藻类基因编辑技术研究进展

CRISPR/Cas9作为热门的基因编辑技术,已广泛用于模式生物、经济动、植物及部分海洋生物的基因功能检测和遗传改良,在海洋藻类中亦有成功运用的实例。介绍了CRISPR/Cas9基因编辑方法及其在藻类中的最新进展,分析基因编辑技术在应用中存在的问题,现有的研究成果对该技术在大型海藻中应用的指导意义,以期为CRISPR/Cas9在海洋大型海藻中的应用提供参考。     

灵长类动物基因编辑技术研究进展

灵长类动物因与人类在遗传、生理和神经功能上的高度相似性而使其在生物医学研究领域中占有非常重要的地位。构建人类疾病的灵长类动物模型,是研究疾病发病机理和探索潜在治疗手段的重要途径,而通过基因编辑的方法获得灵长类动物模型是研究一些遗传性疾病最可靠的方法。灵长类动物基因编辑技术先后经历了传统的转基因和精准基因打靶两个时代。对近年来灵长类动物基因编辑研究进行综述,重点介绍最新的利用核酸酶技术进行精准基因编辑的研究进展。     

CRISPR/Cas基因编辑系统研究进展

规律性成簇间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)的发现和工程技术对生命科学的发展带来巨大的推动作用。RNA引导的Cas(CRISPR-associated)酶已被用作操纵细胞、动物和植物基因组的工具。这加速了基础研究的步伐,并使其在临床和农业上的应用成为可能。CRISPR/Cas9对在实验系统中进行的功能基因组学的研究有重大影响。CRISPR/Cas9系统自发现以来,因其操作便捷、成本低、特异性高、可同时打靶任意数量基因等优点而被广泛应用。经过近几年研究发现,Cas9变异体(Cas12a、Cas13)有利于突破和克服CRISPR/Cas9应用中的一些限制,Cas12a极大地扩展了基因编辑靶位点的选择范围,同时其介导的多基因编辑具有明显的优势;Cas13等蛋白能特异性结合和编辑RNA,开启了转录组研究的新篇章。本文主要就CRISPR/Cas的研究背景以及Cas9、Cas12a和Cas13系统研究进展和应用进行综述,并对其应用前景和发展方向进行了展望。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在丝状真菌中的应用

随着对丝状真菌基因水平研究的不断深入,CRISPR/Cas9技术作为先进的基因编辑技术,已被广泛应用于丝状真菌的基因编辑。探究了CRISPR/Cas9系统在不同丝状真菌中的应用情况,主要从sgRNA的构建与表达、Cas9蛋白的改造与表达、不同的DNA双链断裂修复（DNA double-strand break,DSB）方式等方面进行概述,并对编辑效率、脱靶效应进行总结,旨在为今后丝状真菌中CRISPR/Cas9系统的构建及改良提供思路。     

CRISPR/Cas基因编辑技术及其在微藻研究中的应用

微藻由于在医药、食品、可再生燃料和化学原料等方面的潜力,受到了研究者越来越多的关注和青睐。然而,合适基因编辑方法和转化工具的缺乏,使得微藻基因工程的进展还相对比较缓慢。随着分子生物和基因编辑技术的发展,CRISPR 技术凭借简便、特异和高效的优势,逐渐成为探讨基因功能、提高植物育种和增加代谢物产物等研究的有力手段。基于此,本文综述了CRISPR/Cas 的2 种主要类型,重点论述了其在微藻领域中的应用进展,并总结了CRISPR 技术在微藻应用中所存在的问题,期望为以后的研究提供启发和参考。     

利用CRISPR/Cas9技术构建基因编辑大鼠模型

RNA介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统由单链引导RNA(sgRNA)与核酸酶Cas9构成。在细胞内,sgRNA能够按照碱基互补配对的原则引导Cas9与靶点结合,由Cas9切割目标DNA,造成双链DNA断裂(double stranded break, DSB)。在随后的DNA修复过程中,细胞主要进行非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)或在有修复模板存在的情况下进行重组修复(homology directed repair, HDR)。如果将CRISPR/Cas9系统以及修复模板通过显微注射的方式导入大鼠的胚胎内,就能借助细胞的修复机制实现大鼠胚胎的基因编辑,由此构建各种基因修饰大鼠模型。本文详细介绍了利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建大鼠模型的具体操作步骤,以期为相关领域的科研人员提供一种大鼠基因修饰模型的构建方法。     

CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术

规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)协同其相关蛋白Cas组成了细菌和古细菌的获得性免疫系统。利用该系统可以对外来某一特定单链或双链DNA实施高度特异性沉默或降解的特性,近年来对基因组进行精确定点编辑的CRISPR/Cas系统迅速发展。着重介绍了CRISPR/Cas系统的研究历史、结构、分类及作用机制,并分析讨论了现阶段以Cas9为核心的Ⅱ型系统在应用方面存在的问题及前景。     

基因编辑技术的发展及其在农业生产中的应用

对动植物和人类基因组的测序为功能基因组研究提供了基础数据。然而,核苷酸序列信息并不足以帮助我们了解特定的基因组元件的功能及其在表型形成中的作用。基因编辑技术能够在很大程度上解决这一问题,帮助人们快速获得新的基因组突变模式,从而以更便捷高效的方式进行功能基因组研究。对基因编辑的基本原理及常见的锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应因子核酸酶(TALEN)和2013年出现的CRISPR/Cas9系统进行了回顾,讨论了基因编辑技术的应用历史,特别在农业应用方面,重点关注了CRISPR/Cas9系统在水稻基因编辑中的应用,阐述了CRISPR/Cas9在基因组编辑领域的问题和其他应用方面的困难,探讨了基因编辑工具在作物改良方面所面临的主要挑战和未来发展趋势。     

CRISPR/Cas基因编辑系统中gRNA表达策略

近日,宾夕法尼亚州立大学杨亦农(Yinong Yang)教授团队在a BIOTECH期刊在线发表题为"Efficient expression of multiple guide RNAs for CRISPR/Cas genome editing"的综述。总结了CRISPR/Cas基因编辑技术中引导RNA (gRNA)的表达策略,介绍了多重基因编辑中同时表达多个引导RNA的方法和技巧,为CRISPR/Cas技术的开发和应用提供了参考。     

毕赤酵母基因编辑技术研究进展

巴斯德毕赤酵母是一种重要的蛋白表达系统,基因编辑技术作为代谢工程的基本工具,对于毕赤酵母的代谢改造十分重要。近十年基因编辑技术发展迅速,除传统的同源重组和Cre/loxP重组外,相继出现了许多新的基因编辑技术,例如ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9等,这些技术的出现使基因编辑更加简便高效。本文对毕赤酵母中传统和新型基因编辑技术的原理应用和研究进展进行了简要综述,并结合相关领域的发展对毕赤酵母基因编辑技术的发展进行了展望。     

渐狭叶烟草高效基因编辑体系的建立

渐狭叶烟草(Nicotiana attenuata)是烟草属植物中研究植物与昆虫、植物与病原菌互作的模式植物。本研究以八氢番茄红素脱氢酶基因(PDS)为靶标基因,建立一套以pHSE401为基因编辑载体,以潮霉素为抗性筛选标记的渐狭叶烟草高效基因编辑体系。利用该体系,获得PDS基因约80%的基因编辑效率,远远超过目前在渐狭叶烟草中报道的约30%的基因编辑效率。进一步使用WRKY70基因为靶标,对该体系对进行编辑效率验证,经测序发现WRKY70基因编辑材料中的基因编辑效率为83%,其中发生大片段缺失突变的频率为50%。因此,本研究成功建立了渐狭叶烟草高效基因编辑体系,为以后渐狭叶烟草的基因功能研究奠定基础。     

CRISPR/Cas:新一代基因编辑技术

CRISPR/Cas技术是一项新兴的基因编辑技术,它利用与目标序列互补的向导RNA(sg RNA)引导Cas酶定点切割DNA。由于该技术操作简便、要求低,已成为近几年最受关注的基因编辑技术。而随着该技术的广泛使用和人们对CRISPR/Cas系统了解的不断深入,对该技术优与劣的争论也不断升温。本文就该技术的起源、CRISPR/Cas系统的工作原理,以及目前的主流应用和成果进行了介绍,希望能够帮助人们对CRISPR/Cas技术有一个更全面的了解。     

CRISPR/Cas9技术制备S100A9基因编辑小鼠及表型研究

S100钙结合蛋白A9(S100 calcium binding protein A9,S100A9)参与多种炎症反应及肿瘤细胞的迁移和侵袭调控等生物学过程.本研究目的是利用CRISPR/Cas9技术构建S100A9基因编辑小鼠,为探讨该基因生物学功能提供动物模型.根据SS100A9基因序列构建针对外显子2和3的单链小...     

基于新的CRISPR/Cas9技术实现斑马鱼LHX9基因的快速编辑及对F0突变体性腺发育的初筛

目的:CRISPR/Cas9系统在斑马鱼的反向遗传学中的到了广泛应用,但突变基因的表型观察往往需要在突变鱼系的F1中进行,费时较长。LHX9作为LIM家族的一种转录因子,在胚胎早期的泌尿生殖嵴中有广泛分布;且LHX9基因敲除的小鼠存在性腺发育不良。本研究拟通过一种新的CRISPR/Cas9基因编辑技术,采用四条sgRNA对LHX9基因进行VASA转基因斑马鱼的基因敲除,以观察该基因缺陷对斑马鱼性腺发育的影响。方法:利用新的CRISPR/Cas9技术,设计四条针对斑马鱼LHX9基因3号外显子的20bp的sgRNA,通过非克隆体外转录得到靶位点的四条sgRNA。将以上靶位点的四条sgRNA与Cas9核酸酶蛋白同时注射入单细胞期的斑马鱼胚胎内,利用PCR鉴定突变型类型和突变比例。通过对LHX9基因突变体的VASA转基因斑马鱼进行荧光观察,发现LHX9基因缺陷的斑马鱼性腺发育的情况。结果:靶向Exon 3的四条sgRNA可成功编辑斑马鱼LHX9基因,敲除效率高达82%,Sanger测序发现产生10种不同的移码突变类型。通过该方法对VASA转基因斑马鱼的LHX9基因进行编辑,发现LHX9基因突变导致dph6的的斑马鱼原始生殖细胞增殖和迁移受到影响。结论:基于4条sgRNA注射的CRISPR/Cas9技术,可以快速地产生具有突变表型的G0斑马鱼,具有应用潜力。LHX9基因敲除导致原始生殖细胞的发育和迁移受到影响,提示该基因参与了斑马鱼早期性腺的发育。     

基因编辑技术在β-地中海贫血治疗中的研究

β-地中海贫血(β-地贫)是一种全球性的单基因遗传病,目前针对该病的治疗方法除造血干细胞移植外都是对症治疗,无法达到根治效果。基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞,以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病,达到根治疾病的目的。近年,随着基因编辑技术的发展,基因治疗越来越成熟完善,在β-地贫治疗中的应用也变得广泛。目前,基因编辑技术发展经历了4个阶段,分别为ZFN技术、TALEN技术、CRISPR/Cas9技术以及单碱基编辑技术。本综述将总结上述4种基因编辑技术在β-地贫治疗中的原理、研究、优缺点以及局限性,旨在优化β-地贫的治疗策略。     

基因编辑技术发展现状

鉴于以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑技术在可操作性、经济性和时效性上取得的革命性突破,以及国内外对此技术的研发和应用现状,中国有可能在基因编辑技术的下游技术研发(特别是植物基因编辑的应用)、专业公司孵化等方面取得突破。因此分析目前中国基因编辑技术发展的关键需求、潜在应用领域就显得尤为迫切和必要。采用问卷调查和计量方法对基因编辑技术发展的关键技术需求和最潜在应用领域进行研究。首先建立有序多分类Logistic回归模型并进行因变量分析,通过显著性检验在4个方面共24个问卷问题中选择8个存在显著因果关系的自变量,然后基于有序多分类Logistic回归模型,分析8个问题中不同选项对基因编辑技术发展的具体影响作用。调查结果表明多数基因编辑领域的研究人员认为在注重基因编辑基础技术研发的同时应更多地关注如何进行技术产业化,要注重在植物领域发展潜在竞争优势;促进我国基因编辑技术发展不仅需要科研机构参与,更需要包括高校、政府在内的多方力量协同作用;正确引导公众的基因编辑技术舆论认识和建立安全规范体系较为迫切;技术风险规避的重点应放在生物武器和生物恐怖、基因编辑相关传染病、物种基因改变对生态环境的...     

果蝇睾丸基因敲除突变体的构建及表型分析

生殖系统功能的正常维持是物种繁衍的基础,需要多基因协同作用,但其中许多基因的具体功能和作用机制并不清楚。本研究选取了果蝇(Drosophila melanogaster)中8个在睾丸中表达、功能未知且与人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)高度同源的基因(CG4161、CG11475、CG2921、CG10541、CG7276、CG3800、CG8117和CG16779),分析了它们在不同组织中的表达水平,并分别检测了它们在雄性生殖系统中的功能。在这8个基因中,前5个为睾丸优势表达基因,其余3个为全身性表达。首先,利用CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)技术结合同源定向修复(homology-directed repair, HDR)在果蝇中对8个候选基因逐一进行敲除,建立了纯合的基因敲除突变品系;然后对这些品系的雄蝇进行了生育力测试及睾丸细胞学观察。结果显示,CG7276和CG3800基因敲除果蝇出现部分雄蝇不育且可育雄蝇后代数量较野生型显著下降。睾丸解剖观察显示CG7276和CG3800的功能缺失可导致雄蝇分别出现不同程度的精囊缩小及精原干细胞减少和细胞分布混乱;染色结果也提示CG7276和CG3800在精子的成熟过程中发挥一定作用。其他6个基因突变并未导致雄蝇育性变化或睾丸形态异常。这些突变体的获得及表型的初步分析为进一步研究基因功能及机制提供了良好的动物模型及基础。     

CRISPR/Cas基因编辑技术治疗人类遗传性疾病的临床研究进展

随着人类基因组计划完成,人类遗传信息的解码推动着疾病诊疗迈入基因组学时代。许多医学领域中的“罕见病”和“不治之症”也被逐渐揭开了神秘的面纱,越来越多的疾病被确证为遗传性疾病。2012年,CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated enzyme)基因编辑技术的发现和应用,是近十年生物医学领域最具革命性的突破之一。该技术具有简便、高效、适用性广泛等特点,不但被广泛应用于基因功能研究,而且也在遗传病的基因治疗临床试验上取得重要进展。针对遗传背景明确的单基因遗传病,CRISPR/Cas可通过对目的 DNA序列进行精准靶向编辑,实现对内源基因序列的改变或者基因功能的重新调控,为治愈部分重大遗传性疾病提供了新的工具和治疗策略。目前,多个基于CRISPR/Cas技术研发的基因药物已经进入临床试验,并取得了令人鼓舞的阶段性成果。本文就目前已公布临床试验的基因编辑药物研究进展进行回顾与展望。