分离植物原生质体的纤维素酶的制备及性质

EA_3-867纤维素酶是由绿色木霉变异株EA_3-867,用稻草粉发酵提取,经过饱和硫酸铵沉淀,分子筛脱盐,冰冻干燥制成的。酶制剂在水中溶解度高,酶活力较稳定,它含有纤维素酶(C_1,C_x)、果胶酶、半纤维素酶等组分,是一种比较理想的分离植物原生质体的复合酶。我们用EA_3-867酶制剂已从20多种植物材料中分离出大量完整的原生质体,并把烟草的叶肉组织或愈伤组织的原生质体培养分化成植株。EA_3-867纤维素酶制剂的成功制备为我国进一步开展植物原生质体和体细胞杂交等研究提供了有利条件。     

EA_3—867纤维素酶的简易冷冻干燥法

近年来,为开展植物原生质体培养和细胞杂交研究,我们利用木霉EA_3—867菌株发酵,制备纤维素酶,并对该酶的性质进行了研究。酶制剂活力和质量不仅与菌株种类、发酵过程的条件等,而且与最后干燥方法有关。最     

木霉纤维素酶的诱导形成及其调节 Ⅳ.高产变异株纤维素酶合成调节的变化——酶活提高原因的初步分析

拟康氏木霉纤维素酶高产变异株EA_3-867和N_2-78在合成培养基琼脂平板和马铃薯葡萄糖琼脂平板上菌落明显缩小,生长变慢。但在蛋白胨酵母膏琼脂平板上,小菌落恢复成大菌落,生长速度同野生型菌株一致。EA_3-867和N_2-78在不同液体培养基中纤维素酶活力均显著高于野生型菌株1096和木_3。洗涤菌丝体的诱导测定也证明高产变异株的纤维素酶诱导活性有明显的提高。变异株和野生型菌株洗涤菌丝体诱导形成的纤维素酶组分,从聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱判断,未见明显差异,仅变异株中代表纤维素酶活性的蛋白带显著加深。高产变异株纤维素酶产量的增加是由于菌株对诱导剂敏感性的增加和对降解物阻遏敏感性的减弱。     

木霉纤维素酶的诱导形成及其调节 Ⅲ、葡萄糖母液和槐豆荚提取液对纤维素酶诱导效应的分析

葡萄糖母液对拟康氏木霉1096,木_3,EA_3-867和N_2-78的洗涤菌丝体的纤维素酶形成,有强力的诱导效应。用活性炭层析分离和纸谱分离证实,葡萄糖母液对纤维素酶的诱导效应主要是由于其中含有的槐糖杂质的缘故。龙胆二糖是葡萄糖母液中另一含量较高的杂质,但它对纤维素酶的诱导能力较槐糖低得多。槐豆荚提取液同样具有诱导木霉纤维素酶形成的作用。本文讨论了如何利用木霉纤维素酶形成的调节控制原理来加速和增加纤维素酶的产量。     

木霉纤维素酶的诱导形成及其调节 Ⅱ.槐糖对木霉EA_3-867洗涤菌丝体纤维素酶形成的诱导作用及降介物阻遏现象

槐糖对拟康氏木酶(Trichoderma pseudokoningii Rifai)EA_3—867洗涤菌丝体的纤维素酶形成有强力的诱导作用,经过3小时左右的延迟期,24小时后,纤维素酶便达到高峰。各种木霉菌种和EA_3—867不同菌令的菌丝体都能被槐糖诱导形成纤维素酶,c_1、c_x酶主要分布在胞外,纤维二糖酶分布在胞内。菌丝体诱导形成纤维素酶需要诱导剂;无机盐(氮、磷、铁、锰盐);适宜的温度、pH和通气;以及菌丝体细胞活跃的代谢。槐糖的最适浓度是10~(-3)～10~(-5)M,诱导的最适温度为30℃,适宜的pH范围3～6,最适pH为5。O_2能刺激纤维素酶的形成,而呼吸抑制剂碘乙酸、氟化钠、丙二酸、迭氮化钠和3,5-二硝基苯酚能强烈抑制菌丝产酶。槐糖对菌丝体纤维素酶的诱导形成能不同程度地被核酸代谢抑制剂如放线菌酮、5-氟尿嘧啶、6-氮杂尿嘧啶和放线菌素D抑制。葡萄糖、甘油、各种糖类、糖磷酸酯、有机酸、辅酶NAD、NADP及ATP~(**)均能阻遏槐糖对菌丝体纤维素酶的诱导作用。葡萄糖对纤维素酶形成的阻遏作用不能被c—AMP介除。     

烟草叶肉原生质体再生壁形成的培养条件的研究

用EA_3-867纤维素酶分离的烟草(Nicotiana tabacum)叶肉原生质体,在不同培养条件下进行液体浅层培养,用荧光增白剂VBL染色荧光法和低渗冲击法研究了再生壁形成的某些培养条件。结果表明,600～1000米烛光的弱光、10~5个原生质体/毫升的密度以及蔗糖或甘露醇作碳源,有利于壁的再生。     

培养条件对木霉形成纤维素酶的影响和两种形成纤维素酶的促进剂的初步观察

用液体培养法研究了木霉EA_3-867菌株纤维素酶形成的条件。在所测试的各种粗纤维材料中,稻草粉和黄豆皮的混合物(比例是4:6)是菌株纤维素酶形成的最好基质。若同时加入一些糖类,能显著促进纤维素酶形成。其中半乳糖效果最好,能使酶形成数量提高一倍或更多,葡萄糖和果糖也有一定效果。培养液的初始pH 6～7最有利于纤维素酶形成。稻草中存在着两种天然的纤维素酶形成的促进剂。一种是水溶性的,能和半乳糖起协同作用,共同促进纤维素酶形成。另一种是酯溶性的,不需加入糖类能单独促进纤维素酶形成。     

几种生长物质对烟草叶肉原生质体再生壁形成的影响

用EA_3-867纤维素酶分离的烟草(Nicotiana tabacum)叶肉原生质体,在附加不同生长物质的NT培养基中进行液体浅层培养。用荧光增白剂VBL染色荧光法研究了几种生长物质对再生壁形成的影响。结果表明,激动素为再生壁形成所必需,2,4-D对壁的再生无效,但缺少时会影响细胞的活力;香豆素和三碘苯甲酸分别在200 mg l~(-1)和20 mg l~(-1)以上的浓度下,抑制壁的再生;ABA不抑制壁的再生,但引起出芽;GA_3不影响壁的再生,但100 mg l~(-1)的浓度在一定程度上抑制壁的再生。     

纤维素酶制剂活力的测定方法

由绿色木霉EA₃-867所制备的纤维素酶制 剂是一种复合酶,除了纤维素酶外,还有半纤维 素酶、果胶酶等。而纤维素酶本身又是一种多 组分酶,一般认为它包括有C₁酶、Cx酶和fl- 葡萄糖普酶^[1-3] C₁酶能使天然纤维素降解成 直链纤维素,而Cx酶能使直链纤维素分解成纤 维二糖等较小单位,纤维二糖等再经β-葡萄糖 普酶作用,生成最终产物葡萄糖。     

木霉纤维素酶的诱导形成及其调节I.槐糖对木霉EA3-867纤维素酶形成的诱导作用

在槐豆荚提取液中分离到白色针状的槐糖结晶,该糖对拟康氏木霉(Trichoderma pseudo-Koningii Rafai) EA3-867的纤维素酶(C1和Cx)有强力的诱导作用。在纤维素酶活力,尤其是产酶速度上明显超过纤维素的诱导作用。槐糖的诱导作用与添加槐糖的时间和菌种有关,并受甘油强烈阻遏。在以纤维二糖(0．5％)为碳源培养时,木霉EA3-867也能较迅速地形成纤维素酶,但在EA3-867的甘油培养物中加入纤维二糖(5×10-3M)并不能诱导Cx酶。槐糖和纤维素对纤维素酶的诱导作用,无论在诱导胞外和胞内纤维素酶的成分上或从凝肢电泳图上,都十分相似。作者认为木霉EA,一867的纤维素酶形成同时受诱导一阻遏机制调节,并对组成型和诱导型的纤维素酶的作用,以及固体纤维素对纤维素酶可能的诱导机制作了推测。     

青霉的纤维素酶抗降解物阻遏突变株的选育

从土样中筛出一株生长快,产纤维素酶较高的斜卧青霉(Penicillium decumbens114-2)。能在全纤维素(hlocellulose)双层平板上形成清晰的透明圈。摇瓶培养的滤纸酶活可达8.8mg 葡萄糖/ml.h。 114-2菌株(其纤维素酶合成可为葡萄糖所阻遏)经UV和NG诱变处理后,在含葡萄糖的全纤维素平板上筛选到多株仍能形成明显透明圈的突变株。其中JN15和JU1在含葡萄糖的全纤维素液体培养基中,在残余葡萄糖浓度为 1％左右时,滤纸酶活可分别达到7.3 和13.9mg葡萄糖ml·h。这是出发株114-2和纤维素酶高产菌株木霉EA_3-867和QM9414所不能的。在不加阻遏剂的对比试验中,两个突变株的纤维素酶产量都比较高。其中,JU1的滤纸、CMC和棉花酶活分别达到33mg葡萄糖/ml·h,234mg葡萄糖/ml·h和86mg葡萄糖/ml·24h。     

Aspergllus usamii B_1及B_(1—12)果胶酶性质、组分和应用的比较研究

B_(1—12)是由Asp·usamii B_1经NTG、UV、LiCl复合处理选育到的一株呈黑色的孢子是适于液体培养的高酶活果胶酶菌株。具有发酵周期短、易过滤等痔点,酒樁沉淀的酶制剂与B_1比较,酶作用的最适pH分别为4.0和4.5,最适温度均力50℃,但在30℃时,B_1仍保持较高酶活水平的稳定性。B_(1—12)果胶酶组分ex—PG酶活高于B_1 0.5—1倍左右,endo—PG和PE变化不明显.两者都含有糖化酶、纤维素酶、蛋白酶、花青素酶等非果胶酶组分,其中糖化酶活性比B_1下降一倍.应用于苹果醋、苹果汁、草莓汁、樱桃汁的澄清.B_(1—12)优于B_1,透光率可达90%以上,但对枣汁的澄清效果却次于B_1。     

烟草叶肉原生质体再生壁形成中的呼吸途径研究

用EA_3~-867纤维素酶分离的烟草(Nicotiana tabacum)叶肉原生质体,在附加 EMP途径的抑制剂 NaF或 HMP途径的抑制剂 Na_3PO_4的NT培养基中进行液体浅层培养。用荧光增白剂 VBL染色荧光法和溶解氧电极极谱法分别研究EMP途径和 HMP途径对烟草叶肉原生质体壁的再生和氧的吸收的影响。结果表明,当EMP或HMP途径被抑制时,氧的吸收,壁的再生和细胞生长都受到抑制;当 EMP和 HMP途径同时被抑制时,上述过程的抑制更甚。初步认为,EMP途径和 HMP途径在壁的再生中同时存在,并且都起着重要作用。     

北美鹅掌楸原生质体的分离与培养

以鹅掌楸属植物北美鹅掌楸的悬浮细胞和组培苗叶片为材料,对北美鹅掌楸原生质体分离、纯化与培养条件进行研究.结果表明:叶片和悬浮细胞用含有0.1％2-吗啉乙磺酸(MES)和0.6 mol/L甘露醇的Cell ProtoplastWash(60M-CPW)溶液25℃预处理lh效果最好;悬浮细胞最佳酶解液为60M-CPW+ 1％纤维素酶+1％半纤维素酶+0.2％果胶酶Y-23+0.1％ MES,每克材料25℃酶解6h有效原生质体产量可以达到3×106个;叶片最佳酶解液为60M-CPW+2％纤维素酶+1％半纤维素酶+0.2％果胶酶Y-23+0.1％ MES,每克材料25℃酶解10 h有效原生质体产量可以达到11×106个;悬浮细胞原生质体易于培养,在KM8p+1.0 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA培养基中培养25 d可形成肉眼可见的愈伤组织.     

棉花根尖细胞的多核现象

除一些植物的毡绒层细胞中有时有2—4核外,每个植物体细胞一般都只有一个核。我们在棉花根尖细胞的观察中,发现了根尖具有二核或三核的细胞(图1—3)。所用材料为“辽棉六号”,待胚根长到1.5—2.5cm 时,切取根尖于卡诺液中固定22小时,铁矾苏木精整体染色后的根尖纵切成厚约0.3mm 的切片,于4%纤维素酶 4%果胶酶的水     

二百种植物叶片细胞机械分离试验

自从 Chayen 用果胶酶分离植物细胞以来,接着 Cocking 使用纤维素酶从植物细胞分离原生质体的研究。植物细胞以及原生质体培养已经应用于细胞工程技术领域。但是在植物细胞培养和植物学教学工作中,通常需要从植物组织中分离出一定数量活的     

二株高活力纤维素分解菌EA3-867和N2-78的获得及其特性的比较

拟康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii Rifai)野生型菌株AS 3．3002和木3,分别经多种物理化学因素(高能电子、60钴、紫外线、亚硝基胍、硫酸二乙酯等)诱变处理后,得到二株变异菌株EA3,-867和N2-78。它仉的固体曲、液体曲和酶制剂的各项纤维紊酶活力测定结果,均比野生型菌株明显提高。N2-78菌株经摇瓶培养60小时,其CMC糖化力为255毫克葡萄糖／毫升酶液,滤纸糖化力为8．2毫克葡萄糖／毫升酶液,棉花糖化力为13．4毫克葡萄糖／毫升酶液,分别比野生型菌株提高H．6倍、5．3倍和7倍。由EA3-867和N2-78的固体曲制取的纤维素酶粗制剂,其各项纤维紊酶话力测定结果,均较Onozuka R-10纤维索酶制剂为高。上述野生型菌株及变异菌株均具有果胶酶、半纤维紊酶、淀粉酶和少置蛋白酶的活力。变异菌株中果胶酶的活力较野生型菌株为高,淀粉酶和蛋白酶活力则较低。同时,变异菌株的形态也与原始菌株有明显差异。上述四株菌的孢子致死温度相同,CMC糖化、滤纸崩溃和滤纸糖化的最适pH相近,最适温度相同,分别为pH 4.4、60℃,pH4.8、60℃和pH4.8、60℃。     

麦长管蚜唾液中几种酶的鉴定、活力测定与功能分析

用Parafilm膜夹营养液法,以两种食料介质饲喂麦长管蚜Macrosiphum avenae 3龄若蚜并收集其唾液,对唾液中的酶类进行了鉴定、活力测定和功能分析。结果表明,在20%蔗糖介质提取液中,鉴定有果胶酶、多酚氧化酶和纤维素酶; 在水介质提取液中鉴定有纤维素酶; 两种介质提取液中都未鉴定出过氧化物酶。酶活力测定结果表明, 在20%蔗糖介质提取液中, 每30头蚜虫分泌的果胶酶、多酚氧化酶和纤维素酶的酶活力分别为2.59×10^-3 U/g、7×10^-3 U/g和7.89×10^-3 U/g; 在水介质提取液中,纤维素酶活力为3.68×10^-3 U/g。行为反应试验结果表明,果胶酶处理麦苗的挥发物组分能引起麦长管蚜寄生性天敌燕麦蚜茧蜂Aphidius avenae和捕食性天敌七星瓢虫Coccinella septempunctata 的嗅觉偏好反应,因此,果胶酶在麦长管蚜取食诱导小麦植株的间接防御反应中具有重要作用。     

生物酶法水解黑老虎烟叶提取致香成分的响应面法优化

以广昌晒红烟"黑老虎"烟叶为提取原料,建立了响应面优化法筛选复合酶配方及制备工艺。研究结果表明优化方案如下:复合纤维素水解酶1.75%、果胶酶PECTINEX 1.50%、蛋白酶Flavourzyme 1.50%、纤维素酶果胶酶时间2h、蛋白酶时间2h、温度40℃、pH3.8。通过响应面分析,获得了模型方程:Y1=11.12-0.17*X1+1.99*X2-3.31*X1*X1-2.30*X2*X2(X1:纤维素酶浓度;X2:pH),求得模型的极值点(纤维素酶浓度1.75%、pH3.8)时水解效果最佳(还原糖量为11.12mmol/L)。     

一株海洋微藻的鉴定及其原生质体制备条件优化

从烟台海滨水域分离出一株海洋单细胞微藻。通过形态学鉴定和18S r DNA基因序列分析确定该株真核微藻属于四爿藻属(Tetraselmis sp.),命名为138号藻种。利用Central Composite法的Box-Behnken实验设计优化了此藻株的原生质体备条件。获得了以原生质体制备率为目标函数的三元二次回归方程:Y_1=88. 30-0. 19X_1+2. 44X_2+2. 28X_3-0. 95X_1X_2-3. 13X_1X_3+3. 78X_2X_3-9. 85X_1~2-7. 95X_2~2-7. 22X_3~2。得到最优制备条件:混合酶比例纤维素酶∶果胶酶为5∶2;混合酶浓度为4. 5%(纤维素酶浓度为2. 7%,果胶酶浓度为1. 8%);缓冲液pH为6. 4,最高理论制备率81. 5%。经过3次平行试验,实际得到的原生质体制备率为80. 5%,与模型预测值的误差为1. 24%。绿色荧光蛋白报告基因瞬时表达检测了所制备原生质体的转化能力。