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1.
用重叠PCR技术将PTH(parathyroid hormone, 甲状旁腺激素)基因与TFN(transferrin N_terminal half_molecule, 转铁蛋白N端半分子)基因在体外融合,融合基因克隆至真核表达载体pPIC9中,转化毕赤酵母GS115。转化子经甲醇诱导后,融合蛋白得到了表达并分泌到发酵上清液中。经 SP Sepharose F F阳离子交换层析、Phenyl Sepharose Fast Flow疏水层析纯化获得了纯度大于95%的PTH_TFN样品。Western blot分析及腺苷酸环化酶实验证明融合蛋白中的PTH具有与抗PTH抗体结合能力及刺激腺苷酸环化酶的活性,铁饱和实验证明融合蛋白中的TFN和单独的TFN具有相同铁结合能力。因而TFN可望作为PTH的天然运输载体。 相似文献
2.
目的:采用基因工程手段构建基因工程菌表达α-2b干扰素。方法:根据毕赤酵母密码子嗜好性原理设计并合成α-2b干扰素基因序列,将其插入到毕赤酵母Pichia pastoris的分泌型表达质粒pPIC9K中,得到重组分泌表达质粒pPIC9K-IFNα-2b,并用电转化法转化P.pastoris GS115。筛选出整合型His Muts菌株,进一步用G418筛选获得高拷贝转化子,经5d诱导表达后SDS-PAGE检测。结果:菌落PCR和序列测定结果显示重组表达质粒已成功构建,SDS-PAGE结果显示目的蛋白已成功表达。结论:在毕赤酵母中成功表达α-2b干扰素。 相似文献
3.
人β干扰素-血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达 总被引:15,自引:1,他引:15
利用重叠PCR技术在体外拼接IFN β和HSA基因,将得到的融合基因插入到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,置于启动子AOX1和α交配因子信号肽的作用下,分泌表达融合蛋白IFNβ-HSA。重组质粒pPIC9K-IFNβ-HSA经SalI线性化,电击转化毕赤酵母KM71,经G418筛选得到高拷贝转化子。PCR鉴定后,用甲醇诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析表达的融合蛋白IFNβ-HSA表明该蛋白分子量约为90kDa且具有HSA的抗原性;用细胞病变抑制法测定发酵液上清中融合蛋白的干扰素活性约为640IU/ml。 相似文献
4.
猪干扰素-γ基因在毕赤酵母中的分泌表达 总被引:5,自引:0,他引:5
将去除信号肽的猪干扰素-γ(PoIFN-γ)基因置于酿酒酵母α因子分泌信号的DNA序列后, 构建成pPIC9K-α-PoIFN-γ分泌型重组表达载体, 电转化导入毕赤酵母GS115中,经G418筛选后获得2株多拷贝插入的重组子。SDS-PAGE和Western blot分析结果表明,所获得的重组子能够分泌表达出17kD和23kD左右的PoIFN-γ特异蛋白,其表达量为108mg/L,占培养液总蛋白的60%。实验首次在毕赤酵母表达系统中实现了PoIFN-γ基因的分泌表达。 相似文献
5.
6.
目的:实现鸡α干扰素(ChIFNα)在毕赤酵母GS115中的表达,并考察糖基化对其表达的影响。方法:人工合成按照毕赤酵母偏好密码子优化的ChIFNα基因,克隆至分泌表达载体pPIC9,电转到毕赤酵母GS115中进行表达。利用定点突变对ChIFNα基因序列中4个糖基化位点进行缺失,SDS-PAGE分析N-糖基化对毕赤酵母表达ChIFNα的影响。结果:ChIFNα在GS115中获得了表达,在摇瓶发酵条件下,表达量为35.2 mg/L;构建了缺失1~4个糖基化位点的4个突变体,在GS115中实现了表达,分析表达结果显示,与未突变的ChIFNα对照相比,突变体的糖基化程度和表达量都有大幅度下降。结论:N-糖基化对于毕赤酵母表达ChIFNα具有重要影响,无糖基化的ChIFNα在毕赤酵母中表达量极低。 相似文献
7.
人血清白蛋白和人干扰素α2b的融合蛋白在毕赤酵母中的表达 总被引:12,自引:0,他引:12
为了延长IFNα2b在血浆中的半衰期,构建了编码HSA和hIFNα2b的融合基因并在毕赤酵母中获得高效表达,工程菌经5L发酵罐培养后获得的含融合蛋白的培养液经超滤浓缩、蓝色葡聚糖凝胶层析、疏水柱层析以及阴离子柱层析,融合蛋白的纯度达到95%以上。该融合蛋白能与干扰素抗体和人血清白蛋白抗体结合,并表现出与重组干扰素α2b相似的抗病毒活性。以猕猴为动物模型,分别从静脉和皮下单剂量给药,给药浓度为90μg/kg时,在336h后血浆中仍可检测到融合蛋白。其静脉注射的血浆半衰期为101h,皮下注射的半衰期为68.2h。皮下注射的生物利用度为67.9%。IFNα2b与HSA融合后,明显的延长了血浆半衰期,显现了其良好的临床应用前景。 相似文献
8.
复合干扰素突变体在毕赤酵母中的表达、纯化及活性分析 总被引:1,自引:0,他引:1
根据毕赤酵母密码子偏性合成了复合干扰素突变体基因 ,克隆至分泌型酵母表达载体pMEX9K ,将重组载体pMEX CIFNm用SacⅠ线性化后 ,转化毕赤酵母GS115 .转化子经诱导后 ,培养上清有抗病毒活性的蛋白产生 .经过离子交换 ,疏水层析 ,凝胶过滤三步层析纯化 ,得到了纯度大于95 %的重组复合干扰素突变体 ,经N端氨基酸序列分析表明 ,该蛋白N端序列与理论值一致 ,质谱测定分子量为 19 3kD ,与理论值一致 .用细胞病变抑制法测定其活性 ,并结合Lowry法蛋白定量计算其比活性为 6× 10 8IU mg ,与复合干扰素的比活相当 . 相似文献
9.
在5L发酵罐下开展毕赤酵母流加培养表达pIFN-α研究。通过多批次研究,结果表明:诱导阶段,RQ稳定情况可以作为反映底物甲醇浓度水平是否合适以及pIFN-α活性高低的监控指标。当甲醇浓度在8~12g/L水平时,RQ在整个诱导阶段能稳定在0.4~0.5之间某个特定值上,同时pIFN-α最高活性都能维持在106IU/mL水平上;而当甲醇浓度在0~5g/L或15~20g/L范围内时,RQ很不稳定,分别在0.15~0.4和0.4~0.8区间上下振动,相应的pIFN-α最高活性也只在10^3IU/mL和10^4IU/mL水平上。 相似文献
10.
毕赤酵母表达猪干扰素-γ基因及其抑制蓝耳病病毒效果 总被引:11,自引:0,他引:11
为了研究和应用猪重组干扰素-γ(rPoIFN-γ)预防和治疗病毒性疫病,将大白猪PoIFN-γ基因插入到酵母整合载体pHIL-S1、构建了重组GS115工程菌(pHIL-S1/rPoIFN-γ)。经过SDSPAGE、Western blot分析和抗滤泡性口炎病毒(VSV)活性测定,证实rPoIFN-γ分子量为18 kD,在GS115中的表达量为18%;其抗VSV活性为450~540 u/mL。用rPoIFNγ处理猪肺巨噬细胞系Marc145后,经细胞病变抑制法(CPE50)测定,rPoIFNγ可以抵抗蓝耳病病毒(PRRSV)感染。结果显示酵母表达的rPoIFN-γ是有应用价值的抗病毒生物工程制剂。 相似文献
11.
将含编码HSA天然信号肽、HSA和新型集成干扰素(NIFN)的融合基因,插入毕赤酵母表达载体pPIC3.5,转染毕赤酵母GS115,用于分泌表达融合蛋白HSA-NIFN的酵母工程菌。诱导表达后,产物经SDS-PAGE、Western blot和MALDI-TOF-MS分析表明该蛋白分子量为86369Da,且能被抗HSA单抗特异性结合;表达的HSA-NIFN经超滤、Blue亲和层析和CM阳离子交换层析纯化后,HSA-NIFN的纯度大于95%。用细胞病变抑制法测定其比活性为7.75±0.39×106IU/mg。 相似文献
12.
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目的:在巴斯德毕赤酵母中表达有降糖活性的人胰高血糖素样肽-1(hGLP-1)突变体(2Gly-hGLP-1)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白。方法:为将GLP-1氨基酸序列第2位的丙氨酸(Ala)定点突变为甘氨酸(Gly),根据毕赤酵母偏爱密码子合成编码2Gly-hGLP-1的基因;采用重叠PCR法拼接2Gly-hGLP-1和HSA的基因,使得2Gly-hGLP-1的C端与HSA的N端通过甘氨酸五肽接头连接;将该融合基因插入表达载体pPIC9构建为重组载体pPIC9/2Gly-hGLP-1-HSA,电击转化至毕赤酵母GS115细胞,通过表型筛选和诱导表达实验获得高效表达菌株;工程菌在5L发酵罐中培养后,对发酵产物进行分离纯化和生物学活性分析。结果:融合蛋白在5L发酵罐中的表达量约为200mg/L,经纯化后纯度可达95%以上;小鼠糖耐量实验表明该融合蛋白具有明显的控血糖活性。结论:在毕赤酵母中分泌表达的融合蛋白2Gly-hGLP-1-HSA具有降血糖活性。 相似文献
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目的:构建GLP-1-IgG Fc融合蛋白分子并在毕赤酵母中实现高效表达.方法:使用蛋白质工程技术改造GLP -1,去除其蛋白酶降解位点,然后利用重叠延伸PCR方法得到改造后的GLP -1与人IgG-Fc片断的嵌合体基因并将其插入pPIC9K载体中.以重组载体转化巴斯德毕赤酵母菌中进行表达.采用SDS-PAGE和Western Blot方法检测重组蛋白的表达.结果:成功的构建了GLP -1-IgG Fc嵌合体基因并使其在重组毕赤酵母中高效分泌表达.在25℃条件下,摇瓶培养添加0.5%甲醇诱导72h后融合蛋白的表达量最大,为5mg/L.SDS-PAGE和Westem-Blot结果表明表达产物为GLP -1-IgG Fc融合蛋白.结论:获得了高效表达GLP -1-IgG Fc融合蛋白的毕赤酵母菌株,为GLP -1-IgG Fc的活性和半衰期测定及下一步的开发奠定了基础,并为在毕赤酵母菌中表达其他Fc融合蛋白和抗体提供了参考. 相似文献
17.
为了获得结核分枝杆菌ESAT 6蛋白在毕赤氏酵母中的高效表达 ,将人α-2a干扰素基因、结核分枝杆菌esat-6基因经PCR扩增并加上相应的酶切位点 ,两基因之间的DNA接头编码肠激酶识别的多肽 ,DNA经酶切连接插入分泌型载体pPIC9K ,将重组表达质粒pPIC9K-α2a-esat6用SalⅠ单酶切之后 ,电击转入PichiapastorisSMD1168中 ,采用G418梯度筛选获得高抗性转化子。以甲醇作为诱导物 ,发酵4d后取上清 ,进行SDS PAGE和Westernblot鉴定并分析表达产物的干扰素活性。结果表明 ,重组菌株成功地分泌表达了分子量大小约为 30kD的融合蛋白 ,表达产物不仅具有较高的干扰素活性 ,而且可以和结核病人血清发生特异性结合 ,为结核病的特异性诊断和结核病新型疫苗的研制打下了基础. 相似文献
18.
通过RT-PCR方法,以埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)总RNA为模板,克隆出糖化酶(glucoamylase,amyA)基因的成熟肽编码序列(1 857 bp),编码618个氨基酸;以类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)H10-3基因组DNA为模板,克隆出木聚糖酶(xylanaseA,xynA)基因的成熟肽编码序列(636 bp),编码211个氨基酸.通过重叠延伸PCR( SOE-PCR)得到拼接片段amyA-l-xynA,并将其克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9中,得到重组质粒pPIC9-amyA-l-xynA,重组质粒线性化后经电击转化到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,得到了表达成功的工程菌ALX2.在ALX2发酵上清液中同时检测到糖化酶活性(10.7 U/mL)和木聚糖酶活性( 51.8 U/mL). 相似文献
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外源基因在毕赤酵母中表达的优化 总被引:1,自引:0,他引:1
巴斯德毕赤酵母是近年来成功的外源基因表达系统,已表达出众多外源蛋白。它既能像原核生物一样快速生长高密度发酵,又能进行真核翻译后修饰,并且蛋白分泌量大,因此应用越来越广泛。如果对它的表达载体,转化诱导条件和目的基因内部结构,发酵条件等方面进行优化,能够进一步发挥它的优势,更好地表达需要的外源蛋白。本文就毕赤酵母表达系统表达优化进行总结综述。 相似文献