无机盐诱导鱼腥藻 595 (Anabaena sp.595)的细胞学效应

鱼腥藻595(Anabaena sp．595)在0．05mol／L钾、钠、铵的盐酸盐、硝酸盐、硫酸盐和磷酸盐的诱导下,2d后即出现显著的细胞学效应：细胞体积增大,明显液泡化;少数细胞发生横向和不均等分裂;藻丝片段化,异形胞分化率相对提高。其中,铵盐培养的藻丝细胞内出现特异的浓缩颗粒状区域。钙盐、镁盐也诱导类似细胞学变化,但作用较弱。在含0．1mol／L NaO的培养基中长期培养,细胞出现周期性分化行为,开始细胞膨大并液泡化,以后色素质重新充满细胞,液泡消失,然后细胞分裂至正常细胞大小,成为接近正常的藻丝,但接着又膨大液泡化,如此进入新的周期过程。     

重金属及微量元素诱导蓝藻形成液泡*

鱼腥藻595(Anabaena sp.595)、织线藻246(Plectonema boryanum 246)和伪枝藻248(Scynetonema hofmanni 248)在两种重金属汞、镉和两种微量元素铜、锌诱导下,藻丝细胞均能发生膨大、液泡化现象。不同重金属及微量元素对3种蓝藻液泡化诱导作用强弱程度不同。汞的诱导作用明显强于镉、铜和锌,0．1μmol／L汞可诱导3种蓝藻发生液泡化。采用压片法均观察到诱导形成的液泡,液泡在相差显微镜下显示为圆球形,基本透明。     

压片法检查蓝藻液泡

鱼腥藻7120（Anabaena sp.PCC7120）在含0.1mol/L NaCl的条件下培养4d,90％以上细胞液泡化。若在正常条件下培养,1个多月之后部分细胞开始液泡化,随着培养时间延长,液泡化细胞比例逐渐提高。液泡化藻丝材料在玻片上经手指轻轻施压,细胞破袭,液泡从细胞破裂处释出。所释放液泡完全透明,大小不等,可在相关显微镜下显示,个别液泡可弹至细胞外远外。无机盐诱导的液泡化和细胞衰老引起的液泡化之间具有明显的平行性。     

鱼腥藻SP.595液泡化原生质球诱导条件的研究

用浓度为0．15mol／L的KNO3、KCl、K2SO4、KH2PO4、K2HPO4、NaNO3、NaCl、Na2SO4、NaH2PO4、Na2HPO4、(NH4)2SO4、MgSO4、CaC12等单盐分别配合0．1％的溶菌酶处理鱼腥藻sp．595(Anabaenasp．595)。经4h,KH2PO4、K2SO4、Na2SO4、NaH2PO4、(NH4)2SO4、MgSO4、CaC12能诱导形成原生质球,但液泡化原生质球极少,而KNO3、NaNO3、NaC1诱导形成少量液泡化原生质球。用相近浓度的双盐,即KNO3和NaC1、KNO3和(NH4)2SO4、NaC1和(NH4)2SO4分别配合0．1％的溶菌酶处理,诱导效果亦不佳。用相近浓度的三盐NaC1、KNO3和(NH4)2SO4及五种盐NaC1、KNO3、(NH4)2SO4、Na2HPO4和KH2PO4分别配合0．1％的溶菌酶处理,诱导原生质球和液泡化原生质球的效果明显提高,液泡化原生质球比例达到66．90％—79．97％。     

无机盐诱导蓝藻细胞液泡化

选用NaCl、KNO3、(NH4)2SO4、MgSO4、CaCl2五种常用无机盐对分属三科的六种蓝藻进行液泡化诱导,不同蓝藻其盐敏感性不同。鱼腥藻sp.595最为敏感,五种盐均诱导其液泡化;颤藻284和极大螺旋藻438最不敏感,所试验盐类均不能诱导其液光化;念珠藻sp.96、织线藻246和伪枝藻248液泡化程度居中,少数盐类如NaC1、KNO3、(NH4)2SO4对其有诱导作用。采用压片法观察到诱导形成的液泡,液泡在相差显微镜下显示为圆球形,基本透明。     

青霉素处理检查和分离蓝藻细胞液泡

蓝藻是否有液泡一直是一个悬而未决的问题 [1,2 ] 。近年来 ,郭厚良等在原生质球研究中[3 ,4] 发现一些无机盐能诱导某些蓝藻细胞形成液泡[5] ,随后又发现细胞液泡 [6] ,并通过原生质球途径实现了无机盐诱导液泡的分离[7] 。应当说 ,细胞液泡较之无机盐诱导分化形成的液泡具有更大的重要性。但在细胞液泡方面尚有诸多问题不够明确 ,如细胞液泡的分化频率 ,细胞液泡存在的普通性以及如何分离细胞液泡等。为此 ,我们进行了青霉素细胞检查和分离蓝藻细胞液泡的试验。1　材料和方法1 .1　藻种及培养研究使用了 3种蓝藻 ,鱼腥藻 71 2 0、发状念珠…     

鱼腥藻PCC7120细胞液泡的初步研究

从保存３个月以上的老化培养物中直接检查到游离液泡。液泡为标准圆球状,完全透明,大小相差极为悬殊,多数大型液泡吞噬了数个衰老藻细胞。采用低渗酶解,渗透冲击,低渗酶解和渗透冲击相结合从培养３个月以上,２个月,１个月,１８ｄ,１０ｄ及２ｄ的藻丝细胞都分离到液泡。液泡略大于细胞,泡内无吞噬物。培养３ｄ的藻丝有１５％的细胞分离到液泡。其他多种蓝藻也分离到同样的液泡。     

花药培养过程栽培稻花粉不育杂种F1与亲本台中65的细胞学研究

利用活体压片、半薄及超薄切片技术,对栽培稻(Oryza sativa L.)花粉不育杂种F1及育性正常的亲本台中65离体培养前后的小孢子及花药壁进行细胞学研究.结果表明:与台中65相比,杂种F1的花粉小孢子在发育至单核中-晚期,出现比例较高的胞质凝聚小孢子和少量星型小孢子,正常小孢子和淀粉化小孢子比例降低.在离体条件下,胞质凝聚小孢子、星型小孢子、正常小孢子、液泡化小孢子、淀粉化小孢子的发育主要沿着胞质凝聚败育过程、孢子体发育过程、配子体发育过程、液泡化过程和淀粉化过程进行;药壁组织在离体条件下,杂种F1比台中65的绒毡层降解速度快,中层膨大程度高.杂种F1与台中65在离体培养下小孢子发育及药壁细胞学的差异主要是受到S-a座位内等位基因互作及离体培养环境的影响.     

愈伤组织形成过程中钙离子与激素诱导效应的关系

实验研究了在胡萝卜、烟草愈伤组织形成过程中,激素诱导作用与钙离子的关系。结果表明:在含有正常浓度的激素和Ca~(2+)的培养基中,0.1—1mmol/L Ca~(2+)螯合剂EGTA抑制愈伤组织鲜重增长78.0%—88.4%; 10—50μmol/L尼群地平及10—60μmol/L异博定等细胞膜钙通道阻断剂分别抑制愈伤组织鲜重增长19.1%—81.9%及17.6%—70.3%。除去上述Ca~(2+)螯合剂及Ca~(2+)通道阻断剂后,受抑制的外植体基本上可恢复生长。在无激素培养基中,10—30μmol/L Ca~(2+)载体A_(23187)可使外植体膨大,使外植体脱分化细胞增多,并出现分生细胞团,初步说明A_(23187)诱导的Ca~(2+)内流可以部分地模拟激素的作用。以膜显示剂氯四环素探测胞内Ca~(2+)分布时发现分裂细胞、脱分化细胞、分生细胞团及愈伤组织区域的细胞荧光较强。以上事实说明在愈伤组织形成中激素诱导效应与细胞内Ca~(2+)有密切关系。     

培养条件下发菜的形态建成

固体培养基培养的发菜(Nostoc flagelliforme)在黑暗与低光强(2·s)条件下细胞发育受到抑制,在光强10、20、30、60 μmol/m2·s 条件下细胞生长良好, 但在60 μmol/m2·s 条件下藻丝体易变黄; 液体充气培养的发菜在光强20、60、180 μmol/m2·s 条件下生长速率、类胡萝卜素与多糖含量均随光强升高而增加。发菜在低营养水平时形成的异形胞较多, 异形胞的发生位置也多样, 有端生、间生和连生。当琼脂浓度为0.5%—4%时发菜具有相同的形态发育特征, 从藻殖段发育至丝状聚集体状态, 再从聚集体中释放藻丝; 当琼脂浓度为6%—8%时发菜发育至丝状聚集体状态, 藻丝包裹在厚胶鞘中, 观察不到藻丝和藻殖段的释放。以上结果表明光照和培养基的含水量对发菜细胞发育具有重要影响。       

Plant Regeneration from Protoplasts of Coriandrum sativum

Calli produced from stem segments of seedling of Coriandrum satwum which were cultured on MS agar medium containing NAA 1.0mg/L. The embryogenic cell colony suspension was estabilished on MS liquid medium containing NAA 1.0mg/L%2,4-D 0.2mg/L+BA 0.5 mg/L. The cell suspension culture was used for protoplast preparation. Protoplasts were obtained in the enzyme mixture containing 2.0% Onozuka R-10, 1.0% pectinase, 0.5% snailase, 0.5% dextran sulfate potassium Salt, 0.6mol/L mannital CPW solution at pH 5.8 and 25℃. Cultured in a KM8P liquid medium containing NAA 1.0mg/L+2,4-D 0.2mg/L+6-BA 0.5 mg/L, glucose 0.4mol/L and CM 20mi/L; the protoplasts entered the stage of derision after three days, cell clusters formed in 10 days and calli formed after about 50 days. When the calli were transferred to MS agar medium containing many growth substances, they differentiated into embryoids, and then developed into plantlet with many green leaves and roots on the 1/2 MS agar medium.     

Plant Regeneration from Cell Supension Derived Protoplasts of Heracleum moellendorffii

Heracleum moellendorffiz Hance is a herb belonging to Umbelliferae used in traditional medicine in China. The young stem-nodes were induced for callus formation on MS medium containing 1 mg/L 2,4-D. After subcultured for about five months, the embryogenic calli were used for cell suspension culture. The protoplasts were prepared from this suspension by digestion with enzyme mixture containing 1. 5% cellulase Onozuka R-10 +0. 3% macerozyme R-10 + 0. 5% snailase + 5 mmol CaCl2 + 0. 6 mol/L mannitol, at pH 5.8, and cultured in modified MS and modified N6 media with 0.3 % agarose. They divided after 3 days and developed into small cell colonies after about 2 weeks. From this time on, the glucose concentration in the culture media was decreased to 0. 2 mol/L,which led to futher growth of the colonies to small calf . After a period of proliferation on solid medium with 0. 5 mg/L 2,4-D, the calli were transferred to a medium with 0. 1 mg/L zeatin on which somatic embryos differentiated and developed to plantlets     

锰作用下PC12细胞的氧化应激机制研究

目的：以鼠嗜铬神经瘤细胞（PC12）为模型,筛选锰对神经细胞增殖抑制作用的时间及剂量,观察锰作用下PC12细胞的氧化应激反应与细胞形态学、生化指标改变和丝裂原活化蛋白激酶pp38（p38MAPKs）的活化表达。方法：用200,400,600,800μmol/LMnCl2的培养液,分别作用对数生长期PC12细胞1,2,3,4d后,用MTT筛选锰的细胞毒性剂量;测定200-600μmol/L MnCl2作用4d后,PC12细胞还原型谷胱甘肽和丙二醛含量;透射电镜观察细胞形态学变化;琼脂糖凝胶电泳检测MnCl2对PC12细胞基因组DNA的影响。western-blot法检测p-p38。结果：MTT实验显示200~800μmol/LMnCl2作用1,2,3,4d对PC12有显著的抑制作用,呈剂量和时间依赖趋势,600μmol/LMnCl2作用4d对PC12的抑制率可达50%以上。200-600μmol/LMnCl2作用于细胞4d后,随着浓度的升高,还原型GSH逐渐降低,MDA的含量逐渐升高;600μmol/LMnCl2作用4d电镜可见细胞凋亡,同样条件下细胞DNA碎片化。Western-blot实验显示600μmol/LMnCl2作用1,2,3,4dp-p38逐渐升高,3d时较对照组增加6.6倍（n=3,p〈0.05）,200,400,600μmol/L MnCl2作用4d时,磷酸化蛋白38（p-p38）也逐渐升高,400μmol/L MnCl2作用4d时较对照组升高了4.7倍（n=3,p〈0.05）。结论：PC12细胞在锰作用下发生氧化应激反应,上调p-p38,诱导细胞凋亡,细胞增殖抑制。     

百合鳞片的诱导分化及遗传转化效率分析

基因工程是改良百合性状的重要手段,建立高效稳定的遗传转化体系是百合转基因研究的基础。以百合地下茎鳞片为外植体,筛选并优化百合的直接和间接再生体系;把含枸杞GR(Glutathione reductase)基因和筛选基因NPTII的载体,利用农杆菌转化法对鳞片和愈伤组织进行转基因操作,采用正交试验,优化转化条件以建立适合不同受体的遗传转化体系。结果表明,各阶段最优培养条件分别为:鳞片诱导和膨大MS+2mg/L 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)+0.1mg/L NAA(萘乙酸)+ 90g/L蔗糖;鳞片直接分化MS+1.0mg/L 6-BA(6-苄氨基嘌呤)+0.2mg/L NAA+ 30g/L蔗糖,间接分化MS+2.5mg/L 2,4-D +0.4mg/L TDZ(噻重氮苯基脲)+60g/L蔗糖;百合鳞片的Kana(卡那霉素)选择压为100mg/L,愈伤组织75mg/L。遗传转化体系条件为:鳞片,农杆菌OD₆₀₀=0.6,预培养3d,侵染40min,As(乙酰丁香酮)200μmol/L,阳性植株转化率为17.50%;鳞片分化愈伤组织,农杆菌OD₆₀₀,预培养5d,侵染40min,As 200μmol/L,阳性植株转化率为12.60%。     

甘蓝型油菜花粉离体培养

通过对甘蓝型油菜花粉发育阶段和活力的检测确定花粉发育的时期,分离出单核晚期花粉进行离体培养.结果表明,(1)筛选出适合油菜小孢子花粉离体培养的液体培养基为T_1+怀特维生素(White's vitamins)+2%椰子汁+0.5 mol/L麦芽糖,在此培养基上花粉的成熟率可达25.1%,萌发率达6.3%.(2)筛选出适合成熟花粉离体萌发液体培养基为0.6 mol/L麦芽糖+1.6 mmol/L硼酸+2.9 mmol/L硝酸钙+29.6 μmol/L VB_1,在此培养基上,自然成熟花粉的萌发率可达75.2%.将离体培养成熟的花粉培养在萌发培养基,萌发的花粉占成熟花粉的66.3%.     

青花菜与白菜间体细胞杂种获得与遗传特性鉴定

为获得芸薹属白菜Brassica campestris与青花菜Brassica oleracea var. botrytis的种间体细胞杂交体,以青花菜和白菜的子叶与下胚轴为材料,分离制备原生质体,用40％聚乙二醇 (Polyethylene glycol,PEG) 进行原生质体融合。融合细胞在以0.3 mol/L 蔗糖、0.3 mol/L葡萄糖为渗透稳定剂,附加0.2 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-苄氨基嘌呤 (6-BA) +0.1 mg/L 1-萘乙酸 (NAA) +0.1 mg/L激动素 (Kinetin,Kin) 的改良K8p培养基中液体浅层培养。将包埋于0.1％琼脂糖的8~10个细胞期的细胞在添加0.3 mol/L蔗糖和2 mg/L 6-BA+2 mg/L玉米素 (Zeatin,ZEA) +1 mg/L NAA+0.5 mg/L Kin的Kao培养基中诱导愈伤组织。愈伤组织转到MS+5 mg/L ZEA+2 mg/L IAA诱导不定芽。将长1～2 cm的不定芽转到1/2 MS+0.2 mg/L NAA诱导生根。将生根的植株转移到花盆,并对其杂种性质进行形态学、细胞学和分子生物学鉴定。结果表明,融合细胞培养2～7 d后发生第1次分裂,培养35 d后植板率为0.66％,不定芽再生率达3.7％。形态学观察显示,绝大多数再生植株的叶面积较大,株型和叶型为两种杂交亲本的中间型。染色体计数结果显示,再生植株染色体数目为2n=38。流式细胞仪测定DNA含量显示,再生植株DNA含量是亲本之和。随机扩增多态性DNA (Random amplified polymorphic DNA,RAPD) 和基因组原位杂交 (Genomic in situ hybridization,GISH) 分析结果证明再生植株具有双亲基因组。体细胞杂种花粉育性比较低,杂交、回交后其育性逐渐获得恢复。     

甘蓝型油菜与芝麻菜体的细胞杂交

为拓宽油菜育种的基因资源库, 改良油菜品种, 以甘蓝型油菜(Brassica napus)花油3号下胚轴和芝麻菜(Eruca sativa)下胚轴为材料分离制备原生质体; 然后采用PEG-高Ca2+-高pH法进行原生质体融合, 当PEG浓度为35%, 原生质体融合密度为5×105个/mL时, 融合25 min时, 融合率可达18.2%。融合后在培养密度为1×105个/mL时, 以附加1.0 mg/L 2,4-D +0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+ 200 mg/L肌醇+300 mg/L水解酪蛋白的改良的KM8p为融合体培养基, 以0.1 mol/L 蔗糖+0.2 mol/L葡萄糖+0.2 mol/L甘露醇作渗透稳定剂进行液体浅层培养, 效果较好, 愈伤组织再生率最高为6.8%。将融合体再生的小愈伤组织转移至培养基(B5无机盐+0.087 mol/L蔗糖+0.2 mg/L 2, 4-D+0.5 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+ 0.5% Agar, pH 5.8)上增殖培养, 待愈伤组织长至直径为3~5 mm时, 及时将其转至分化培养基(MS无机盐+0.087 mol/L 蔗糖+0.1 mg/L IAA+0.8 mg/L 6-BA+0.8% Agar, pH 5.8)中诱导不定芽再生, 芽分化率为35.7%。当不定芽长为2~3 cm时, 将其切下转入附加0.5 mg/L IBA+0.2 mg/L 6-BA的1/2MS生根培养基中诱导生根, 14 d左右即可形成再生植株, 生根率可达88%。同时, 以紫外线(60 μW/cm2)照射芝麻菜原生质体, 进行不对称融合, 照射2 min的获得了愈伤组织和再生植株, 照射4 min的只获得愈伤组织, 而照射5 min以上的没有获得愈伤组织, 但其愈伤组织再生、增殖及植株再生均不如对称融合。从细胞学鉴定的21块杂种愈伤组织上再生出16株杂种植株。     

甘蓝型油菜与芝麻菜体的细胞杂交

为拓宽油菜育种的基因资源库, 改良油菜品种, 以甘蓝型油菜(Brassica napus)花油3号下胚轴和芝麻菜(Eruca sativa)下胚轴为材料分离制备原生质体; 然后采用PEG-高Ca2+-高pH法进行原生质体融合, 当PEG浓度为35%, 原生质体融合密度为5×105个/mL时, 融合25 min时, 融合率可达18.2%。融合后在培养密度为1×105个/mL时, 以附加1.0 mg/L 2,4-D +0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+ 200 mg/L肌醇+300 mg/L水解酪蛋白的改良的KM8p为融合体培养基, 以0.1 mol/L 蔗糖+0.2 mol/L葡萄糖+0.2 mol/L甘露醇作渗透稳定剂进行液体浅层培养, 效果较好, 愈伤组织再生率最高为6.8%。将融合体再生的小愈伤组织转移至培养基(B5无机盐+0.087 mol/L蔗糖+0.2 mg/L 2, 4-D+0.5 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+ 0.5% Agar, pH 5.8)上增殖培养, 待愈伤组织长至直径为3~5 mm时, 及时将其转至分化培养基(MS无机盐+0.087 mol/L 蔗糖+0.1 mg/L IAA+0.8 mg/L 6-BA+0.8% Agar, pH 5.8)中诱导不定芽再生, 芽分化率为35.7%。当不定芽长为2~3 cm时, 将其切下转入附加0.5 mg/L IBA+0.2 mg/L 6-BA的1/2MS生根培养基中诱导生根, 14 d左右即可形成再生植株, 生根率可达88%。同时, 以紫外线(60 μW/cm2)照射芝麻菜原生质体, 进行不对称融合, 照射2 min的获得了愈伤组织和再生植株, 照射4 min的只获得愈伤组织, 而照射5 min以上的没有获得愈伤组织, 但其愈伤组织再生、增殖及植株再生均不如对称融合。从细胞学鉴定的21块杂种愈伤组织上再生出16株杂种植株。     

TFP刺激裂殖酵母细胞钙离子内流的质膜效应*

ＴＦＰ（１０－１００μｍｏｌ／Ｌ）可引起裂殖酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）胞外Ｃａ２＋内流,ＴＦＰ浓度不同,促进Ｃａ２＋内流程度也不一样,５０μｍｏｌ／ＬＴＦＰ的促进作用最大。并且ＴＦＰ浓度越大,Ｃａ２＋内流出现峰值也越早,１０、２０、５０、１００μｍｏｌ／ＬＴＦＰ处理后,胞内总钙出现峰值时间分别为４５、４５、３０、１５分钟。胞外Ｈ＋浓度也会对ＴＦＰ引起的Ｃａ２＋内流产生不同影响,缓冲液的ｐＨ值为６．０时最有利于ＴＦＰ引起胞内Ｃａ２＋含量增加,碱性条件下ＴＦＰ的效果最不明显。由ＴＦＰ引起的Ｃａ２＋内流增加要比单一地增加外钙浓度效果好得多,ＴＦＰ在１０μｍｏｌ／Ｌ浓度的外钙条件下引起的胞内钙含量数值比１０００μｍｏｌ／Ｌ的外钙条件而无ＴＦＰＴ所引起的胞内钙含量还要高５３．９％。缓冲液中加入０．８％的钙离子通道阻断剂ＬａＣ１３或溶液中无葡萄糖的存在,ＴＦＰ的促进作用消失,说明ＴＦＰ促进Ｃａ２＋内流是通过钙离子通道来完成的并需要能量参与。