抗乙肝病毒表面抗原嵌合抗体基因在昆虫细胞中的表达

应用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达了抗乙肝病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）人－鼠嵌合抗体重,轻链基因,鼠源单克隆抗体ＯＨ３重,轻链可变区（ＶＨ,ＶＬ）ｃＤＮＡ分别与人免疫球蛋白恒区γ３,ｋ,ｃＤＮＡ拼接成人－鼠嵌合抗体基因,含嵌合抗体的转移载体与线性化病毒ＤＮＡ共转染Ｓｆ９细胞,并通过点杂交ＰＣＲ扩增和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析获得重组病毒。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和竞争ＥＬＩＳＡ表明以重组病毒感染的     

抗癌胚抗原单链抗体基因的构建及高效表达

采用重组ＰＣＲ技术将已获得的抗癌胚抗原鼠源单克隆抗体Ｅ７Ｂ１０重,轻链可变区基因经（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）３编码的寡核苷酸拼接成单链抗体基因,并在大肠杆菌中高效表达了单链抗体Ｃ端的融合蛋白,其表达量达到菌体总蛋白的２０％,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹图谱显示表达产物分子量为２７ｋＤ,与其基因编码蛋白的理论推算值相符。     

乙肝表面抗原专一的单链嵌合抗体在大肠杆菌中的表达

利用重组ＰＣＲ技术将乙肝表面抗原专一单抗的Ｖｋ与人源的Ｃ基因拼接成轻链嵌合抗体Ｖ－Ｃ,再通过编码柔性肽段（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）的Ｌｉｎｋｅｒ与Ｖ连接成单链嵌合抗体ＳｃＦＶ－Ｃ,并分别在大肠杆菌的热敏与分泌型表达系统中进行表达。表达产物的Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ与间接ＥＬＩＳＡ检测结果表明,ＳＣＦｖ－Ｃ产两种系统中的表达产物均具有抗原结合活性,并已在分泌肽的指导下ＳｃＦｖ－Ｃｋ能被Ｅ．ｃｏｌｉ分泌出胞外。     

功能性抗HBsAg人—鼠嵌合抗体在昆虫细胞中的高效表达

经同源重组我们构建了同时含抗乙肝病毒表面抗原嵌合抗体重、轻链基因的双重组 ＢａｃＨＬ４．２。利用双重感染和双重组病毒感染秋粘虫Ｓｆ９细胞,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果说明嵌合抗体重、轻链同时在胞内得到了表达。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析表明两种情况均能在胞内组装成Ｈ２Ｌ２完整免疫球蛋白分子。ＥＬＩＳＡ和功能性免疫迷检测证明重组嵌合抗体与父本鼠源单抗ＯＨ３一样能特异性识别具有天然构象的ＨＢｓＡｇ,而不识别经     

嵌合抗体轻链基因在家蚕细胞中的重组与表达

用家蚕修饰型核多角体病毒为载体,在家蚕细胞获得人鼠嵌合的抗人小细胞肺癌抗体轻链基因的表达。ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证明了抗体轻链基因已组建家蚕病毒基因组中。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ和ＥＬＩＳＡ和分析都检测到在重组病毒感染的家蚕细胞中产生了人鼠嵌合的抗体轻链。     

HCV核心蛋白免疫优势肽AA32—45抗原化抗体的构建

经定点突变,在抗ＨＢｓＡｇ单克隆抗体重链Ｖ区产生一个ＸｈｏＩ位点并插入编码ＨＣＶ核心蛋白免疫优势肽ＡＡ３２￣４５的互补寡核苷酸片段,构成抗原化ＶＨ基因。抗原化ＶＨ与人γ３恒区ｃＤＮＡ拼接成嵌合重链基因并与嵌合轻链基因共同构建成杆状病毒表达系统转移载体,经共转染筛选到重组病毒ＢａｃＨＬ－Ｅ１和ＢａｃＨＬ－Ｅ２,感染Ｓｆ９细胞分别表达Ｉｇ－Ｅ１和Ｉｇ－Ｅ２。Ｉｇ－Ｅ１与正常免疫球蛋白分子一样能形成四聚     

抗肝癌单链抗体的活性检测

将抗肝癌单克隆抗体 ＨＡｂ２５的轻、重链可变区基因通过Ｌｉｎｋｅｒ连接起来,构建成抗肝癌单链抗体ｓｃＦｖ２５,然后亚克隆入含 Ｅ－ｔａｇ检测标签的 ｐＥＴ１５ｂ表达载体进行融合表达。表达产物（ｓｃＦｖ２５－Ｅ－ｔａｇ）采用 ＳＡＢＣ法对肝癌细胞涂片进行染色,利用鼠抗Ｅ－ｔａｇ抗体间接检测初步纯化的ｓｃＦｖ２５的活性,同时采用竞争结合实验检测ｓｃＦｖ２５的亲和活性。ｓｃＦｖ２５能够与靶细胞特异性结合,阳性部位主要定位于细胞膜上;ｓｃＦｖ２５可封闭５３％的亲本抗体的亲和活性。ｓｃＦｖ２５较好地保持了亲本抗体的特异性和亲和活性。     

丙型肝炎病毒基因组C区和NS3区基因cDNA的融合及其在大肠杆菌中的表达与初步应用

通过逆转录（ＲＴ）－聚合酶链式反应（ＰＣＲ）,从中国人丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）携带者的血清中扩增并克隆到２段ｃＤＮＡ片段,即ＨＣＶ基因组Ｃ区抗原基因Ｃ８３１ｃＤＮＡ片断（约５３０ｂｐ）和ＮＳ３区抗原基因Ｃ３３ｃｃＤＮＡ片段（约８６０ｂｐ）。Ｃ３３ｃｃＤＮＡ片段同Ｃ８３１ｃＤＮＡ片段经连接　　　肽Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ连接成为基因嵌合体Ｃ３３ｃ－Ｃ８３１（约１４００ｂｐ）。Ｃ３３ｃ－Ｃ８３１基因嵌合体同温控型原核表达载体ｐＢＶ２２０重组,构建成表达质粒ｐＢＶ／Ｃ３３ｃ－Ｃ８３１,并在大肠杆菌细胞中获得了重组嵌合抗原Ｃ３３ｃ－ＣＬ的表达。通过酶切分析和Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹法,对约占菌体可溶性蛋白９％的表达产物做了鉴定。采用ＴｒｉｔｏｎＸ－１００和盐析处理,获得粗提表达产物。粗提的表达产物经尿素裂解和离子交换层析纯化,得到可用于检测抗ＨＣＶ核壳蛋白和抗ＮＳ３区抗体的重组嵌合抗原Ｃ３３ｃ－ＣＬ。对Ｃ３３ｃ－ＣＬ做抗原性分析发现,它同时具有完整的Ｃ３３ｃ抗原和Ｃ２２抗原的免疫反应活性,完全能替代单纯的Ｃ３３ｃ和Ｃ２２抗原。该嵌合抗原在血清学诊断中有重要的应用价值,可望成为新一代ＨＣＶＥＩＡ诊断试剂的优选抗原。     

抗癌胚抗原嵌合重链与核心链霉亲和素基因的融合及 …

将抗癌胚抗原（ＣＥＡ）单克隆抗体的重链可变区与人的恒定区（Ｃγ３）连接,制备抗癌胚抗原嵌合重链用于放免治疗及其他导向治疗,可减少人抗鼠抗体反应（ＨＡＭＡ）。为纯化及核素标记抗体,将嵌合重链基因与核心链霉亲和素基因融合。融合基因在大肠杆菌得到高效表达,表达量占菌体总蛋白的２４％。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和蛋白质印迹图谱显示表达产物分子量为７０ｋＤ,与其基因编码蛋白质的理论推算值相符。以ＨＲＰ标记的生物素作为     

抗结肠癌相关抗原单链抗基因的构建和表达

通过ＰＣＲ扩增和酶切分别得到抗结肠癌相关抗原抗体的重链可变区序列,轻链可变区序列及连接肽序列,将它们构建成为ＶＨ－ｌｉｎｋｅｒ－ＶＬ形式的单链抗体基因片段,并在大肠杆菌中进行了表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析结果表明,以ｐＣｏｍｂ３为载体,在大肠杆菌ＪＭ８３中,ｓｃＦｖ未获得有效表达,而以ｐＥＴ－２２ｂ（＋）为载体的ｓｃＦｖ在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中,３０℃诱导培养获得了高效表达,表达水平占全菌蛋白     

抗CD3基因工程嵌合抗体IgG在哺乳动物细胞中的表达和活性测定

利用基因工程方法将鼠源性抗CD3抗体HIT3a的可变区和人源抗体(IgG)的完整的恒定区连接起来,构建全抗型抗CD3嵌合抗体,该型抗体具有较低的免疫源性可作为免疫抑制剂应用于器官移植,减少受体产生免疫排斥,提高移植器官的存活率。利用PCR方法从抗CD3 ScFv重组噬菌体表达载体pCANTAB 5E上扩增抗CD₃抗体的轻链和重链可变区,将轻链和重链可变区组装到含有人抗体（IgG）恒定区的表达载体中,构建抗CD3嵌合抗体IgG的轻链和重链表达载体PKN100和PG1D105,并用脂质体法共转染CHO细胞。结果证明,抗CD₃嵌合抗体的V_L和V_H与HIT3a抗体的V_L和V_H完全相符,ELISA和Western blot检测结果证实转染细胞的培养上清中含有抗CD₃嵌合抗体IgG的表达,表达产物能与Jurkat细胞结合,并能竞争性抑制HIT3a抗体和Jurkat细胞结合活性,³H-TdR掺入实验表明, 抗CD3嵌合抗体与亲代抗体HIT3a一样,具有促进外周血单核细胞增殖的作用。我室构建的全抗型抗CD3嵌合抗体分子表达载体可在CHO细胞中稳定表达,表达产物有较好生物活性,具有潜在的临床应用价值。     

家蚕细胞和虫体产生抗人小细胞肺癌抗体

用重组昆虫病毒表达系统,在家蚕细胞和虫体表达了抗人小细胞肺癌人-鼠嵌合抗体。重组病毒rNPVL2,rNPVH17及双重组病毒rNPVLH19感染的家蚕细胞和虫体血淋巴中都检测到抗体分子的表达。双重组病毒的双基因共表达部分产物可装配。ELISA分析表明抗体重轻链基因共表达产物具有比单基因表达产物高得多的与小细胞肺癌细胞免疫结合功能。     

Folding and Stability of Chimeric Immunofusion VL-Barstar

A chimeric protein VL-barstar that comprises the VL domain of anti-human ferritin monoclonal antibody F11 and barstar, the naturally occurring inhibitor of bacterial RNase barnase, has been constructed for study of structure-function characteristics of chimeric immunoglobulin fused proteins. Such chimeric constructs may be potentially employed for development of bivalent/bispecific antibodies on the basis of the high affinity interaction between barstar and barnase (the association constant is about 10(14) M(-1)). We have developed a protocol for VL-barstar expression in E. coli and purification and refolding from inclusion bodies that yields a homogeneous and soluble form of this protein. Differential scanning calorimetry in combination with fluorescence and CD spectroscopy revealed that the VL-barstar formed well-resolved ordered secondary and compact tertiary structures. However, partial loss of tertiary interactions resulted in low stability of the recombinant protein and the lack of functional activity of the two constituent modules. These conformational features suggest that the protein might be referred to the class of native molten globules, which comprises partially unfolded conformations stabilized under physiological conditions. Since individually expressed VL domain and barstar retain completely folded conformation and stable spatial structure, the incomplete folding of the chimeric protein may be attributed to interaction between heterologous domains, which appears at the folding stage preceding formation of a system of tertiary interactions in both structural modules. The results provide evidence for non-native interactions between heterologous modules that may occur in chimeric proteins composed of taxonomically distinct fusion partners.     

抗CD20嵌合抗体的表达与活性检测

表达了基因重组抗CD20嵌合抗体并对其生物学活性进行了初步鉴定。设计合成轻、重链可变区序列;提取血液RNA,通过RT-PCR得到人κ、IgG1的轻、重链恒定区序列。运用重叠延伸PCR,连接可变区与恒定区,将轻、重链基因连接至pIRES双表达载体。将质粒以阳离子脂质体转染CHO细胞,ELISA挑选阳性克隆,共获得7株表达较高的克隆,表达量约为2mg/L。扩大培养阳性克隆anti-CD20-1B3,收获上清,以蛋白A进行亲和层析纯化表达蛋白。SDS-PAGE检测表明纯化纯度达到95％,蛋白相对分子量与理论值吻合。以CD20₊细胞Raji、Daudi、Ramous检测,表明该抗体能与CD20抗原特异性结合,体外杀伤试验说明抗体能够杀伤CD20₊淋巴瘤细胞。     

抗ErbB2嵌合抗体chA21聚集现象的鉴定和分析

聚集现象是目前基因重组抗体面临的挑战之一.采用高效排阻色谱(HPSEC)、动态光散射(DLS)、SDS-PAGE和间接ELISA鉴定抗ErbB2嵌合抗体chA21聚集的形式和性质,并比较温度和添加剂对抗体聚集程度,抗原结合活性的影响,用圆二色谱(CD)检测不同聚集条件下蛋白构象的变化,最后将抗体酶解分离分析聚集的部位.结果表明:chA21在溶液中可形成二聚和更高形式的聚集,聚集体是通过非共价键相互作用形成,并仍保留抗原结合活性,聚集程度和活性受温度和添加剂影响,而蛋白质的构象相对稳定,抗体可变区的相互作用可能是引起聚集的主要原因之一.对抗体聚集现象的分析有助于建立稳定的抗体保存条件,并为今后抗体进一步改造提供依据.     

抗HEV嵌合抗体的构建及在CHO细胞中的表达

通过RT-PCR方法从分泌戊型肝炎(戊肝)病毒中和性鼠源单克隆抗体(单抗)8C11的杂交瘤细胞中克隆出抗体基因的重链可变区(VH)、轻链可变区(VK)序列,并分别克隆到含有人gamma 1重链和kappa轻链恒定区序列的pcDNA3.1/Hygro和pcDNA3.1( )质粒中,共转染中华仓鼠卵巢癌细胞(CHO)细胞.RT-PCR结果表明,转染的CHO细胞转录了嵌合重链及轻链基因,间接ELISA及Western blot结果表明:翻译出的两种多肽在细胞内正确组装成嵌合抗体分子,并可分泌至细胞外,表达的嵌合抗体保留了原鼠单抗的抗原结合特异性及对8H3结合抗原的增强作用.8C11嵌合抗体的成功表达可降低鼠源性,为探讨戊肝抗体治疗的可能性奠定了基础.     

丁酸钠和丙酸钠对工程CHO细胞生长代谢和嵌合抗体表达的影响

抗p185erbB-2基因工程抗体是一种有潜力的抗肿瘤药物。以稳定表达抗p185嵌合抗体的重组工程CHO细胞株为对象,分别用不同浓度丁酸钠(0~2mmol/L)和丙酸钠(0~10mmol/L)对处在对数生长期的细胞进行处理,在连续5d的培养过程中,每隔24h取样测活细胞数量,并用ELISA检测上清中抗体含量,5d后结束培养用FACS检测细胞周期。同时还用丁酸钠和丙酸钠处理长至90%满度的细胞,然后每隔12h取样一次检测葡萄糖和乳酸的含量。结果表明丁酸钠和丙酸钠可以有效地提高嵌合抗体在工程CHO细胞中的表达,表达量最高时可达58.3~59.6mg/L,是对照组的1.5倍。同时抑制细胞生长和阻断细胞周期在G1期,并且可减少培养过程中葡萄糖的消耗和乳酸的生成。和丁酸钠相比,丙酸钠具有较小的细胞毒性,是一种有潜力的替代品。     

抗P185工程抗体表达与纯化的研究

人类的原癌基因Her-2编码一个185kDa的跨膜受体酪氨酸激酶,也称为p185,是肿瘤相关蛋白,在多种癌细胞,特别乳腺癌中有高表达。本实验室构建了抗p185/HER-2的二价的嵌合抗体（scFv-Fc）,并证明其保留了亲本抗体的特异结合活性,进而建立了高表达的细胞株。本研究对该嵌合抗体进行滚瓶大规模培养,并对培养产物的纯化条件进行了摸索,建立了亲和层析和阳离子交换层析两步法。最终产物的纯度达到95％以上,回收率为63％。我们还摸索了嵌合抗体的冻干保存条件,抗体可以保持其稳定性和结合活性达一年以上。嵌合抗体纯化工艺和保存条件的确定,为进一步的临床研究奠定了基础。     

抗ErbB2嵌合抗体chA21大规模纯化工艺的建立及质量研究

自行研制的抗ErbB2嵌合抗体chA21具有抑制高表达ErbB2的乳腺癌细胞生长的作用。在前期小规模培养和纯化工作的基础上,以填充床生物反应器大规模培养CHO工程细胞株表达的上清为原料,采用亲和层析、凝胶过滤除盐、阳离子交换层析、分子筛等步骤,分离纯化嵌合抗体chA21,建立了大规模纯化工艺,并按照中国药典（2005年版第三部）对最终产品进行全面鉴定和质量控制。该工艺能有效解决抗体纯化过程形成的多聚体问题,去除内毒素和DNA残留;可以确保每批纯化20~40L培养上清,每批收获嵌合抗体可达5g以上,蛋白总回收率大于50％,纯度可达98％。研究结果表明,该抗体纯化工艺得率高,质量控制方法稳定可靠,适用于大规模生产。