物转基因研究。作为外源基因的载体,农杆菌T-DNA片段在植物基因组中的整合方式,不仅影响外源基因的整合效率及稳定性,还会影响外源基因的表达特性。文章就农杆菌介导的T-DNA整合的两种主要模式、规律及相关研究手段进行综述,为农杆菌介导的转基因及T-DNA插入突变等相关研究提供借鉴。     

球孢白僵菌T-DNA突变体库的构建及高温和高渗敏感型突变体的筛选

摘要：【目的】筛选对高温和高渗等逆境胁迫敏感的球孢白僵菌T-DNA随机插入突变体,并克隆相关基因,为研究杀虫真菌适应逆境的分子机理奠定基础。【方法】利用逆境胁迫的方法从球孢白僵菌的T-DNA随机插入突变库中筛选对高温和高渗敏感的突变体,进而利用YADE (Y-shaped adaptor dependent extension)技术克隆相关基因。【结果】筛选得到5个对高温和高渗敏感的突变体。其中2个（212和2550）对高温敏感,在32oC下生长完全受抑;其它3个突变体对高渗胁迫敏感。突变体212的分生孢     

农杆菌介导的葡萄转化研究进展

综述近年来以农杆菌介导法将外源基因转化葡萄的研究进展及基因型、再生途径、农杆菌菌株、菌液浓度、侵染时间、共培养及抗生素等对葡萄遗传转化的影响,并指出当前存在的问题及研究趋势。     

水稻T-DNA插入突变体库的构建及突变类型的分析

利用农杆菌介导的转化系统转化中花11成熟胚愈伤组织,获得1489个独立转化的T-DNA插入再生株系。PCR和Southern杂交的结果表明,69．8％转化株系被整合了T-DNA,通过Tail-PCR也从转化植株中扩增出T-DNA侧翼序列。同时对1066个T1转化株系的抽穗期、株高、单株穗数的调查结果表明,不同株系中分离出了突变植株。     

Ti plasmid type affects T-DNA processing in Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens can transfer the T-DNA region of a Ti plasmid to a recipient plant cell. An accepted model that describes the T-DNA transfer mechanism proposes that single-stranded T-complexes are transferred to a recipient plant via a conjugation-like mechanism. This model has been based on examination of a limited number of Ti plasmids. In this study, the type of processed T-DNA molecule created from multiple Ti plasmids was determined. The form of the processed T-DNA was found to vary and was correlated with whether the T-DNA region was organized as a single continuous region or two adjacent regions.     

根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究

利用根癌农杆菌EHA105进行了哈茨木霉Th-33的转化,在优化的转化条件下,EHA105对木霉菌的转化效率约45-100个转化子/106个孢子。本实验室利用该方法已建立了含4000多个转化子的木霉T-DNA插入突变体库。随机挑选24个转化子进行遗传稳定性分析,结果显示转化子经过5代无选择压力连续转接后都能在选择平板上正常生长;潮霉素抗性基因的PCR扩增和Southern blot杂交分析表明,木霉转化子含有该基因,Southern blot杂交进一步表明转化子多为单拷贝随机插入。该转化体系的改进将有利于木霉菌生防功能基因的克隆和作用机制的研究。     

Radiation-sensitive Arabidopsis mutants are proficient for T-DNA transformation.

Stable transformation of plants by Agrobacterium T-DNAs requires that the transgene insert into the host chromosome. Although most of the Agrobacterium Ti plasmid genes required for this process have been studied in depth, few plant-encoded factors have been identified, although such factors, presumably DNA repair proteins, are widely presumed to exist. It has previously been suggested that the UVH1 gene product is required for stable T-DNA integration in Arabidopsis. Here we present evidence suggesting that uvh1 mutants are essentially wild type for T-DNA integration following inoculation via the vacuum-infiltration procedure. Received: 23 June 1998 / Accepted: 21 February 1999     

根癌农杆菌介导库拉索芦荟遗传转化因素优化

以美国库拉索芦荟的横切薄片(transversethincelllayer,tTCL)作为转化外植体,初步研究了以根癌 农杆菌介导的多种因子对芦荟遗传转化的影响。结果表明:菌株EHA105比LBA4404及AGL1转化率高; 除了乙酰丁香酮(acetosyringone)外,菌液的预处理和重悬液的pH值也是影响转化的主要因子;菌液的预处 理和适合的蔗糖浓度对转化也有促进作用;感染时间为12～18min,共培养的温度和时间分别以25℃及5d 为佳。     

根癌农杆菌介导灭蚊卵菌贵阳腐霉的遗传转化

Pythium guiyangense is a mosquito pathogen, and has been proved to be a promising agent for biological control of mosquitoes. In order to develop the strains adaptable to different ecological environment having stable virulence to mosquito larvae, and being able to prolong the shelf life, an effort was made on transforming the fungus by using homologous or heterologous virulence genes. In this paper, a genetic transformation experiment of P. guiyangense mediated by Agrobacterium tumefaciens is reported. As a result, an A. tumefaciens mediated genetic transformation system was established successfully.