小麦TaHDA19基因的克隆及胁迫表达分析

利用基因克隆技术从小麦（Triticum aestivum L.）品种‘科农199’中扩增得到一个RPD3/HDA1型组蛋白去乙酰化酶基因TaHDA19,采用生物信息学方法对该基因序列的结构特征进行分析,并对植株不同组织及不同胁迫条件下该基因的表达量进行检测。结果显示：TaHDA19的开放阅读框长1560 bp,共编码519个氨基酸;该基因的氨基酸序列存在组蛋白去乙酰化酶（HDAC）家族典型的结构域Hist-deacety1。该基因上游启动子区含有多种响应元件,如：光响应元件I-box和G-box,脱落酸响应元件ABRE和低温响应元件LTR等。‘科农199’TaHDA19基因的表达结果表明：该基因在根、茎、叶片和幼穗中均有表达,其中在叶片中表达量最高;采用脱落酸、氯化钠和PEG分别处理植株0、1、3、6、12、24 h后,基因的表达水平出现差异;在对植株的12个生育时期进行35℃和42℃热胁迫处理1 h后,该基因表达量均出现上调。研究结果表明TaHDA19可能在小麦响应非生物胁迫过程中发挥重要作用。     

小麦盐胁迫相关基因的克隆与表达分析

采用RT-PCR方法,从小麦中克隆获得1个盐诱导小麦MYB类转录因子基因TaSIM（Triticum aestivum salt-induced MYB）,该基因cDNA全长1 213bp,具有1个831bp的开放阅读框,编码276个氨基酸,预测分子量约为29.903kD,等电点为10.12,推测的氨基酸序列中含有2个高度保守的SANT结构域。系统发生树分析表明,TaSIM与二穗短柄草XP₀03576185亲缘关系最近。半定量RT-PCR检测结果显示,TaSIM基因受盐胁迫诱导表达。亚细胞定位结果显示,TaSIM-hGFP融合蛋白定位于细胞核中。研究结果表明,小麦TaSIM基因编码的蛋白可能在细胞核内参与小麦对盐胁迫的应答反应。     

小麦胁迫相关基因W1的克隆及表达模式分析

应用噬菌体原位杂交技术从干旱胁迫诱导的小麦cDNA文库中克隆到一个胁迫诱导的基因片段别。删全长cDNA为901bp,其中,编码区长498bp,编码166个氨基酸。Southern杂交表明,W1是一个低拷贝基因。RT—PCR结果表明,W1受干旱、低温的诱导,但不受高盐的诱导。氨基酸序列分析发现W1有一个USP保守区（pfam00582）。同源性分析发现W1与一个水稻胁迫诱导蛋白（NM_001061239）的同源性为83％,但该类蛋白的功能尚无报道。肼是小麦第1个被克隆的胁迫相关蛋白基因,该基因的克隆有助于阐明小麦的抗逆机制,并为今后培育抗逆性小麦品种提供候选基因。     

小麦铝胁迫基因TaAIP的克隆表达分析及亚细胞定位

以小麦抗逆相关蛋白TaMAPK2作为诱饵,利用酵母双杂交系统进行筛库,获得互作蛋白TaAIP。氨基酸序列分析发现TaAIP具有wali保守区,并且与一些物种的铝诱导蛋白相似。实时荧光定量PCR分析显示,TaAIP基因受到铝、干旱以及高盐胁迫上调表达。半定量RT-PCR结果表明,TaAIP在小麦茎中表达,在根部、叶片以及花中没有表达。亚细胞定位实验发现,TaAIP定位在细胞膜上。这些结果为深入分析TaAIP的抗逆性作用机理打下基础。     

小麦TaCRC基因的克隆及表达分析

以小麦心皮为材料,利用RT-PCR方法分离出一个新的YABBY基因TaCRC,并利用Northern杂交对TaCRC在不同组织中的表达模式进行分析.结果显示:该基因全长1 105 bp,编码199个氨基酸.TaCRC具有YABBY家族典型的结构域,即N端含有C2C2锌指结构域,C端含有YABBY结构域.其氨基酸序列与水稻的 DROOPING LEAF(DL)、拟南芥的CRABS CLAW(CRC)和金鱼草的AmCRC的氨基酸具有较高的一致性.TaCRC在心皮中特异表达,类似于拟南芥的CRC的表达模式.研究表明,TaCRC是小麦中的CRC同源基因.     

小麦TaLhca基因的克隆及表达分析

为了从分子水分研究小麦的光合作用,该研究采用RT-PCR方法,从小麦品种‘百农207’的叶中克隆到1个捕光叶绿素a/b结合蛋白基因,命名为TaLhca。序列分析结果表明,TaLhca的编码区序列(coding DNA sequence,CDS)长810 bp,编码269个氨基酸,推测分子量为29.31 kD,等电点为8.69。TaLhca被定位于叶绿体,无信号肽,存在3个明显的跨膜区域,预测其蛋白结构含有典型的捕光叶绿素a/b结合蛋白功能域(chlorophyll a/b binding domain),为亲水性非分泌蛋白。蛋白序列比对和进化树分析表明,小麦与二穗短柄草(Brachypodium distachyon)和水稻(Oryza sativa)中的Lhca序列相似性最高,亲缘关系最近。启动子顺式作用元件预测表明,启动子区域包含多个光响应元件及逆境响应元件。实时荧光定量PCR分析表明,TaLhca基因在小麦根、茎、叶中均有表达。其中在叶中表达量最高,在根中表达量最低,且受NaCl、干旱、ABA、H2O2和低温胁迫表达增强,受黑暗胁迫表达降低。该研究结果为进一步解析小麦光合作用机理及其相关基因的诱导表达特性提供了依据。     

菘蓝IiLEA基因的克隆及胁迫表达分析

胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA蛋白),是指胚胎发育后期种子中大量积累的一系列蛋白质,大量研究表明这些蛋白质的积累与渗透胁迫耐受性密切相关.该实验以250 mmol/L NaCl溶液处理9 h的菘蓝幼苗为材料,经RT-PCR方法扩增得到LEA基因,命名为IiLEA.经测序确认该基因含有648 bp的开放阅读框,编码由215个氨基酸组成的亲水性蛋白质.对培养30 d的菘蓝无菌幼苗进行自然干旱处理和盐胁迫处理,Northern杂交结果显示,正常生长条件下,IiLEA基因在菘蓝幼苗体内不表达,随着胁迫时间的延长其表达量逐渐增加,到9 h时表达量达到峰值,干旱处理和盐处理有相似结果,表明该基因可能受逆境胁迫诱导表达.     

小麦胁迫相关基因TaSF3B2的克隆及表达特性分析

为研究小麦剪接因子在逆境胁迫中的作用,通过分析小麦抗性相关EST数据库,筛选并克隆获得1条2 327bp的核苷酸序列。该序列包含了一个1 854bp的开放阅读框,编码一个由617个氨基酸残基组成的蛋白,氨基酸同源比对发现,该蛋白含有GUS1结构域(Splicing Factor 3B,Subunit 2),属于剪接因子3b亚基中的一员,将该蛋白命名为TaSF3B2。生物信息学分析显示,TaSF3B2平均亲水系数(GRAVY)为-0.895,不稳定系数为43.92,且在细胞核中发挥作用的可能性最大。实时荧光定量PCR分析表明,TaSF3B2基因在不同组织中存在差异表达,不同发育时期其表达也存在差异;在幼苗叶片中,该基因表达受高盐、低温、条锈菌、干旱及ABA激素胁迫明显下调表达,而在幼苗根中变化不明显。推测TaSF3B2基因参与了小麦正常条件下的生长发育,同时在小麦应对逆境胁迫的过程中具有重要的作用。     

小麦TaDRLea3 2基因的克隆及胁迫诱导表达分析

胚胎发育后期丰富蛋白(late embryogenesis abundant protein,LEA蛋白) 是植物体中广泛存在的一类与渗透调节相关的家族蛋白,植物受非生物胁迫会大量表达。该研究采用同源克隆技术,从干旱诱导的小麦品种‘郑引1号’ (Triticum aestivum L.)中获得1个新的LEA3家族基因（ TaDRLea3 2）,该基因全长668 bp,编码区为570 bp,编码189个氨基酸。生物信息学分析表明该蛋白为亲水性蛋白,二级结构以α 螺旋为主,含有9个由11个氨基酸组成的保守结构域,为典型的LEA3蛋白,存在3个磷酸化位点,无信号肽结构域及跨膜结构域,可能定位于细胞质中;实时定量PCR结果表明, TaDRLea3 2基因受干旱、高盐、低温诱导表达,同时也受外源ABA诱导,推测 TaDRLea3 2为ABA依赖型 LEA3基因,以不同机制参与小麦对非生物胁迫的应答过程,为深入分析小麦LEA3家族蛋白的抗逆机制奠定了基础。     

小麦F-box基因TaFBL14的克隆及表达分析

该研究利用同源克隆策略,获得了1条小麦F-box/LRR重复蛋白14基因(TaFBL14)。TaFBL14基因编码486个氨基酸,预测分子量为53.48kD,等电点为5.93,序列N端包含一个F-box结构域,C段包含7个LRR结构域。TaFBL14基因编码蛋白不具有信号肽及核定位信号序列,主要定位在细胞质中,二级结构以α-螺旋为主,呈球状。进化树分析表明,TaFBL14与粗山羊草和乌拉尔托小麦的FBL14蛋白亲缘关系较近。qRT-PCR分析结果显示,TaFBL14基因主要在小麦叶组织中表达,且受非亲和叶锈菌侵染后呈现上调表达趋势,说明该基因可能参与小麦抵御叶锈菌的侵染过程。     

番茄calnexin基因的克隆及胁迫表达分析

Calnexin是内质网中重要的类凝集素分子伴侣,其主要作用是辅助糖基化蛋白的折叠和装配,调节内质网中的Ca²⁺稳态平衡和Ca²⁺信号传导过程。从番茄(Lycopersicon esculentum)的cDNA文库中克隆到calnexincDNA全序列,将其命名为Lecnx61.0,并以其3’端DNA片段为探针对番茄基因组进行Southern分析,结果表明Lecnx61.0在该基因组中仅有一个拷贝;Northern和W estern分析表明,Lecnx61.0的表达还受热激、冷害、盐害和内质网应激诱导剂衣霉素的诱导,但对干旱胁迫没有明显的反应。LeCNX 61.0蛋白对Ca²⁺亏缺胁迫的响应呈现组织特异性,但高浓度Ca²⁺并不影响各组织中LeCNX 61.0蛋白的含量,实验结果表明LeCNX 61.0蛋白可能在植物抵抗特定的环境胁迫中发挥作用。     

小麦TaMAPK2基因的克隆及表达分析

该研究从小麦中克隆了1个MAPK基因TaMAPK2。序列分析表明,TaMAPK2基因的ORF为1 110bp,编码369个氨基酸。序列比对分析表明,该基因所编码的蛋白与粗山羊草、水稻、谷子等MAPK蛋白具有较高的一致性,分别为99%、94%、94%。进化树分析表明,TaMAPK2与水稻OsMAPK2的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析表明,该基因的表达显著受渗透胁迫、低温胁迫、高盐胁迫、乙烯和双氧水诱导,受ABA抑制。研究表明,TaMAPK2可能参与非生物逆境胁迫及相关信号分子应答。     

小麦非生物胁迫相关基因TaAIM的表达分析

MYB转录因子是一个在植物的应激反应中起着核心作用的蛋白质家族.为了进一步研究小麦非生物胁迫诱导转录因子的表达特性,利用同源克隆的方法从小麦中获得了 1个R2R3-MYB转录因子基因TaAIM,采用生物信息学方法对TaAIM的序列进行分析,采用半定量RT-PCR方法研究TaAIM在不同组织以及不同非生物逆境胁迫条件下的...     

小麦γ-TMT基因的克隆与表达分析

γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)是维生素E合成途径的关键酶之一。该研究采用RT-PCR方法,从小麦品种‘中国春’中克隆得到小麦γ-TMT基因的3个同源拷贝,其CDs(codingsequence)序列相似性为99.12%;其中Ta-γ-TMT-6A和Ta-γ-TMT-6B编码区长度为1101bp,编码366个氨基酸,而Ta-γ-TMT-6D因发生无义突变,编码365个氨基酸。生物信息学分析表明,3个蛋白分子量分别为39.58、39.53和39.50kDa,理论等电点分别为6.67、6.41和7.08,都属于亲水性不稳定非分泌型蛋白。系统进化分析表明,小麦Ta-γ-TMT蛋白与糜子Pm-γ-TMT的亲缘关系相对较近。实时定量PCR分析表明,小麦Ta-γ-TMT基因在根、茎、叶、颖壳、种子中均有表达,在叶片中表达量最高;ABA、NaCl、PEG均能诱导Ta-γ-TMT基因的上调表达。该研究结果为进一步探讨小麦γ-TMT基因的功能奠定了基础。     

基因的克隆及表达分析

DNA重组激活基因（Recombination activating genes RAG）是脊椎动物特异性免疫反应的关键基因,也是脊椎动物进化分析的标记基因之一。鲫鱼具有很强的适应性和抗病能力,是我国广泛养殖的重要经济淡水鱼;由于具有不同的倍性和丰富的遗传多样性,又是研究鱼类基因组进化的独特材料。本研究用PCR方法扩增、克隆了鲫鱼的Rag基因。鲫鱼Rag1基因从起始密码到终止密码总长4188bp,由三个外显子和两个内含子组成,其中开放阅读框长3192bp,编码1063个氨基酸。Rag2基因从起始密码到终止密码总长1593bp,没有内含子,只有单一的编码区,编码530个氨基酸。Rag1和Rag2基因的ORF和氨基酸序列在不同鱼类中的对比结果表明其在进化过程中非常保守。不同鱼类Rag1基因的第二内含子也是高度保守的,转录因子结合位点分析表明在第二内含子的保守区域中有许多转录因子的可能结合位点。其中有一段在所有已知鱼类中都存在的保守区域是与性腺发育相关的转录因子SRY和SOX5的可能结合位点,提示Rag1基因的表达可能与性腺发育具有相关性。用RT-PCR方法进行的组织特异性表达分析表明Rag1基因在鲫鱼成体的头肾和精巢都能检测到表达,提示Rag基因不仅主导了免疫组织中的DNA重组,也可能参与了生殖细胞的DNA重组。RT-PCR检测证明Rag1基因在鲫鱼胚胎发育至第5天开始表达,在第7天鲫鱼胚胎的胸腺原基中可检测到Rag1基因mRNA的杂交信号,在第9天鲫鱼胚胎的胸腺原基中可以检测到很强的Rag1 mRNA原位杂交信号,说明该时期可能是鲫鱼免疫基因重组的活跃时期。     

陆地棉干旱胁迫相关基因GhPR-10的克隆及表达分析

病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins,PR)的产生与积累是植物体应对生物或非生物胁迫的主要特征之一,而病程相关蛋白10(PR-10)是这类蛋白家族中的重要成员。该研究在前期蛋白质组学分析的基础上,采用同源克隆法和RACE技术相结合,设计了一对引物,克隆了陆地棉"KK1543"干旱胁迫下差异表达的Gh PR-10。Gh PR-10基因具有一个432 bp的开放阅读框,编码144个氨基酸,预测分子量约为15.6 k D,等电点为4.90。氨基酸序列比对和同源性分析显示Gh PR-10蛋白与其他植物中的PR-10蛋白有较高的一致性,说明该基因在进化过程中是相当保守的。系统进化树分析显示,陆地棉Gh PR-10与海岛棉、雷蒙德氏棉中蛋白的亲缘关系最近。为了研究不同胁迫条件和不同组织器官该基因的表达情况,采用荧光定量PCR技术,研究表明在15%PEG胁迫下,Gh PR-10在根中同时期的表达量大部分都比在茎和叶同时期的表达量要高;Gh PR-10的表达量在3种胁迫下变化趋势整体相似,且都呈现上调表达,干旱和盐胁迫下该基因的表达量在24 h达到最高,4℃低温胁迫下该基因在12 h达到最高。上述实验表明,Gh PR-10基因可能参与棉花防御逆境胁迫机制,为进一步研究Gh PR-10基因功能奠定了一定的基础。     

番茄 calnexin 基因的克隆及胁迫表达分析

Calnexin是内质网中重要的类凝集素分子伴侣,其主要作用是辅助糖基化蛋白的折叠和装配,调节内质网中的Ca2 稳态平衡和Ca2 信号传导过程。从番茄(Lycopersicon esculentum)的cDNA文库中克隆到calnexincDNA全序列,将其命名为Lecnx61.0,并以其3’端DNA片段为探针对番茄基因组进行Southern分析,结果表明Lecnx61.0在该基因组中仅有一个拷贝;Northern和W estern分析表明,Lecnx61.0的表达还受热激、冷害、盐害和内质网应激诱导剂衣霉素的诱导,但对干旱胁迫没有明显的反应。LeCNX 61.0蛋白对Ca2 亏缺胁迫的响应呈现组织特异性,但高浓度Ca2 并不影响各组织中LeCNX 61.0蛋白的含量,实验结果表明LeCNX 61.0蛋白可能在植物抵抗特定的环境胁迫中发挥作用。     

小麦盐胁迫相关基因TabHLH13的克隆与分析

在对小麦全长cDNA克隆进行大规模测序及转录因子功能研究过程中,筛选到一个与盐胁迫相关的bHLH转录因子基因,将其命名为TabHLH13。TabHLH13的全长cDNA序列为1072 bp,开放阅读框为720 bp,编码一个具有240个氨基酸残基的bHLH转录因子;对TabHLH13的基因组和cDNA序列比较分析表明该基因包括5个外显子和4个内含子;同源序列分析发现,TabHLH13与来自大麦和短柄草中的bHLH蛋白序列相似性最高,分别为96.2%和90.5%;电子定位发现TabHLH13位于小麦第7同源群的7DL上;亚细胞定位结果表明,TabHLH13编码一个定位在细胞核中的蛋白;组织表达特性分析表明该基因在小麦根、茎、叶、颖壳、雌蕊和花药中均有较强的表达;半定量RT-PCR与qRT-PCR结果表明TabHLH13是一个受盐胁迫诱导表达的基因。     

豆梨半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆及胁迫表达

采用RT-PCR结合RACE技术,从中国梨砧木——豆梨成熟种子中克隆获得豆梨半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因(PcCPI)的cDNA全长序列,并通过半定量RT-PCR分析不同胁迫处理对该基因表达水平的影响.结果表明:(1)PcCPIcDNA序列长度为980 bp,开放阅读框78~812 bp,编码的多肽由信号肽(29个氨基酸)和成熟肽(216个氨基酸)组成,具有3个植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因家族的高保守特征序列模式——LARFAVQEHN、QX-VXG和YQAKVWVKPW.(2)该蛋白与蔷薇科植物的CPI蛋白处于系统发育树的同一分支,且与苹果CPI蛋白的一致性最高(95.9%).(3)半定量RT-PCR结果显示:PcCPI基因在豆梨叶片中为诱导型表达,在人工模拟逆境条件下(包括喷施50μmol/L MeJA或100μmol/L ABA、刀片2次机械损伤2、00 mmol/L NaCl胁迫、4℃低温或30℃高温胁迫)处理4 h后,豆梨叶片中PcCPI基因表达量明显上升,表明该基因参与了豆梨对生物或非生物胁迫的防御机制.