脊髓培养神经元中微管相关蛋白-5的分布及可塑性

用新生 Wistar大鼠进行脊髓神经元培养 ,研究微管相关蛋白 - 5与其单克隆抗体结合后的分布情况。使用微管解聚药 nocodazole处理神经元 ,应用免疫组织化学染色来观察微管相关蛋白 - 5的改变。另一组神经元使用 nocodazole处理后再用 PMA处理 ,观察微管相关蛋白 - 5及神经元的改变。结果表明 ,微管相关蛋白 - 5在胞浆及突起中均有分布 ,并随着培养天数的递增而递减。使用 nocodazole后神经元中微管相关蛋白 - 5的分布及数量明显减少。PMA处理神经元后尽管使微管相关蛋白 - 5的正常结构被破坏 ,而神经元的伸展却不受影响     

原代培养脊髓神经元线状溶酶体与细胞骨架蛋白-纽蛋白关系的研究

目的研究原代培养脊髓神经元线状溶酶体(nematolysosome)的形成与分布及其与细胞骨架蛋白-纽蛋白(vinculin)的关系.方法用细胞松弛素D(cytochalasin D,CD)及佛波醇酯(phorbol myristate acetate,PMA)处理原代培养脊髓神经元,用免疫荧光双标记纽蛋白及组织蛋白酶D(cathepsin D)、酸性磷酸酶(ACPase)、电镜细胞化学及共焦激光扫描显微镜方法研究线状溶酶体与纽蛋白的关系.结果在正常对照组神经元,组织蛋白酶D(标记溶酶体)与纽蛋白分布于胞质及突起内;在CD及PMA处理神经元,纽蛋白及组织蛋白酶D的分布呈向心性移动,但集聚的部位不同;电镜酶细胞化学方法显示CD组及PMA组神经元内线状溶酶体均增多.结论组织蛋白酶D及纽蛋白在培养脊髓神经元内协同分布,CD及PMA均可引起二者分布的变化,提示纽蛋白可通过增强细胞内吞体/溶酶体系统活动而使线状溶酶体增加,也可通过促进丝状肌动蛋白聚合而影响线状溶酶体的形成及运动.     

玉米根细胞中类整合素蛋白与α-微管蛋白的共定位及其可能的相互作用

采用间接免疫荧光标记法对玉米根细胞中的类整合素蛋白和细胞骨架主要组分之一的α-微管蛋白进行了荧光定位。结果表明：类整合素蛋白主要分布在质膜上。与对照相比,用与类整合素蛋白特异结合的5肽GRGDS处理后,质膜上类整合素的分布更为均匀,微管的排列密度降低,而用不与类整合素蛋白特异结合的GRGDS类似物SDGRG处理则对类整合素蛋白分布和微管蛋白的排列均无明显影响。微管蛋白解聚剂或稳定剂处理改变类整合素在质膜上的分布。这些结果表明类整合素蛋白与微管蛋白间有复杂的相互作用。     

纽蛋白在原代培养脊髓神经元的分布及其与神经元形态的相关性

目的　用免疫组织化学及形态学等方法对原代培养大鼠脊髓神经元的形态及其纽蛋白 (vinculin)分布进行研究。方法　实验采用原代培养的大鼠脊髓神经元 ,用细胞松弛素 D(cytochalasin D) -丝状肌动蛋白解聚剂处理细胞后 ,用相差显微镜观察细胞形态 ,同时用单克隆抗体免疫组化方法显示细胞内纽蛋白的分布。结果　原代培养的脊髓神经元可见 2～4个细长的突起 ;免疫组织化学方法显示纽蛋白在神经元的胞体及突起均有分布。细胞松弛素 D处理细胞后 ,神经元胞体变大 ,轮廊不清 ,突起增多 ,变短、变粗 ,多分支且分支末端膨大 ;免疫组织化学方法显示纽蛋白在核周的分布明显增加 ,而在突起内的分布则变得不连续 ,呈散在点状。结论　丝状肌动蛋白 (filem ental- actin,F- actin)的完整性对维持神经元的正常形态是必需的 ;神经元形态的变化与纽蛋白分布的变化相关     

神经干细胞分化过程中微管蛋白表达变化的光电镜观察

目的对神经干细胞向神经元定向分化过程中微管蛋白的表达变化进行光、电镜观察研究。方法采用细胞培养技术、免疫荧光技术以及免疫电镜技术对神经干细胞向神经元定向分化过程中微管蛋白的表达变化进行观察。结果在神经干细胞向神经元定向分化的不同时期,存在微管蛋白的表达变化,在分化初期以核周附近分布明显,随神经元的成熟散在分布于胞质中及突起内,形成细网状,构成细胞骨架,维持细胞形态。结论在神经干细胞向神经元定向分化过程中伴随有微管蛋白的表达变化,随神经元的成熟而构成细胞骨架,维持细胞形态。     

纽蛋白在原代培养脊髓神经元的分布及其在神经元形态的相关性

目的：用免疫组织化学及形态学等方法对原代培养大鼠脊神经元的形态及其纽蛋白（vinculin)分布进行研究。方法：实验采用原代培养的大鼠脊髓神经元,用细胞松驰素D（cytochalasinD)－丝状肌动蛋白解剖处理细胞后,用相差显微镜观察细胞形态,同时用单克隆抗体免疫组化方法显示细胞内纽蛋白的分布,结果：原代培养的脊髓神经元可见2－4个细长的突起,免疫组织化学方法显示纽蛋白姑神经元的胞体及突起均有分布,细胞松驰素D处理细胞后,神经元胞体变大,轮廓不清,突起增多,变矩,变粗,多分支且分支末端膨大,免疫组织化学方法显示纽蛋白在核周的人布明显增加,而且在突起内的分布则变得不连续,呈散在点状。结论：丝状肌动蛋白（filemental-actin,F-actin）的完整性对维持神经元的正常形态是必需的,神经元形态的变化与纽蛋白分布的变化相关。     

PKC对原代培养神经元NF-кB表达的影响

用蛋白激酶C（PKC）刺激剂佛波醇酯（PMA）和PKC抑制剂Rottlerin处理培养神经元,RT—PCR法检测神经元NF—xBp65 mRNA的表达;用PMA和NF—κB抑制剂TPCK处理培养神经元,流式细胞术AnnexinV／PI法检测细胞早期凋亡率。观察PKC对原代培养神经元核转录因子kappaB（NF～KB）表达的影响,探讨PKC参与缺血性神经元损伤的可能机制。结果显示PKC可促进NF—κB的表达;NF—κB可诱导培养神经元的早期凋亡。由此可以得出PKC激活参与神经元的损伤可能是通过引起神经元内NF—κB的表达而实现的.     

神经元微管蛋白的研究进展

神经元特殊形态的形成及维持主要依赖于神经元细胞骨架中微管的装配,在此过程中,涉及到微管的组成及其动力学性质,而最终形成了稳定的微管结构,在神经元中,这一结构为沿着神经突运输物质提供了基础。本文将主要在神经元微管的结构与功能,神经元微管蛋白异构基因的表达及其翻译后加工形式等方面的研究进展加以综述。     

嗜热四膜虫接合生殖后期皮层细胞骨架蛋白的研究

用秋水仙素和细胞松驰素B处理接合期的嗜热四膜虫,以观察其对接合生殖期,尤其是接合后期的嗜热四膜虫皮层细胞骨架蛋白的影响,用秋水仙素处理的试验组的皮层细胞骨架蛋白组分中34KD、37KD、46KD和57KD蛋白的含量有明显改变,而用细胞松驰素B处理的试验组中40KD和74KD蛋白的含量改变较大。根据相关文献,作者推测34KD、37KD、46KD、57KD蛋白是微管蛋白,而40KD和74KD可能是微丝蛋白。这些蛋白对嗜热四膜虫接合过程中的形态发生的重要作用有等进一步研究。     

6-DMAP诱导PM胚胎形成过程中核纤层蛋白B的动力学变化

我们的前期研究发现:被微管抑制剂nocodazole抑制在第一次有丝分裂中期的小鼠受精卵在加入6-DMAP处理后核膜重新出现,并且父、母本的基因组未发生融合,分别形成了类似雌、雄原核的两个细胞核,它们共存于卵细胞质中,我们把这种特殊的胚胎称之为PM胚胎(post-mitoticembryo)。本研究表明:在去除抑制剂3h后未能形成核膜的胚胎进一步卵裂,而形成核膜的PM胚胎培养24h未见进一步发育。此外,我们采用免疫荧光染色观察PM胚胎核膜重现过程中核纤层蛋白B的动力学变化,结果显示:在加入6-DMAP后核纤层蛋白B在染色体周围逐渐聚集,约3h后核膜完全形成,此时核纤层蛋白B在染色体周围的聚集达到最高峰。文中还对6-DMAP诱导核膜形成的机制进行了探讨。     

小鼠小脑颗粒神经元的原代培养与鉴定

本研究通过体外分离培养及鉴定原代小鼠小脑颗粒神经元(cerebellar granule neurons,CGNs),为神经科学研究提供原代神经元细胞模型。取生后第7天的ICR乳鼠小脑,在解剖体视镜下剥离脑膜及血管,经刀片切碎、0.25%胰酶消化、移液器吹打、70μm尼龙滤网制备单细胞悬液,差速贴壁后接种于新鲜配置的培养基。倒置相差显微镜观察不同时间CGNs的形态变化。采用神经元的标记蛋白微管相关蛋白-2(microtubule associated protein 2,MAP2),星形胶质细胞的标记蛋白胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP),小胶质细胞的标记蛋白(type 3 complement receptor,CR3/CD11b)进行免疫荧光检测培养的原代CGNs纯度。原代培养CGNs接种20 min后即贴壁良好,培养24 h后细胞伸出突起,培养第7天神经元成熟,形成丰富的轴突,树突和胞间突触连接。经免疫荧光鉴定,CGNs纯度可达95%以上。成功体外分离培养出高纯度的原代CGNs,可应用于CGNs的体外研究。     

阿糖胞苷对大鼠海马神经元原代培养的影响

目的：探讨在大鼠海马神经元原代培养过程中,阿糖胞苷对培养神经元的影响。方法：将新生24 h大鼠,分离出海马组织,进行原代海马神经元培养,再将细胞分为阿糖胞苷组和对照组,阿糖胞苷组加入1μmol/L阿糖胞苷,通过检测神经元特异性标志物微管相关蛋白-2（Map-2）计算培养神经元的数量,通过台盼蓝染色法观察细胞的存活率。结果：培养第7天,阿糖胞苷组神经元数量为（11±3）个,对照组为（10±4）个,两组无明显差异;阿糖胞苷组神经元细胞在培养第14天时存活率为74%,培养第21天时存活率为49%,而对照组神经元14天时存活率为96%,21天存活率为88%,两组神经元存活率差异明显。结论：原代培养海马神经元时,阿糖胞苷对神经元产量及形态影响不明显,但是由于阿糖胞苷的毒性作用,明显缩短神经元的存活时间,影响长期培养神经元的存活率。     

Taxol对培养的人成纤维细胞内微管组装的影响

本实验用微管的PAP免疫酶细胞化学方法,研究了培养的小儿包皮成纤维细胞及其分离的中心体在taxol的作用下对微管组装的影响。实验结果表明taxol对低温(4℃)和微管解聚药物的处理具有拮抗作用,它阻止微管解聚,对微管具有稳定作用,并观察到taxol可降低中心体对微管组装所需的管蛋白临界浓度,增强中心体对微管的组装能力。Taxol对细胞内微管的影响,主要表现在促使微管呈束状浓集化,并随处理时间的延长,这种浓集化表现愈益明显,导致破坏胞质CMTC的正常分布。由于taxol能使微管浓集化,抑制其解聚,使得细胞从G_2期进入M期后,微管不解聚,从而不能形成正常的纺锤体,胞质不分裂,最后导致细胞微核化。用秋水仙酰胺处理后再加taxol时,我们观察到细胞CMTC与正常未经处理的细胞CMTC比较,呈相反的分布现象,这可能与秋水仙酰胺促使中心体与细胞核分离和taxol增强中心体对微管的组装有关。     

小鼠孤雌胚早期发育过程中γ-微管蛋白的动态变化

微管蛋白是构成微管的主要蛋白,其中α、β亚单位形成异二聚体,而γ-微管蛋白在微管组装中起作用。为了研究小鼠早期孤雌胚中廿微管蛋白的动态变化,本实验采用了免疫荧光化学染色与激光共聚焦显微镜观察相结合的方法,在SrCl2激活的卵母细胞减数分裂以及早期孤雌胚有丝分裂过程中对γ-微管蛋白进行了定位观察。结果显示,SrCl2和细胞松弛素B（cytochalasin B,CB）诱导的第二次减数分裂中期（metaphase Ⅱ ofmeiosis,MII）小鼠卵母细胞恢复减数分裂,并且纺锤体始终与质膜平行,表明纺锤体旋转被抑制,但核分裂不受影响。减数分裂过程中γ-微管蛋白主要定位于中期纺锤体两极和后期分开的染色单体之间;孤雌活化两雌原核形成以后,γ-微管蛋白聚集在两雌原核周围。在早期孤雌胚有丝分裂间期无定形的γ-微管蛋白均匀分布于核;前中期γ-微管蛋白向两极移动,遍布于整个纺锤体区。有丝分裂中期、后期和末期廿微管蛋白的分布变化与减数分裂相似。结果表明,SrCl2和CB激活的MII卯母细胞产生杂合二倍体;γ-微管蛋白具有促微管负极帽形成和稳定微管的功能,从而促进纺锤体的形成;分裂后期和末期廿微管蛋白的重新分布可能是由纺锤体牵引同源染色体分离所诱导的：γ-微管蛋白负责两雌原核的迁移靠近。     

红藻氨酸诱导原代培养皮质神经元兴奋毒中p21变化及机制的研究

目的：探讨p21在红藻氨酸诱导的原代培养皮质神经元兴奋毒中的变化及可能机制。方法：原代培养大鼠皮质神经元经红藻氨酸（KA）处理24h后,激光共聚焦显微镜透射光下观察细胞损伤,应用Western blotting方法检测p21与p53蛋白表达的变化,用染色质免疫共沉淀（ChIP）-聚合酶链反应（PCR）方法检测p53与p21基因启动子上p53反应元件1结合情况。结果：KA处理后神经元明显损伤,部分细胞胞体缩小、变圆,突起变短、减少或消失,p21与p53蛋白表达上调,并且p53与p21基因启动子上的p53反应元件1结合增加。结论：在KA诱导的原代培养皮质神经元兴奋毒作用中p21蛋白表达上调,而p53直接参与了p21的激活。     

γ-微管蛋白在猪卵母细胞成熟和活化中的分布

微管蛋白(tubulin)是一蛋白质超家族,其中α-,β-微管蛋白是主要的微管蛋白,而γ-微管蛋白主要在微管组装中起作用. 我们利用蛋白质印迹和激光共聚焦技术研究了γ-微管蛋白在猪卵母细胞成熟、受精和活化中的分布. γ-微管蛋白存在于猪卵母细胞中,并且在减数分裂成熟各个时期的量保持不变. 它聚集在微管上,特别是中期纺锤体的两极和后末期的中板. 体外受精和孤雌活化后,γ-微管蛋白聚集在雌雄原核的周围.另外它也存在于精子的顶体帽和颈部.在早期卵裂中,γ-微管蛋白聚集在胚胎的细胞核周围.实验结果表明,γ-微管蛋白在猪卵母细胞、精子和胚胎的微管组装中起重要的调节作用,在猪受精过程中,精子和卵子都向受精卵贡献中心体物质.     

γ-微管蛋白在猪卵母细胞成熟和活化中的分布(英)

微管蛋白（tubulin）是一蛋白质超家族,其中α-,β-微管蛋白是主要的微管蛋白,而γ-微管蛋白主要在微管组装中起作用. 我们利用蛋白质印迹和激光共聚焦技术研究了γ-微管蛋白在猪卵母细胞成熟、受精和活化中的分布. γ-微管蛋白存在于猪卵母细胞中,并且在减数分裂成熟各个时期的量保持不变. 它聚集在微管上,特别是中期纺锤体的两极和后末期的中板. 体外受精和孤雌活化后,γ-微管蛋白聚集在雌雄原核的周围.另外它也存在于精子的顶体帽和颈部.在早期卵裂中,γ-微管蛋白聚集在胚胎的细胞核周围.实验结果表明,γ-微管蛋白在猪卵母细胞、精子和胚胎的微管组装中起重要的调节作用,在猪受精过程中,精子和卵子都向受精卵贡献中心体物质.     

Sonic Hedgehog过表达下调后脑五羟色胺能神经元数量

目的:本研究主要是探索高浓度的Shh对后脑5-HT神经元数量的影响。方法:通过免疫荧光和原位杂交手段检测Shh在脑干的表达情况。离体培养5-HT神经元,用不同浓度Shh蛋白处理,观察5-HT神经元的数量变化以及对轴突的影响。通过胚胎宫内电转,检测Shh过表达后脑5-HT神经元的数量变化。结果:Shh在脑干5-HT神经元分布区域内表达。离体培养的5-HT神经元,250 ng/m L的Shh蛋白处理后神经元数量为41.25±0.52(n=4,P=0.0218),与对照组35±1.21(n=4)相比,神经元数量上调。相反,1250 ng/m L的Shh蛋白处理后神经元数量为7.5±0.43(n=4,P0.0001),与对照组相比,神经元数量极显著下降。250 ng/m L的Shh蛋白处理后5-HT神经元轴突长度为1.08±0.05(n=4,P=0.7555),与对照组1±0.01(n=4)相比,轴突长度没有显著性差异。然而1250 ng/m L的Shh蛋白处理后5-HT神经元轴突长度为0.44±0.03(n=4,P=0.0014),与对照组相比,轴突长度极显著缩短。胚胎宫内电转p IRES-Shh-EGFP和p IRES-EGFP,观察到Shh过表达缝核上行5-HT神经元数量为147±54.2(n=4,P=0.0053),相较于对照组459±49.0(n=4),神经元数量极显著下降。同样地,Shh过表达缝核下行5-HT神经元数量为187±18.4(n=4,P=0.0001),相较于对照组411±17.3(n=4),神经元数量也发生了极显著下降。结论:Shh过表达对5-HT神经元的发育有负向的调控作用,主要表现在引起后脑缝核5-HT神经元数量减少。     

SIRT3在氧糖剥夺再灌注损伤小鼠神经元中的表达及意义

目的:通过建立体外脑缺血模型,探讨沉默信息因子3(SIRT3)在小鼠皮层神经元氧糖剥夺再灌注(OGD/R)损伤后的表达和意义。方法:C57BL/6J小鼠皮层神经元原代培养7天后,以氧糖剥夺不同时长(2 h、4 h、6 h、8 h)再灌注24 h作为观察时间点,利用细胞增殖-毒性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)检测细胞活力;小鼠乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测LDH释放;蛋白印迹法(Western blot WB)观察微管相关蛋白1轻链3(LC3-Ⅱ)、活化凋亡蛋白3(Cleaved caspase-3)、以及SIRT3的表达变化;免疫荧光下进一步观察LC3-II、SIRT3表达。结果:与正常组比,随着氧糖剥夺时间的延长,LDH释放量呈台阶式升高(P0.01),而神经元活性进展性下降(P0.01);蛋白印迹结果发现在缺血损伤后LC3-Ⅱ整体上调,并于OGD 4h达峰值,SIRT3分子表达趋势与LC3-Ⅱ相似均呈抛物线状,而Cleaved caspase-3整体上调;相应的,细胞免疫荧光结果显示缺血损伤后神经元胞体和突起中LC3呈点状高表达,与此同时SIRT3荧光强度亦增高。结论:神经元缺血时间越长损伤越重;LC3-Ⅱ和SIRT3表达呈现相似性;SIRT3可能通过调控线粒体自噬参与了拮抗神经元缺血损伤的作用。     

回转器旋转对体外培养的鸡胚神经元的影响

用回转器旋转研究重力改变对体外培养的鸡胚神经元的影响。结果发现在回转器里经过７－９小时的处理后,神经元的形态和行为发生明显改变。只有６．３％的神经元呈现两极型的运动形态,而对照组正常培养的细胞运动形态的神经元占３４．２％。某些细胞的突起出现异常,呈现扭曲的形状。在培养基质上的神经元伸出许多丝状突起,丝状突起的末端锚定在周围的细胞上或锚定在培养基质上。经过重力改变处理的细胞重新放在相差显微镜下观察,结果显示神经元的运动活性降低,许多细胞没有观察到明显运动的迹象。