FISH在人类未受精卵染色体异常分析中的应用

分子细胞遗传学的主要技术代表———荧光原位杂交 (FISH)是用荧光标记的依靠探针杂交原理在细胞核中或染色体上显示某一特定核酸序列的位置 ,并可进行相对定量分析 .它广泛应用于遗传病的诊断、产前诊断、肿瘤遗传学、进化遗传学研究和基因定位等领域 ,随着辅助生殖技术的进展 ,将在植入前胚胎遗传学诊断 (PGD)、生殖细胞 (卵母细胞和精子 )染色体异常的研究方面发挥更大的用途 .它是联系分子遗传学和细胞遗传学之间的桥梁 .     

中国无精症、严重寡精症患者的染色体异常和Y染色体微缺失

染色体异常和Y染色体微缺失被认为是两个白种人群中常见的生精障碍相关遗传因素。为了解中国无精症、严重寡精症患者中的染色体异常和Y染色体微缺失,运用染色体G显带技术,在358个原发无精症（256人）和严重寡精症（102人）不育患者中进行染色体核型分析;同时运用多重PCR技术,在核型正常的患者和100个正常生育男性中,对Y染色体AZF区微缺失进行筛查。在358个患者中,39人（10．9％）发现有染色体异常,Klinefelter（47,XYY）最为常见。无精症患者性染色体异常频率明显高于严重寡精症患者（12．1％VS1％）。在319个核型正常的患者中,46（14．4％）发现有AZF区微缺失,无精症和寡精症患者中Y染色体微缺失频率分别为15％和13．1％,AZFc区的微缺失最为常见,AZFa区的微缺失只见于无精症患者,正常生育男性中未发现AZF区的微缺失。结果显示,在中国无精症、严重寡精症患者中,大约25％的患者有染色体异常或Y染色体AZF区微缺失,提示这两种遗传异常是中国人群生精障碍的重要相关遗传病因,有必要在男性不育的诊断以及利用细胞浆内精子注射技术进行辅助生育时,对患者的这些遗传异常进行筛查。     

无精子症和严重少精子症患者Y染色体微缺失研究

目的：研究Y染色体微缺失与男性不育的关系。方法：采用多重PCR技术,研究正常男性、无精子症和严重少精子症男性不育患者Y染色体无精子因子（AZF）区域3个序列标志位点（STS）的缺失情况。结果：在93例无精子症或严重少精子症患者中,15例有Y染色体微缺失,缺失率为16%。其中,42例无精子症患者中,6例为AZFc区SY255位点缺失,2例为AZFb区SY134位点缺失;51例严重少精子症患者中,7例为AZFc区SY255位点缺失。40例正常男性无Y染色体微缺失。结论：多重PCR技术是简便而有效的对男性不育患者进行Y染色体微缺失筛查的方法;Y染色体微缺失是造成男性不育的一个重要原因,对男性不育患者进行辅助生育技术治疗前应常规进行Y染色体微缺失的检测。     

植物荧光原位杂交技术的发展及其在植物基因组分析中的应用

荧光原位杂交(FISH)是在染色体、间期核和DNA纤维上定位特定DNA序列的一种有效而精确的分子细胞遗传学方法。20年来,植物荧光原位杂交技术发展迅速:以增加检测的靶位数为目的,发展了双色FISH、多色FISH和多探针FISH鸡尾酒技术;为增加很小染色体目标的检测灵敏度,发展了BAC-FISH和酪胺信号放大FISH(TSA-FISH)等技术;以提高相邻杂交信号的空间分辨力为主要目的,发展了高分辨的粗线期染色体FISH、间期核FISH、DNA纤维FISH和超伸展的流式分拣植物染色体FISH技术。在植物基因组分析中,FISH技术发挥了不可替代的重要作用,它可用于:物理定位DNA序列,并为染色体的识别提供有效的标记;对相同DNA序列进行比较物理定位,探讨植物基因组的进化;构建植物基因组的物理图谱;揭示特定染色体区域的DNA分子组织;分析间期核中染色质的组织和细胞周期中染色体的动态变化;鉴定植物转基因。     

Y染色体单倍群与西南地区男性生精障碍的相关性

男性不育中, 原发无精、少精是最为重要的因素之一, 核型异常和无精子症因子(Azoospermia factor, AZF)微缺失能解释部分原发无精、少精的原因, 然而还有许多致病因素尚不清楚。Y染色体作为男性特有的染色体, 与男性生殖系统的正常功能密切相关。文章主要对Y染色体单倍群这一分子遗传背景与男性原发无精、严重少精症之间是否存在相关性进行探讨, 为进一步探索原发无精、严重少精症的遗传学致病原因提供依据和可行的方向。采集265名生精障碍患者(原发无精症患者193名, 原发严重少精症患者72名)以及193名正常男性样本的外周血, 进行核型分析和AZF缺失分析, 以排除有此两类异常的样本。将经过筛选的样本进行Y染色体单倍群分析, 并对其单倍群分布情况进行统计分析。分析显示, 生精障碍组和对照组分别在D1*、F*、K*、N1*和O3* 上有显著性差异(P=0.032, 0.022, 0.009, 0.009, 0.017, <0.05)。Y染色体单倍群, 这一Y染色体遗传背景与男性原发生精障碍的发生有相关性。     

荧光原位杂交技术及其应用

荧光原位杂交技术(FISH)始于70年代后期,曾多用于染色体异常的研究,近年来随着FISH所应用的探针种类的不断增多,特别是全Cosmid探针及染色体原位抑制杂交技术的出现,使FISH技术不仅在细胞遗传学方面,而且还广泛应用于肿瘤学研究,如基因诊断、基因定位等。本文对FISH探针标记、信号处理等有关技术特点以及在细胞遗传学研究、基因图谱绘制、基因扩增检测等方面的应用做了具体的 综述。     

非梗阻性无精子症的遗传学基础及研究进展

非梗阻性无精子症(non-obstructive azoospermia,NOA)是导致男性不育的重要原因,影响着约0.6%的男性或10%的不育男性.NOA是一种由多因素引起的具有高度遗传异质性和表型异质性的复杂疾病,其中遗传学病因包括染色体异常、Y染色体微缺失、基因突变以及表观遗传修饰等.目前临床上针对NOA患者的遗传学检测,还仅限于结合附睾和睾丸穿刺活检的核型分析及Y染色体微缺失检测,而且一直缺乏理想的治疗方案.因此,深入解析NOA的具体分子机理,对阐明NOA的病因、提高男性不育的临床诊断和治疗具有重要意义.本综述将从NOA的遗传学基础、NOA的病理特征、临床诊断及治疗等方面进行系统的探讨.     

男性不育与Y染色体

目的：观察精子数目异常与小Y染色体及内分泌性腺激素水平。方法：对262名少精及无精症患者检测染色体,并对其中11例小Y染色体及随机抽取的15例Y染色体正常的患者运用磁性分离酶免疫测定法分别检测性腺激素。结果：小Y染色体检出率为4.19％（11／262）,其内分泌性腺激素均呈高卵泡刺激素、高黄体生成素和低睾酮水平,与Y染色体正常的无精及少精症患者相比较．差异有显著性（P〈0．05）。而小Y染色体不同精子数组各内分泌性腺激素比较,差异无显著性（P〉0．05）。结论：精子数目畀常可能与小Y染色体有关,小Y染色体基因改变可能是导致其内分泌性腺激素的变化因素。     

用双色荧光愿位杂交和PCR技术鉴定无精症患者标记染色体的来源

用双色荧光愿位杂交和PCR技术鉴定无精症患者标记染色体的来源@傅俊江$中南大学湘雅医学院人类生殖工程研究室!　湖南长沙410078 @李麓芸$中南大学湘雅医学院人类生殖工程研究室!　湖南长沙410078 @卢光琇$中南大学湘雅医学院人类生殖工程研究室!　湖南长沙410078     

运用FISH技术将SSR标志定位于染色体上的研究

目的:运用FISH将SSR标记定位于染色体上,并确定其具体属于哪条染色体.方法:从全基因组测序数据库中挑选SSR标记,再将该序列到Fosmid库中进行序列比对,得到末端序列与SSR序列相同的Fosmid,再利用该Fosmid制作荧光原位杂交的探针,将该探针运用FISH技术杂交到染色体上,同时结合Tpy1,Tpy3序列识别其具体位于哪条染色体上.结果:在荧光显微镜下可以直接观察到探针在染色体上的结合位点,利用相关拍摄软件就可以对其进行拍照.本实验得到了较好的FISH杂交图片,并结合Tpy1,Tpy3成功的将其定于黄瓜五号染色体上.结论:FISH技术可以让人直接观察到探针在染色体上的位置,运用此方法能将可用于进行分子遗传图谱整合的SSR标记准确定位于染色体上.本研究中,在Tpy1,Tpy3探针的帮助下,我们更直接确认了该标记位于黄瓜的第五号染色体上.这使该标记对黄瓜分子辅助育种与黄瓜分子遗传图谱的整合,可以提供直接而有用的帮助.     

多荧光标记引物增强甘蔗染色体寡聚核苷酸探针杂交信号

荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization, FISH）是植物分子细胞遗传学研究最为重要的手段之一。近些年，基于参考基因组设计的低拷贝寡聚核苷酸探针在FISH中应用得越来越广泛。然而，由于植物基因组中分布大量的重复序列，这使得oligo-FISH的分辨率存在一定局限性。利用包含多个荧光基团的荧光PCR引物，扩增出甘蔗染色体特异oligo探针，并进一步优化甘蔗的荧光原位杂交体系，提高了甘蔗oligo探针识别近缘物种染色体的效率。通过开发多荧光标记的甘蔗oligo探针以及甘蔗荧光杂交体系的优化，有效拓宽荧光信号的最小分辨率，提高信噪比（signal-to-noise ratio, SNR），并成功基于甘蔗oligo探针对高粱1-10号染色体分型。多荧光标记引物增强oligo探针信号的新方法及FISH体系的优化为今后在其他物种中提高oligo-FISH鉴定染色体及捕捉微弱的荧光信号提供了参考。     

一例特殊inv(Y)形成机理的研究

应用双色荧光原位杂交的方法,国内首次报道一例特殊inv(Y)异常的性质,探讨Y染色体倒位结构异常的形成机理以及与习惯性流产临床表型的关系。应用 Biotin-11-dUTP标记的Y染色体短臂断裂点Yp11.3探针（编号889）和CY3标记的Y染色体长臂断裂点Yq12远端异染色质区探针(编号PY3.4),对1例G显带核型分析为[46, XY(90%) / 46, X, inv(Y)(p11.3;q12)]的平衡易位携带者进行双色荧光原位杂交研究。双色FISH结果显示,该易位携带者异常核型比例为22%,稍高于G显带分析中确定的比例。而且,除G显带检测出的倒位类型外,又有两种类型的倒位,其中涉及到常规显带技术难以检测出的染色单体型倒位。3种倒位类型的存在说明该患者inv(Y)断裂点呈不均一性。FISH技术是一种能准确可靠检测出染色体倒位形成的重要手段。      

引物原位标记技术快速检测人类染色体非整倍性

染色体数目异常是人类染色体疾病的重要类型, 经常导致胚胎丢失、胎儿流产、婴儿死亡、先天畸形和神经发育异常等出生缺陷。文章应用引物原位标记(Primed in situ labeling, PRINS)技术快速检测人类染色体非整倍性, 率先采用更新的非ddNTP阻断的多色PRINS技术, 对人类外周血淋巴细胞和精子等多种样本进行标记; 然后对不同靶标序列的标记效率及不同荧光色素的发光特点通过实验进行评估, 获得关于PRINS技术的多项反应原理参数, 并筛选标记顺序以获得均一稳定的标记效果, 最后进行临床FISH探针与PRINS的标记比较实验。通过实验比较PRINS技术与传统FISH技术之间的标记特点与差别, 评估PRINS的实际应用效果。在2.5 h内标记了同一精子核内的多条染色体, 单色以上标记达到99％。同时在人类外周血淋巴细胞中也得到较好的标记效果。与FISH技术相比, PRINS的这些优点使得它成为诊断染色体非整倍性变异的首选技术。     

脆性X综合征的基因诊断与产前诊断

为了探讨简便、快速、准确、价廉的脆性X综合征的诊断方法,对6个智能低下家系进行了细胞遗传学检查,以及PCR直接扩增FMR1 5^'端(CGG)_{n<\sub>重复序列、RT-PCR扩增FMR1基因的cDNA序列的分子遗传学检查。A家系先证者脆性X染色体高表达（35/273）,分子遗传学检查证实为脆性X综合征全突变患者;B家系先证者及其母亲无脆性X染色体表达,分子遗传学检查证实为非脆性X综合征患者;C家系的男性胎儿脆性X染色体表达（5/93）,先证者及其母亲未发现脆性X染色体,分子遗传学检查证实男性胎儿为脆性X综合征全突变患者,其母亲为前突变携带者,哥哥为嵌合体患者;D家系先证者脆性X染色体高表达17%,其姐姐脆性X染色体5%,分子遗传学检查证实先证者为脆性X综合征全突变患者,其姐姐为嵌合体患者;E家系先证者及其母亲,F家系先证者发现可疑脆性X染色体,分子遗传学检查证实为非脆性X综合征家系。结论： PCR直接扩增FMR1基因(CGG)n<\sub>重复序列联合RT-PCR扩增FMR1基因cDNA 序列简便、快速、价廉。可用于脆性X综合征的筛查、诊断及产前诊断,有推广应用价值。}     

FISH技术的临床应用研究

荧光原位杂交（FISH）是染色体显带技术的补充和发展,以人类精子,早期胚胎等间期核及中期染色体为材料,用FISH技术检测染色体的数目异常和微小的结构异常。结果快速准确,显示它较之传统的细胞遗传学技术诊断具有明显的优越性,在临床应用中有广泛的前景。     

无精和严重少精症患者的遗传缺陷分析——-附2例世界首报染色体异常核型

对217例无精和严重少精症患者外周血淋巴细胞染色体核型进行分析,并采用聚合酶链反应对7例Y染色体结构异常患者的AZFc区进行检测。发现187例无精症患者中检出异常核型77例（41.18%）（其中46,XY,t(6;14)(p21;p13),46,XY,t(8;12)(p21;q24)为世界首报核型）,主要涉及染色体异常（数目异常和结构异常）;染色体异态（Y染色体异态和9号染色体臂间倒位）及46,XX性反转;30例严重少精症患者中检出异常核型4例（13.33%）（结构异常和46,XX性反转）。由此可见,性染色体数目和结构异常是精子发生障碍的主要原因,其次常染色体的某些断裂点也可能影响精子发生。AZFc区的缺失与否与精子发生也有直接关系。     

大鼠Y染色体探针的制备与鉴定

目的:研究制备地高辛标记的大鼠性别决定基因Y区(Y染色体,SRY)探针,用于检测雄性大鼠来源的细胞在雌性受鼠体内的SRY基因表达情况.方法:按已知的雄性大鼠Y染色体上性别决定基因(SRY)的序列,请上海博亚公司合成oligoDNA,采用PCR技术连接并扩增,地高辛标记的方法制备基因探针.以雌性大鼠为对照,原位杂交法检测大鼠肾组织切片Y染色体阳性细胞情况.结果:用原位杂交法证实在雄性大鼠肾脏内有SRY表达,而雌性大鼠肾脏无Y染色体阳性细胞,证实这种探针具有较高的敏感性和特异性.结论:大鼠性别决定基因SRY探针的制备成功,为进一步研究异体雄性大鼠细胞移植后的分布和表达提供了实验基础.     

男性不育与Y染色体

目的:观察精子数目异常与小Y染色体及内分泌性腺激素水平。方法:对262名少精及无精症患者检测染色体,并对其中11例小Y染色体及随机抽取的15例Y染色体正常的患者运用磁性分离酶免疫测定法分别检测性腺激素。结果:小Y染色体检出率为4.19%(11/262),其内分泌性腺激素均呈高卵泡刺激素、高黄体生成素和低睾酮水平,与Y染色体正常的无精及少精症患者相比较,差异有显著性(P<0.05)。而小Y染色体不同精子数组各内分泌性腺激素比较,差异无显著性(P>0.05)。结论:精子数目异常可能与小Y染色体有关,小Y染色体基因改变可能是导致其内分泌性腺激素的变化因素。     

优生与遗传咨询的临床研究

总结本室优生遗传咨询门诊万例病例资料,应用细胞学方法、荧光原位杂交法和分子遗传学PCR方法检出外周血染色体异常率10.30%（555/5390）,产前诊断核型异常率为6.68%（145/2171）,胎停育绒毛核型异常率45.16%（28/62）,总检出率为9.55%;PCR检测178例,正常人155例,患者23例;FISH结果：性别Y检测5例,21-三体征检测6例,均阳性。传统细胞学方法为染色体病诊断不可替代的重要手段;分子遗传学PCR方法及FISH检测方便、快速、精确,值得推广;遗传咨询,遗传病检测及产前诊断,对降低患儿出生率具有重大意义。 Clinical Research of Genetic Counseling WANG Shu-yu,WANG Su-gui,REN Guo-qing,JIA Chan-wei,MA Yan-min,XUE Hong Capital Medical University Beijing OB/GYN Hospital,Beijing 100006,China Abstract:To supply reliable materials for the assessment of recurrence risk,prenatal diagnosis and the supervision of high risk persons,we analyzed 10811 patients with the methods of cytogenetics,fluorescent in situ hybridization and molecular genetic PCR methods.The result of cytogenetics:there were 555 abnormal karyotypes of peripheral blood on 5390 cases (10.30%);In 2171 patients who asked for prenatal diagnosis,145 abnormal karyotypes were found (6.68%);We also karyotyped chorionic villous cells of 62 patients with spontaneous abortion and found 28 abnormal karyotypes (45.16%).The PCR results of 23 patients with Down's syndrome were all positive while the results of 155 normal persons were all negative.The method of cytogenetics is very important for diagnosis of abnormal karyotypes;Molecular genetic methods by PCR and FISH are quick,convenient and applicable way. Key words：genetic counseling; prenatal diagnosis; karyotypes abnormal; molecular genetics     

QF-PCR在染色体异常男性不育症诊断中的应用

为评估定量荧光PCR(QF-PCR)方法在男性不育遗传学诊断中的应用价值,文章对78例非梗阻性男性不育患者,采用精液常规检测精子情况,并检测患者性激素水平;采用QF-PCR方法对患者性染色体多态性STR位点及特异性位点进行检测;采用常规染色体G显带方法进行核型分析;PCR检测AZF微缺失。结果显示78例非梗阻性男性不育患者中发现无精子症患者18例,少精子症患者20例,总检出率为48.72%。采用QF-PCR方法检出3例47,XXY患者,2例46,XX(SRY+)性反转患者,1例AZFc区微缺失患者,与细胞培养染色体分析和AZF微缺失PCR检测结果相符。与传统方法相比,QF-PCR技术能更迅速、直接、可靠地检测到男性不育患者的染色体异常区域,及早发现染色体细微结构异常,有助于染色体异常造成的男性不育症的鉴别诊断。