大鼠CB1基因真核表达载体的构建及其对CaSki细胞凋亡的影响

目的构建大鼠CB1(r CB1)基因真核表达载体,检测r CB1基因在细胞中的表达,研究r CB1对人宫颈癌Ca Ski细胞凋亡的影响。方法从大鼠脑组织中提取总RNA,RT-PCR扩增r CB1基因,通过酶切、纯化、连接PCR纯化产物与p CDNA 3.1(+)质粒,构建pc DNA3.1(+)-r CB1。脂质体法将其转染到HEK293和Ca Ski细胞,Western blot及细胞免疫荧光联合激光扫描共聚焦方法检测r CB1的表达及定位,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot与实时荧光定量PCR检测r CB1、Bcl-2、Bax、Bad表达。结果酶切重组质粒获得5300 bp的载体片段和1500 bp的目的片段,测序结果和r CB1基因序列(NM_012784.4)一致。转染HEK293细胞后,r CB1在HEK293细胞细胞膜和细胞质表达。转染Ca Ski细胞后,r CB1使细胞凋亡率增加(P0.05);r CB1基因上调Bax、Bad的表达,同时抑制Bcl-2的表达,与空白组比较,其差异具有显著性(P0.05)。结论成功构建了pc DNA3.1(+)-r CB1真核表达载体,r CB1表达于细胞膜和细胞质,r CB1可以明显促进宫颈癌Ca Ski细胞凋亡,其机制是上调Bax、Bad和抑制Bcl-2表达。     

miR-769-3p 对甲型 H1N1流感病毒核蛋白表达的调控

目的:预测靶向甲型流感病毒核蛋白(NP)基的微小 RNA(miRNA),并检测其对 NP 表达的影响.方法:从miRBase 数据库中获取人成熟 miRNA 序列,利用 miRanda 软件预测潜在靶向流感病毒 A/FM/1/47(H1N1) NP 基的人 miRNA;通过双萤光素酶报告基系统及 Western 印迹验证所预测的 miRNA 对 NP 表达的影响.结果:用 miRanda软件在流感病毒 A/FM/1/47(H1N1) NP 基上预测得到分值及最小结合自由能均较好的 miR-769-3p;双萤光素酶报告基结果显示 miR-769-3p 能显著降低报告基载体萤光素酶的表达;Western 印迹结果显示 miR-769-3p 能明显抑制 NP 的表达,但突变 NP 基上的 miR-769-3p 结合位点后,miR-769-3p 不能抑制 NP 的表达.结论:miR-769-3p 可靶向流感病毒 A/FM/1/47(H1N1) NP 基并抑制 NP 的表达,为抗甲型流感病毒的 miRNA 药物研发提供了据和潜在药物靶标.     

培养人淋巴细胞分裂阻滞与常规微核测试法的比较研究 Ⅱ.丝裂霉素C的遗传毒性效应

为了确定胞质分裂阻滞微核测试法(CB-MNT)的实用价值,本研究用0.025-0.4μg/mL的丝裂霉素C(MMC)处理培养的人体外周血淋巴细胞,比较CB-与常规(C)-MNT检测遗传毒性的敏感性,结果表明:(1)在整个剂量范围内,两法测得的微核率(MNF)均有良好的剂量效应关系,但CB法测得MNF低于常规法,随剂量增加而加著;CB法测知的最低浓度为0.1μg/ml,常规法为0.025μg/ml,可见常规法的敏感性优于CB法;(2)我们首次比较了CB法与常规法所检测微核的平均体积,发现CB法检测微核的体积接近常规法的3倍,并提出由于微核形成前后,微核间及微核与主核间的融合,导致了微核体积的增大和数量的减少,进而引起了MNF的下降;(3)CB法检测健康人自发MNF明显高于常规法,这可能是CB法检测低剂量诱变剂效应,较常规法不够敏感的重要原因之一。最后作者结合文献讨论了CB-与C-MNT的实用价值。     

预测鼻咽癌放射敏感性的CB微核法

本文介绍一种预测鼻咽癌放射敏感性的方法——CB微核法。以该法评介了鼻咽癌细胞株及20例鼻咽癌患者活检标本的放射敏感性,随着剂量增加,微核率也明显增加。CB微核的剂量-效应与克隆法的剂量效应呈高度负相关(r=-0.970)。活检标本微核实验表明,20例中8例反应较高,7例中等,5例反应偏 低;随访表明,反应偏低者中已有2例有复发倾向。由于CB微核法具有简便、快速、正确性较高等优点,适于临床应用。     

人源抗汉坦病毒核衣壳蛋白T7噬菌体抗体库的构建

构建人源T7噬菌体单链抗体(scFv)库筛选抗汉坦病毒核衣壳蛋白(NP)抗体。从肾综合征出血热恢复期患者外周血淋巴细胞中提取总RNA,反转录合成cDNA第一条链,PCR分别扩增抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),经重叠延伸拼接(SOE)PCR组成scFv基因,并将其与T7噬菌体载体的2个臂相连接。体外包装后,在宿主菌BLT5403中,扩增重组噬菌体抗体库。以基因工程表达NP进行4轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选,酶免疫实验检测抗体活性。所建抗体库库容为1.35×107,扩增后初级库滴度为2.12×1010pfu/mL。以NP抗原筛选后抗体出现特异性富集,经酶免疫实验鉴定,得到2株与NP抗原特异结合的噬菌体抗体。结果表明,研究成功构建了人源抗NP蛋白T7噬菌体抗体库。     

链霉菌CB02959中四霉素及四烯菌素的鉴定及培养基优化

【背景】四霉素(Tetramycin)和四烯菌素(Tetrin)是具有广谱抗真菌活性的四烯大环内酯类抗生素。链霉菌CB02959是一株雷纳霉素(Leinamycin)类化合物的潜在产生菌株,利用antiSMASH分析其基因组发现该菌株含有一个纳他霉素(Natamycin)类四烯大环内酯化合物的生物合成基因簇。【目的】对Streptomyces sp. CB02959中次级代谢产物进行研究,确定其是否可以产生四烯大环内酯化合物,对其发酵产物进行分离和结构鉴定,并进行初步的发酵优化以提高产量。【方法】基于生物信息学预测和高分辨质谱数据,推测CB02959中多烯化合物的结构;在不同发酵培养基中培养CB02959,确定适合大规模发酵的培养基;敲除tetrA基因以确定目标基因簇和四烯大环内酯化合物产生的相关性;分离和鉴定CB02959产生的主要代谢物的结构;通过改变培养基中葡萄糖、麦芽提取物和胰蛋白胨的含量,提高四烯大环内酯化合物的产量。【结果】通过对CB02959中纳他霉素类化合物生物合成基因簇的分析及16S rRNA基因序列的进化树分析,推测CB02959可能是一株新的四霉素和四烯菌素产生菌;在YEME发酵培养基中对CB02959进行大规模发酵,分离得到4个化合物,鉴定为四霉素A (1)、四霉素B (2)、四烯菌素A (3)、四烯菌素B (4);最后通过培养基的初步优化,将化合物1–4的产量分别提高至208.1、100.0、1 315.6、109.9 mg/L。【结论】通过基因组挖掘策略发现了一株新的四霉素和四烯菌素产生菌链霉菌CB02959,并通过培养基优化提升了其四烯大环内酯化合物的产量,此发现为这类抗真菌天然产物的后续开发奠定了基础。     

勘误说明

29卷1期中的《全球古海水化学演化与世界主要海相钾盐沉积关系暨中国海相成钾探讨》一文中,项目资助部分"本文得到973课题(2011CB40300)……资助",应为"本文得到973课题(2011CB403007)……资助"。特此说明。     

细胞松弛素B和低盐诱导长牡蛎“海大3号”四倍体的效果比较

为探索细胞松弛素B(CB)和低盐抑制第一极体诱导长牡蛎“海大3号”四倍体的最佳条件,研究了CB浓度(0.2、0.4、0.6和0.8 mg/L)、低盐(6、8、10和12)及诱导持续时间(10min、15min、20min和25min)对卵裂率、孵化率、四倍体率和诱导效率指数的影响,并分析了幼虫生长和生存情况。结果表明,在CB浓度为0.6 mg/L,诱导持续时间为15min时,四倍体率为(65.69±2.47)%,诱导效率指数最大;在盐度为8,诱导持续时间为15min时,四倍体率为(38.77±2.69)%,诱导效率指数最大。CB和低盐诱导组前期壳高大于对照组,后期小于对照组, CB诱导组壳高显著大于低盐诱导组(P<0.05), CB和低盐诱导组幼虫平均日增长量分别为(14.2±1.08)和(10.49±0.60)μm/d,均小于对照组(15.43±1.08)μm/d; 2个诱导组存活率始终低于对照组,低盐诱导组前期存活率高于CB诱导组,后期低于CB诱导组。综合来看, CB诱导法在四倍体率、诱导效率指数、12d存活率和生长速度等方面效果较好,适用于诱导长牡蛎“海大3号”四倍体。     

壬基酚暴露对斑马鱼求偶行为与繁殖成功率的影响

壬基酚(NP)是普遍存在于水生生态系统中的一种环境内分泌干扰物。研究了不同浓度下(0,0.1,1,10,50,100μg/L)NP暴露对斑马鱼(Daniorerio)求偶行为与繁殖成功率的影响。结果表明,NP暴露对斑马鱼求偶行为与繁殖成功率影响显著,100μg/LNP暴露显著减少斑马鱼求偶时间、降低产卵量与受精率(P(0.05)。斑马鱼产卵量与求偶总时间、平均每次求偶时间、长于5s的求偶时间显著正相关(P(0.05),与求偶频率不相关(P=0.951)。NP暴露可能通过影响斑马鱼求偶时间,进而影响产卵量。斑马鱼求偶时间有望作为评估水体NP污染有效的生物标记。     

不同栽培模式对渭北旱塬区冬小麦生长期间土壤水分、温度及产量的影响

通过2a大田试验研究了不同栽培模式对渭北旱塬区冬小麦生育期内0-2 m土壤水分,耕层(10 cm处)地温,以及作物产量和水分利用效率的影响。结果表明:(1)推荐施肥+垄上覆膜+沟内覆草(NP+PF+S)、推荐施肥+垄上覆膜(NP+PF)和推荐施肥+麦秸覆盖处理(NP+S)均能增加土壤储水量,但以NP+PF+S和NP+PF处理较好;(2)3种覆盖栽培模式均提高了冬小麦越冬期间耕层地温,但推荐施肥+麦秸覆盖处理(NP+S)在冬小麦返青期耕层地温要低于对照(CK),推荐施肥+垄上覆膜+沟内覆草(NP+PF+S)和NP+S处理在冬小麦返青期后期到收获期耕层地温也均低于CK;(3)NP+PF+S处理较其它处理可增加冬小麦产量,并提高水分利用效率,其次是NP+PF处理,而NP+S处理增产效果不明显。可见,覆膜覆草和覆膜是较为适宜渭北旱塬雨养区冬小麦发展的栽培模式。     

甲型流感病毒核蛋白在大肠杆菌中的可溶性高效表达与纯化

为了在大肠杆菌中高效表达甲型流感病毒A/京科/30/95(H3N2)核蛋白NP,以便对原核表达的NP蛋白进行免疫原性研究,本研究通过密码子优化及全基因合成等方法,将3种形式的NP基因:与6×His标签融合的NP基因NP(His)、非融合的野生型NP基因NPwt及非融合的按大肠杆菌优势密码子改造的基因NP(O)分别插入原核表达载体pET-30a,构建了表达3种形式NP基因的3种原核表达质粒并研究不同质粒中NP蛋白的表达形式、条件、纯化工艺及抗原性。限制性酶切反应与测序表明,三种形式的NP基因均正确插入原核表达质粒pET-30a;SDS-PAGE凝胶电泳显示,三种形式的NP基因均能在大肠杆菌中表达,NP(O)基因的表达量最高;在不同温度诱导条件下,NP蛋白呈现可溶性表达,NP(O)基因可溶性高效表达的条件为:T=25℃,t=10 h;经阴离子交换和凝胶过滤层析两步纯化,可溶性表达的NP蛋白纯度可达90%;Western blot检测显示,纯化的NP能与流感病毒A/PR/8/34(H1N1)株感染小鼠的血清发生特异性结合。这些结果表明,非融合表达的密码子优化甲型流感病毒NP蛋白能在大肠杆菌中高效表达和纯化,同时保持良好的免疫反应活性。     

壬基酚对金鱼（Carassiusauratus ）胚胎发育毒性的初步研究

目的:观察环境激素壬基酚(Nonylphenol,NP)对金鱼胚胎发育的毒性效应。方法:在繁殖季节选取雌雄健康成年金鱼,采用人工受精的方法获取金鱼受精卵于23℃培养箱孵育。将正常发育的囊胚早期金鱼胚胎(50枚胚胎/培养皿)分别暴露在1μmol·L~(-1)、4μmol·L~(-1)、8μmol·L~(-1)、12μmol·L~(-1)和16μmol·L~(-1)的NP实验液中,设空白对照。通过显微成像技术观察NP暴露对金鱼胚胎发育形态、不同发育阶段胚胎死亡率、受精后72小时(72 hpf)孵化率及畸形率的影响。从原肠期开始每隔12 h观察一次。结果:低浓度NP主要影响金鱼胚胎晚期发育,使其尾部脊索弯曲上翘;高浓度NP可导致金鱼胚胎卵凝结、发育延迟、组织坏死、尾部卷曲、体轴缩短并出现血栓。各发育阶段胚胎死亡率和72 hpf畸形率随NP浓度升高而增加,72 hpf孵化率则随NP浓度升高而降低;NP对金鱼胚胎24 h、48 h、72 h的半数致死浓度(LC50)分别为:16.28μmol·L~(-1)、8.27μmol·L~(-1)和6.52μmol·L~(-1)。结论:NP对金鱼胚胎具有明显发育毒性,金鱼胚胎对低浓度NP也具有较高敏感性,在评价环境激素胚胎发育毒性方面具有潜在应用价值。     

壬基酚对斑马鱼求偶行为的生态毒理效应

鱼类行为是检测和评价水体环境内分泌干扰物质(EDCs)生态毒理效应重要而敏感的指标。壬基酚(NP)是水环境中广受世人关注的一种危险EDCs。为评估NP对鱼类求偶行为的毒性效应并探索NP污染的潜在生物标志物,研究了不同浓度(0、0.1、1、10、50、100μg/L)NP暴露24d对斑马鱼(Danio rerio)求偶行为与产卵量的影响。结果发现,NP暴露对斑马鱼产卵量影响显著(P=0.005),产卵量与"追逐"(R=0.292,P=0.015)、"推挤"(R=0.293,P=0.014)、"碰撞"(R=0.377,P=0.001)、"排精"(R=0.362,P=0.002)等求偶行为参数均显著正相关。NP暴露对斑马鱼各求偶行为参数的发生频率无显著影响,却显著增加了"追逐"(P=0.017)和"碰撞"(P=0.021)等求偶行为参数的繁殖努力。斑马鱼"追逐"与"碰撞"行为的繁殖努力是评估水体NP污染有效的生物标志物。     

大麻素受体系统对视网膜细胞离子通道和突触传递的调控

内源性大麻素系统在脊椎动物视网膜中广泛分布。大麻素受体(cannbinoid receptor)主要有CB1和CB2两个亚型,与内源性配体N-花生四烯酸氨基乙醇(N-arachidonoylethanolamide,anandamine,AEA)和2-花生四烯酸甘油(2-arachidonyl glycerol,2-AG)结合调控视网膜神经元和胶质细胞的功能,从而参与调控视网膜视觉信息的处理。本文结合我们研究组近年在视网膜大麻素受体系统的研究结果,综述了有关大麻素CB1和CB2受体对视网膜细胞离子通道和突触传递调控及其机制的研究进展。     

杆状病毒表面展示甲型流感病毒核蛋白的免疫原性及保护效果的初步评价

流感病毒的核蛋白(Nucleoprotein,NP)高度保守,具有型特异性,能够诱导产生细胞介导的免疫应答,从而起到保护作用,抵抗不同亚型流感病毒的攻击。本研究利用杆状病毒表面展示技术,将杆状病毒GP64蛋白的信号肽(Signal peptide,SP)和胞质尾(Cytoplasmic tail,CT)与甲型流感病毒(A/Hubei/1/2010(H5H1))的NP蛋白融合表达,从而将NP蛋白展示在杆状病毒的表面,并对该病毒NP蛋白的免疫原性和保护效果进行了研究。Westernblot实验证明NP蛋白可以在Sf9细胞中有效表达。免疫电镜试验显示NP蛋白已成功展示在杆状病毒表面。通过小鼠感染实验,ELISA结果证明NP疫苗可以诱导产生高水平的IgG血清抗体。ELISPOT结果表明NP蛋白的2个细胞免疫抗原表位(NP57-66IQNSITIERM和NP441-450RTEIIKMMES)可以诱导小鼠脾淋巴细胞产生IFN-γ,利用NP57-66、NP441-450和NP蛋白均可刺激CD4+和CD8+T细胞产生IFN-γ,但主要以CD8+诱导为主,表明重组病毒可以产生有效的细胞免疫反应。利用小鼠鼠肺适应株A/PR/8/34(H1N1)进行攻毒实验,结果表明该重组病毒感染小鼠后可以降低小鼠肺病毒载量,减轻肺组织损伤,减少体重下降,并可以保护50%小鼠存活。     

利用酵母双杂交系统在人脑cDNA文库中筛选与禽流感病毒核蛋白相互作用的蛋白质

禽流感病毒核蛋白 (NP) 在病毒的转录、复制以及决定病毒的宿主特异性方面都具有重要作用。通过酵母双杂交系统筛选与核蛋白相互作用的蛋白,为进一步了解NP蛋白与细胞内蛋白质的相互关系以及流感病毒与宿主的相互关系奠定基础。应用酵母双杂交系统,构建NP诱饵质粒,进而筛选人脑cDNA文库,寻找可能与禽流感病毒NP相互作用的蛋白质。经过酵母双杂交共验证,得到7个与NP相互作用的阳性克隆。该结果为深入了解病毒复制的分子机理及其在蛋白质水平上与宿主蛋白的相互作用关系提供了线索。     

Calbindin和Parvalbumin在C57BL/6J kit基因突变小鼠听觉传导通路中的表达

目的:观察钙结合蛋白(CB)和小清蛋白(PV)在C57BL/6J野生型小鼠与kit基因突变型小鼠(kit+/kitW-2Bao)听觉传导通路上的表达。方法:取kit突变型小鼠和野生型小鼠各6只,水合氯醛腹腔注射麻醉,经心脏灌流固定,取大脑进行冠状位冰冻切片。经免疫组织化学染色,观察CB和PV两种蛋白在小鼠听觉传导通路上的表达差异。结果:PV在野生型小鼠的腹侧耳蜗前核(AVCN)、腹侧耳蜗后核(PVCN)、下丘(IC)以及听皮层(AC)均有明显表达。CB在野生型小鼠的PVCN和斜方体核(Tz)有明显表达,在AC仅在2~3层有极少量表达。kit基因突变引起PV在PVCN、IC和AC的表达减少(P0.01),而Tz的表达增加(P0.01)。CB在基因突变小鼠PVCN表达消失,AC的表达增加(P0.01)。结论:PV和CB在野生型和突变型小鼠的听觉传导通路的表达存在明显差异。kit基因突变可引起PVCN、IC、Tz和皮层的PV表达变化,PVCN、AC的CB表达变化,表明kit基因突变对听觉通路高级中枢功能活动有一定的影响。     

两例事故受照者染色体畸变分析及生物剂量估算

应用外周血淋巴细胞染色体畸变和CB微核分析方法,对2000年河南许昌“3.06”60Co辐射事故1例受照者(A)和2000年河南开封“6.26”辐射事故一例过量放射性核素内污染致γ射线照射受照者(B)的生物剂量进行估算。结果表明,“A”和“B”两例受照者依据双+环率估算的剂量分别为1.44Gy和0.15Gy,CB微核率估算的剂量分别为1.43Gy和0.22Gy,与用物理方法估算的剂量比较接近,亦与放射损伤的临床诊断一致。泊松分布检验证实,“A”偏离泊松分布,受到不均匀照射。提示染色体畸变和CB微核分析是非常可靠的生物计量估算方法。 Abstract:Biological doses were estimated by using the yields of dicentrics plus rings(dic+r) and cytokinesis-block micronuclei (CBMN) for two victims of the accident radiation occurred on Mar 6,2000 in the City of Xuchang(victim A),and Jun 26,2000 in the City of Kaifeng(victim B),Henan Province,respectively.The results indicated that the equvalent whole body doses based on the standard dose-response curves established by the analyses of dic+r and CBMN were estimated to be 1.44Gy and 1.43Gy(victim A),and 0.15Gy and 0.22Gy(victim B).These doses were very consistent with the mean doses calculated from physical measurement and conformable to the clinical dianosis.The dic+r aberrations of victim A did not accord with Poisson distribution.The analyses of chromosomal aberrations and CBMN are an extremely reliable method in biological dosimetry.The radiation which victim A was exposed to was heterogeneous.     

小鼠膀胱内金属纳米粒子的光热光学相干层析成像

本文提出了一种利用光热相差对金属纳米粒子(NP)试剂进行光学相干层析成像(OCT)的方法.通过记录光热相位,可以跟踪深度可分辨、实时和高度局部化的光热转换.对于绝热吸收,光热相差代表了NP的局部光吸收特性.为了验证该方法的有效性,我们首先利用FD-OCT成像系统对不同浓度的NP试剂进行了琼脂体模实验.结果表明,光热相位...     

Immunophenotyping of hematopoietic progenitor cells: Comparison between cord blood and adult mobilized blood grafts

AIM:To study the immunophenotype of hematopoietic progenitor cells from cord blood (CB) grafts (n = 39) in comparison with adult apheresis grafts (AG, n = 229) and pre-apheresis peripheral blood (PAPB) samples (n = 908) using flow cytometry analysis.METHODS: First, we performed a qualitative analysis of CD34+ cell sub-populations in both CB and PAPB grafts using the standardized ISHAGE protocol and a wide panel of 20 monoclonal antibodies. Next, we stud-ied some parameters, such as the age of mothers and the weight of newborns, which can influence the qual-ity and the quantity of CD34+ cells from CB. RESULTS: We found that the percentage of apoptotic cells was high in CB in comparison to PAPB (PAPB: 4.6% ± 2.6% vs CB: 53.4% ± 5.2%, P < 0.001). In CB, the weight of newborn and the age of the mother have the influence on CD34+ cells. The follow-up of Ag CD133in the ISHAGE double platform protocol in association with CD45, CD34 and the 7’AAD shows an equal rate between the two cell populations CD133+CD45+CD34+ high and CD34+CD45+ high with a higher percentage. So, is the inclusion of Ac CD133 necessary in the pres-ent panel included in the ISHAGE methodflLast part, we showed a signif icant presence of interferon γ in CB in comparison to PAPB, the annexin showing the high number of apoptotic cells in CB. CONCLUSION: This study demonstrates that many different obstetric factors must be taken into account when processing and cryo-banking umbilical CB units for transplantation.