Lethality of hydrogen peroxide in wild type and superoxide dismutase mutants of Escherichia coli. (A hypothesis on the mechanism of H2O2-induced inactivation of Escherichia coli)

The toxicity of H₂O₂ in Escherichia coli wild type and superoxide dismutase mutants was investigated under different experimental conditions. Cells were either grown aerobically, and then treated in M9 salts or K medium, or grown anoxically, and then treated in K medium. Results have demonstrated that the wild type and superoxide dismutase mutants display a markedly different sensitivity to both modes of lethality produced by H₂O₂ (i.e. mode one killing, which is produced by concentrations of H₂O₂ lower than 5 mM, and mode two killing which results from the insult generated by concentrations of H₂O₂ higher than 10 mM). Although the data obtained do not clarify the molecular basis of H₂O₂ toxicity and/or do not explain the specific function of superoxide ions in H₂O₂-induced bacterial inactivation, they certainly demonstrate that the latter species plays a key role in both modes of H₂O₂ lethality. A mechanism of H₂O₂ toxicity in E. coli is proposed, involving the action of a hypothetical enzyme which should work as an O₂^-• generating system. This enzyme should be active at low concentrations of H₂O₂ (<5 mM) and high concentrations of the oxidant (>5 mM) should inactivate the same enzyme. Superoxide ions would then be produced and result in mode one lethality. The resistance at intermediate H₂O₂ concentrations may be dependent on the inactivation of such enzyme with no superoxide ions being produced at levels of H₂O₂ in the range 5–10 mM. Mode two killing could be produced by the hydroxyl radical in concert with superoxide ions, chemically produced via the reaction of high concentrations of H₂O₂ (>10 mM) with hydroxyl radicals. The rate of hydroxyl radical production may be increased by the higher availability of Fe²⁺ since superoxide ions may also reduce trivalent iron to the divalent form.     

耐辐射奇球菌pprM基因增强大肠杆菌氧化抗性的研究

目的:探讨耐辐射奇球菌ppr M基因对大肠杆菌氧化抗性的影响。方法:氯化钙法转化分别构建含pGEX-6p-1-pprM质粒的大肠杆菌DH5α。测定不同浓度过氧化氢对含pGEX-6p-1-pprM、pGEX-6p-1和野生型大肠杆菌DH5α活性的影响以及菌体内SOD/GSH/CAT水平的变化。结果:与空质粒组和野生型组相比,含pprM的大肠杆菌在同浓度过氧化性情况下,其抑菌圈明显缩小,差异有统计学意义。与空质粒组和野生型组相比,含pprM的大肠杆菌体内CAT活力、SOD活性明显提高,但GSH量并没有明显提高。结论:pprM基因能够提高大肠杆菌抗氧化能力,其机制可能与pprM基因增强细菌体内抗氧化酶的活性有关。     

和厚朴酚对大肠埃希氏菌生物被膜形成的抑制机制

【目的】研究不同浓度的和厚朴酚(honokiol)抑制大肠埃希菌(Escherichia coli)的供试菌株10389生物被膜(biofilm,BF)形成的作用机制。【方法】用氯化三苯基四氮唑比色法(TTC)和四唑盐减低法(XTT)测定honokiol抑制E.coli10389生物被膜形成的药物最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)及其抑制作用与时间的关系;通过qRT-PCR法检测不同浓度的honokiol对E. coli 10389生物被膜形成基因和群体感应系统相关基因表达量的影响;通过生物发光法和qRT-PCR法检测亚-MIC honokiol对E. coli 10389呋喃糖基硼酸二酯(AI-2)及其调控的与生物被膜形成相关的下游基因表达量的影响。【结果】Honokiol能抑制E.coli10389生物被膜的形成,但不同浓度的honokiol抑制E. coli 10389 BF形成的作用机制不同。其中,与对照组相比,MIC的honokiol能使E. coli 10389 BF形成相关基因编码毒素(hha)和细菌酸性调节因子(ari R) mRNA的表达量显著提高,抗毒素...     

大肠杆菌机械敏感性离子通道MscS失活特性分析

[目的]细菌机械敏感性离子通道MscS能够在细菌周围环境渗透压急剧降低时,打开并释放胞内内容物,平衡内外渗透压差,使细菌存活。鉴于其广泛分布在各种细菌中,而在哺乳动物中未发现其同源体,MscS被认为是一种新型抗生素靶点。MscS一个独特的开放特征是具有失活特性,即在持续的机械刺激条件下,MscS从开放状态进入一种非离子通透的失活状态,从而避免因通道持续开放引起大量内容物流失导致细菌死亡。该研究的目的是鉴定影响MscS失活的关键氨基酸,为靶向MscS的药物设计提供思路。[方法]采用分子克隆方法制备MscS Cyto-helix(P166−I170)半胱氨酸突变体,利用巯基化合物MTSET⁺结合半胱氨酸从而对其侧链基团进行修饰,并通过低渗刺激实验,检测表达MscS半胱氨酸突变体的大肠杆菌分别在无或有MTSET⁺处理下,低渗刺激诱发通道开放后的存活率筛选显著影响通道功能的突变体。利用电生理膜片钳方法检测突变体在MTSET⁺处理前后通道失活特性的变化,结合定点突变手段进一步探讨失活机制。[结果]MTSET⁺处理导致表达半胱氨酸突变体G168C-MscS的大肠杆菌在低渗刺激后存活率极大降低;G168C- MscS在结合MTSET⁺后失去失活特性,保持持续开放,是导致细菌胞内内容物大量流失并死亡的重要原因;酪氨酸突变G168Y-MscS、亮氨酸突变G168L-MscS和赖氨酸突变G168K-MscS的失活特性与野生型WT-MscS一致,而天冬氨酸突变G168D、缬氨酸突变G168V和异亮氨酸突变G168I的失活速率显著降低,尤其是G168I-MscS失去失活特性,表明MscS 168位点是影响通道失活的关键位点,并且通道失活特性与该位点氨基酸侧链基团的大小及电荷性质相关。[结论]G168位点甘氨酸是影响MscS通道失活的关键氨基酸。     

Recombinant streptokinase production by fed-batch cultivation of Escherichia coli

Streptokinase (SK) is a specific effective medicine for thrombolytic therapy of acute myocardial infarction. This study established a process for the pilot production of recombinant streptokinase (r-SK). Engineering bacteria were fermented in a 20-l fermentor to produce r-SK. After simple renaturation and purification, 12.9 g of r-SK with 97.8% of purity and about 10⁵ IU mg⁻¹ of specific activity was obtained, the yield of protein and the recovery of activity were 44.9% and 51%, respectively. Finally, the r-SK was made into about 700 doses of injections for clinical applications.     

yeaI基因对奶牛源大肠杆菌NJ17生物学特性的影响

c-di-GMP是细菌中广泛存在的第二信使,可通过效应蛋白参与调控细菌的生物被膜形成、运动性和毒力等生物学特性。YeaI因含有能结合c-di-GMP分子的EGEVF基序,可能作为c-di-GMP效应蛋白发挥作用。[目的] 研究yeaI基因缺失对奶牛源大肠杆菌临床分离株NJ17生物学特性的影响。[方法] 构建NJ17的yeaI缺失株（NJ17ΔyeaI）及回复株cNJ17ΔyeaI,分析yeaI对NJ17生物学特性（如生长特性、生物被膜形成能力和对小鼠乳腺上皮细胞（EpH₄-Ev）的黏附）的影响。[结果] 成功构建NJ17的yeaI缺失株（NJ17ΔyeaI）及其回复株（cNJ17ΔyeaI）;与野生株NJ17相比,缺失株NJ17ΔyeaI生长特性及耐药性无显著变化,生物被膜形成能力显著下降,运动性显著升高（P<0.05）;透射电镜检测结果表明,yeaI缺失影响NJ17菌毛和鞭毛的形成;实时定量PCR（qPCR）结果显示,yeaI基因显著抑制NJ17鞭毛基因filG和motB的转录水平（P<0.05）;血清杀菌实验表明,yeaI缺失能显著增强其抵抗血清杀菌作用（P<0.05）;对EpH₄-Ev细胞黏附实验表明,yeaI缺失对NJ17黏附性无显著影响（P>0.05）。[结论] yeaI对奶牛源大肠杆菌NJ17的生物学特性具有重要的调控作用。     

大肠杆菌胞内半胱氨酸响应型启动子的筛选表征

【目的】半胱氨酸是一种重要的含硫氨基酸,广泛应用于化妆品、药品、食品等行业,微生物发酵法合成半胱氨酸已成为当前研究的热点。基于比较转录组学分析等技术,筛选并表征大肠杆菌(Escherichia coli)胞内对半胱氨酸浓度变化显著响应的启动子。【方法】在Escherichia coli W3110培养基中外源添加不同终浓度的半胱氨酸,通过比较转录组学分析筛选转录水平显著响应半胱氨酸浓度变化的基因,融合目标基因的启动子片段与荧光报告基因egfp构建启动子文库,进一步测定不同半胱氨酸浓度条件下,含有不同启动子重组菌的绿色荧光蛋白(greenfluorescent protein, GFP)荧光强度。【结果】筛选并挖掘了随着半胱氨酸浓度提高而转录水平显著提升的27个基因,并将基因的潜在启动子片段与荧光报告基因egfp融合构建启动子文库,筛选获得对半胱氨酸变化具备特异性响应的启动子P_E2。最后,对P_E2启动子-35区间隔区域AAAT进行随机突变,最终获得在1-7g/L半胱氨酸浓度范围内特异性响应性能显著提高的启动子P_E2-33。...     

Cloning and sequencing of the HU-2 gene of Escherichia coli

Summary The Escherichia coli HU-2 gene was cloned using a DNA fragment from the HU-1 gene as a probe. The amino acid sequence of the HU-2 protein deduced from the nucleotide sequence is in good agreement with the published sequence. The nucleotide sequence has a possible promoter and a typical ribosomal binding site upstream of the translation initiation codon (AUG) and a possible rhoindependent terminater site downstream of the termination codon (UAA) of the gene.     

大肠杆菌中转录-翻译耦合的机制

在大肠杆菌（Escherichia coli,E. coli）等原核生物中,转录和翻译往往是耦合的,这种耦合通常表现在转录和翻译的互相调控上,如转录极性、转录衰减和转录-翻译速率的同步。间接耦合和物理耦合是耦合的两种模式。由警报素（alarmone）(p)ppGpp维持的间接耦合可能需要DksA和TufA蛋白的辅助。物理耦合分为NusG或RfaH因子介导的耦合和非因子条件下产生的“碰撞”耦合。响应于压力的转录或翻译的变化会引发几种耦合模式间的相互转变。耦合对于基因正常表达是必要的,其解除将引发转录终止、R环形成、复制-转录冲突、mRNA切割等不利的事件。结构生物学的相关技术已经清晰地展示了部分耦合的表达体（expressome）的结构细节和特征,这些技术联合多组学分析等方法将提供关于耦合的更深层次的见解。重要的是,对耦合的研究或许会为靶向抗菌药物的开发带来新的思路。     

鸡源大肠杆菌毒力基因检测及分子流行特征

[目的] 本试验旨在阐明鸡源大肠杆菌致病性及分子流行特性,为探索大肠杆菌流行途径制定合理的防控策略提供新思路。[方法] 2018–2019年在河北省采集病死鸡肝脏样品,通过选择培养基筛选、生化鉴定、血清凝集试验对分离菌株进行系统鉴定,应用PCR方法检测分离株中毒力基因流行情况。参考系统发育群分类方法对大肠杆菌进行分群分析,并参照McMLST网站数据库提供的7对管家基因序列进行多位点序列分型（multilocus sequence typing,MLST）分析。[结果] 结果显示,56株分离株符合大肠杆菌生化特征,分为8个生化表型,B4（30.36%）、B5（25%）和B2（23.21%）为主要生化表型。56株分离株大肠杆菌血清凝集试验均呈阳性,分为11种血清型,O₇₈（26.79%）、O₂（23.21%）、O₁₅₇（17.86%）和O₁（14.29%）为主要流行血清型。56株大肠杆菌共检测出15种肠外大肠杆菌毒力基因,未检出papC、ibeA和ibeB基因。黏附相关基因fimC和抗血清存活因子相关基因ompA携带率为100%。aatA、yijP、irp2、mat、iss,检出率分别为98.21%、98.21%、98.21%、96.43%、92.86%。同时,大肠杆菌与铁转运相关基因iroN、fyuA、iucD、irp2检出率均在80%以上。56株大肠杆菌中有20株属于肠出血型大肠杆菌（enterohemorrhagic E.coli,EHEC）,其次是肠聚集型大肠杆菌（enteroaggregative E.coli,EAEC）（n=4）、肠产毒素型大肠杆菌（Enterotoxigenic E.coli,ETEC）（n=2）。这些菌株D群分离株较多,其次是B2群。通过MLST分型分析,共分为22个ST型,其中ST88（n=7）、ST85（n=6）、ST243（n=6）型为主要流行型。[结论] 结果显示大肠杆菌血清型多样,毒力因子种类繁多,致病性大肠杆菌同时携带多种毒力基因,表明动物源大肠杆菌具有较强的毒力基础。     

合成生物学方法构建电活性大肠杆菌

电活性微生物具有独特的在细胞内外环境之间传递电子的能力。在对天然电活性微生物电子传递机制充分研究的基础上,通过合成生物学方法异源构建天然电活性微生物电子传递结构基础也可以将遗传背景清晰的非电活性大肠杆菌改造为电活性微生物。构建获得的工程化电活性大肠杆菌可以直接应用于微生物燃料电池和生物传感器等领域,同时也可以作为底盘细胞整合相应的目标产物合成通路实现电能驱动的生物合成。本文以合成生物学方法构建电活性大肠杆菌为主题,详细阐述天然电活性微生物电子传递的机理及结构基础,总结了工程化电活性大肠杆菌的构建策略、成功案例以及应用领域,并对合成生物学方法构建电活性大肠杆菌未来的研究方向进行了展望。     

产麦角硫因大肠杆菌工程菌株的构建与优化

麦角硫因(ergothioneine,ERG)是一种天然的抗氧化剂,广泛应用于化妆品、食品以及医药领域.相比于传统植物提取和化学合成方法,微生物发酵合成麦角硫因具有周期短、成本低等优点,因而受到广泛关注.为构建高产麦角硫因的大肠杆菌工程菌株,本研究以大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)为出...     

致犊牛脑膜炎大肠杆菌新疆分离株ibeB基因的特性分析北大核心CSCD

【目的】分析致犊牛脑膜炎大肠杆菌分离株ibeB基因的分子生物学信息。【方法】以自脑炎死亡犊牛脑组织、肝组织分离鉴定的O161-K99-STa致病性大肠杆菌牛-EN株和牛-EG分离株为材料。根据GenBank中公布的脑膜炎大肠杆菌K1株RS218 ibeB基因序列设计1对引物,采用PCR方法,从分离株中成功克隆ibe B基因,比较分离株ibeB基因与不同来源大肠杆菌ibeB基因的部分生物信息学特性。【结果】分离株ibeB基因序列全长1500 bp,包含1371 bp开放阅读框,共编码457个氨基酸;生物信息学分析显示,牛-EN株与致人脑膜炎大肠杆菌K1 RS218的核苷酸和氨基酸同源性分别为90.5%和96.9%,牛-EG株与大肠杆菌K12的核苷酸和氨基酸同源性分别为99.4%和100.0%;ibeB蛋白为亲水性蛋白,分子质量为50.26 kDa,理论等电点为6.05;该蛋白无跨膜区,但具有信号肽序列;亚细胞定位显示,分泌信号通路位点(SP)占比例为0.939,说明该蛋白属于分泌型蛋白。【结论】从致脑膜炎大肠杆菌分离株中成功克隆ibeB基因,该基因与致人脑膜炎大肠杆菌K1 RS218 ibeB基因有较高的同源性,均有相似的生物学特性,属肠外致病性大肠杆菌。     

米曲霉（Aspergillus oryzae）果胶酸内切水解酶（PGA）在原核系统中重组表达

果胶酶具有广阔的商业用途,在食品工业上主要用于果汁和酒类的澄清、提高植物油的提取率、提高水果的硬度和植物纤维脱胶。米曲霉（Aspergillus oryzae）一直用于传统发酵食品的生产,自然条件下其果胶酶的产量较低。文献报道的果胶酶的重组表达成功的例子较少,且活性较低。通过RT-PCR 的方法,获得不含信号肽的果胶酸内切水解酶A(polygalacturonase A, PGA) 的cDNA,PGA cDNA 连入pET-28a (+)载体, 构建 pET-28a (+)-pga 质粒。pET-28a (+)-pga 转化Turner (DE3) placⅠ细胞,得到转化子pET-28a (+)-pga-Turner (DE3) placⅠ,首次实现了米曲霉PGA在大肠杆菌系统中过表达,进一步对PGA在大肠杆菌系统中表达的条件进行了研究。在37℃、220 r/min条件培养pET-28a (+)-pga-Turner (DE3) placⅠ细胞,OD₆₀₀至 0.8左右时,用500μmol/L isopropyl β-D-thiogalactogalactopyranoside (IPTG)进行诱导表达,在15℃和170r/min条件下继续培养24 h,表达效果最好,相对于每毫升培养基而言,产酶可达到70u/mL,是米曲霉自然条件产酶量的87.5倍,远优于文献报道的重组表达的PGA酶活     

米曲霉（Aspergillus oryzae）果胶酸内切水解酶（PGA）在原核系统中重组表达

果胶酶具有广阔的商业用途,在食品工业上主要用于果汁和酒类的澄清、提高植物油的提取率、提高水果的硬度和植物纤维脱胶。米曲霉（Aspergillus oryzae）一直用于传统发酵食品的生产,自然条件下其果胶酶的产量较低。文献报道的果胶酶的重组表达成功的例子较少,且活性较低。通过RT-PCR 的方法,获得不含信号肽的果胶酸内切水解酶A(polygalacturonase A, PGA) 的cDNA,PGA cDNA 连入pET-28a (+)载体, 构建 pET-28a (+)-pga 质粒。pET-28a (+)-pga 转化Turner (DE3) placⅠ细胞,得到转化子pET-28a (+)-pga-Turner (DE3) placⅠ,首次实现了米曲霉PGA在大肠杆菌系统中过表达,进一步对PGA在大肠杆菌系统中表达的条件进行了研究。在37℃、220 r/min条件培养pET-28a (+)-pga-Turner (DE3) placⅠ细胞,OD₆₀₀至 0.8左右时,用500μmol/L isopropyl β-D-thiogalactogalactopyranoside (IPTG)进行诱导表达,在15℃和170r/min条件下继续培养24 h,表达效果最好,相对于每毫升培养基而言,产酶可达到70u/mL,是米曲霉自然条件产酶量的87.5倍,远优于文献报道的重组表达的PGA酶活     

天蓝色链霉菌孢子色素whiE在大肠杆菌中的异源生物合成

【目的】在大肠杆菌中完整重构孢子色素whiE的生物合成途径,分离纯化表达体系中合成的新化合物,并解析whiE的生物合成途径。【方法】构建whiE-ORFII、whiE-ORFVII和whiE-ORFI的单基因重组质粒,SDS-PAGE检测蛋白表达情况;借助Xba I与Spe I互为同尾酶的特性,实现多基因组合串联;构建好的重组质粒再导入大肠杆菌菌株BAP1中进行异源表达,并用高效液相色谱(HPLC)检测发酵产物;依次使用正相硅胶柱和反向半制备柱分离发酵产物,四级杆飞行时间质谱仪(Q-TOFMS)鉴定发酵产物分子量。【结果】whiE-ORFII、whiE-ORFVII和whiE-ORFI均获得可溶性表达;这3个基因单个串联到菌株BTw95中均未检测到新的产物生成;而whiE-ORFII和whiE-ORFVII、 whiE-ORFI和whiE-ORFVII双基因组合以及三基因组合串联到BTw95中可检测得到两种化合物ZYC-1和ZYC-2。在负离子模式下进行Q-TOFMS检测,ZYC-1的[M-H]-为419.0748,推测分子式为C_(23)H_(16)O_8;ZYC-2的[M-H]-为465.0743,推测分子式为C_(24)H_(18)O_(10)。【结论】本研究推进了孢子色素whiE生物合成途径在大肠杆菌中的异源重构,分离鉴定了2个十二酮II型聚酮化合物,并推测了孢子色素whiE的生物合成途径。     

代谢工程改造大肠杆菌合成己二酸

己二酸是一种具有重要应用价值的二元羧酸,是合成尼龙-66的关键前体。目前,生物法生产己二酸存在生产周期长、生产效率低的问题。本研究选择一株野生型高产琥珀酸菌株大肠杆菌(Escherichia coli) FMME N-2为底盘细胞,首先通过引入逆己二酸降解途径的关键酶,成功构建了可合成0.34 g/L己二酸的E. coli JL00菌株;接着,对合成路径限速酶进行表达优化,使E. coli JL01菌株在摇瓶发酵条件下产量达到0.87 g/L;随后,通过敲除sucD基因、过表达acs基因和突变lpd基因的组合策略平衡己二酸合成前体的供应,优化菌株E. coli JL12己二酸产量进一步提升至1.51 g/L;最后,在5 L发酵罐上对己二酸发酵工艺进行优化。工程菌株经72 h分批补料发酵,己二酸的产量达到22.3 g/L,转化率为0.25 g/g,生产强度为0.31 g/(L·h),具备了一定的应用潜力。本研究可为包括己二酸在内的多种二元羧酸细胞工厂的构建提供理论依据和技术基础。     

c-di-GMP对大肠杆菌生物膜调控的研究进展

大肠杆菌生物膜是由聚集于特定介质上的大肠杆菌菌体细胞相互黏附并分泌胞外基质聚合物(extracellular polymeric substances,EPS)而产生的一种结构复杂的膜状聚集物。感染宿主后的致病性大肠杆菌在形成生物膜后会极大地逃避免疫系统以及环境中各种有害因素对其的影响,对宿主造成持续甚至致命的伤害。环二鸟苷酸(cyclic diguanosine monophosphate,c-di-GMP)是广泛存在于细菌中的第二信使,在调节生物膜形成过程中起到至关重要的作用。基于此,本文对近些年来有关c-di-GMP对大肠杆菌生物膜形成过程中菌体的运动、黏附以及EPS产生机制的研究进行了综述,以期为从c-di-GMP角度抑制大肠杆菌生物膜提供依据和思路。     

模块化工程改造大肠杆菌生产L-色氨酸

L-色氨酸作为一种必需氨基酸,广泛应用于食品、饲料和医药等领域。目前,微生物法生产L-色氨酸存在转化率低等问题。为此,本研究通过敲除L-色氨酸操纵子阻遏蛋白(L-tryptophan operon repressor protein, trpR)、替换l-色氨酸弱化子(trpL)、引入抗反馈调节的aroG^fbr等,获得可积累11.80 g/L L-色氨酸的底盘菌株大肠杆菌(Escherichia coli)TRP3。在此基础上,将L-色氨酸合成途径分为中心代谢途径模块、莽草酸(shikimic acid, SA)途径至分支酸(chorismic acid, CHA)模块、分支酸至L-色氨酸模块,并借助启动子工程,通过平衡中心代谢途径模块、莽草酸途径至分支酸模块、分支酸至L-色氨酸模块,获得工程菌E.coli TRP9。在5 L发酵罐中,工程菌E.coli TRP9的L-色氨酸产量提升至36.08 g/L,糖酸转化率提升至18.55%,达到理论转化率的81.7%。本研究利用模块工程策略,构建了高产L-色氨酸生产菌株,为l-色氨酸的规模化生产奠定了良好的基础。     

大肠埃希菌生物被膜基因调控研究进展

大肠埃希菌(Escherichia coli)是一种兼性厌氧、有鞭毛的革兰氏阴性短杆菌,常寄生于人和动物肠道内,是常见的人畜共患病病原之一。大肠埃希菌易形成生物被膜,这是一种由细菌群落分泌能够包裹自身的胞外基质与细菌结合形成的特殊聚集体,也是临床细菌感染疾病难以治愈的主要原因。生物被膜的形成不仅帮助细菌逃避宿主的防御系统,还可以降低或阻止药物发挥作用,从而诱发生物被膜相关感染(biofilm-associated infections, BAI)。本文从生物被膜形成的基因调控系统和相关调控蛋白等角度,归纳总结调控大肠埃希菌生物被膜形成的分子机制,并对防治BAI的策略进行了概述,为寻找合适的药物靶点以及防治BAI提供参考。