重组人β-catenin原核表达条件的优化及生物学活性鉴定

优化重组人β-catenin(138～686 aa)在大肠埃希菌中的原核表达条件,经分离纯化后进行生物学活性鉴定。利用基因工程技术,将构建的重组质粒β-catenin-pET-30a(+)转化到Escherichia coli Rosetta(DE3)中,经IPTG诱导后进行β-catenin原核表达。为了提高β-catenin表达量,从诱导时间、诱导温度与IPTG诱导浓度3个单因素方面进行原核表达条件优化。β-catenin经HisTrap层析柱分离纯化后,以荧光偏振实验和酶联免疫吸附测定实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)进行生物学活性鉴定。构建的工程菌经原核表达条件优化后,确定诱导温度25℃、诱导时间10 h、0.2 mmol/L IPTG作为β-catenin最佳原核表达条件。荧光偏振实验和ELISA实验说明,纯化的β-catenin具有良好的生物学活性。本研究成功进行了重组人β-catenin原核表达条件的优化与生物学活性鉴定,为深入研究β-catenin在肿瘤免疫抵抗中的生物学功能奠定了实验基础。     

靶向β-catenin/TCF4相互作用小分子抑制剂酶联免疫吸附法高通量筛选模型的优化与应用

在经典的Wnt/β-catenin信号通路中,β-catenin/TCF4 (T-cell factor 4) 相互作用在非小细胞肺癌 (Non-small cell lung cancer,NSCLC) 的生长分化、化疗耐药、转移复发等过程中发挥着重要的促进作用,已成为新型靶向性抗NSCLC转移药物开发的理想靶标之一。为了高效地发现抑制β-catenin/TCF4相互作用的苗头化合物,本研究在应用酶联免疫吸附实验 (Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA) 原理的基础上,通过优化GST-TCF4 βBD包被浓度和β-catenin反应浓度,建立ELISA高通量筛选模型并成功应用于苗头化合物的筛选。ELISA筛选模型优化实验结果表明,选用2 μg/mL GST-TCF4 βBD和0.5 μg/mL β-catenin建立ELISA高通量筛选模型,其Z′因子值为0.83,并成功筛选到具有良好抑制活性的白花丹素 (Plumbagin)。肿瘤细胞增殖实验结果表明,白花丹素对A549、H1299、MCF7和SW480细胞具有明显的细胞毒性。TOPFlash实验结果证实,白花丹素对转染的HEK293细胞内β-catenin介导的转录活性具有显著的抑制作用,β-catenin/TCF4相互作用可能是白花丹素抗癌活性的潜在分子靶标之一。文中以β-catenin/TCF4相互作用为靶标,通过系统的实验优化方案,成功地建立了适用于药物高通量筛选的ELISA筛选模型,为高效筛选靶向β-catenin/TCF4相互作用的小分子抑制剂奠定了实验基础。     

风疹病毒(RV)包膜糖蛋白E1特异基因片段的原核表达

目的:表达风疹病毒(RV)E1特异肽段的重组融合蛋白.方法:经过双酶切鉴定和测序鉴定的阳,陛重组质粒载体pGEX-2T/E1-N,转化到感受态大肠杆菌BL21后,用异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导其表达,并对诱导条件进行优化.用谷胱甘肽琼脂糖珠纯化重组融合蛋白,SDS-PAGE鉴定.结果:用IPTG可以诱导E1特异肽段的重组融合蛋白表达,37℃诱导时,最佳诱导剂浓度为1 mmol/L,最佳诱导时间为4h.诱导温度从37℃降至16℃时,重组融合蛋白以可溶性形式表达,用谷胱甘肽琼脂糖珠纯化获得了纯化的重组融合蛋白.结论:利用原核表达系统可以获得纯化的风疹病毒E1特异肽段的重组融合蛋白.     

重组人βNGF在大肠杆菌中的可溶表达、纯化及活性鉴定

旨在大肠杆菌中可溶表达重组人神经生长因子(Recombinant humanβnerve growth factor,rhβNGF),并对表达产物进行分离纯化和生物学活性鉴定。成功扩增h NGFβ亚基基因,将其克隆入pMAL-c2X表达载体,构建了hβNGF-MBP的大肠杆菌表达体系并进行诱导表达,表达产物经纯化后以Factor Xa酶切去除麦牙糖结合蛋白(MBP),Western blot鉴定后以TF-1细胞法检测生物学活性。结果显示,pMAL-c2X-hβNGF经酶切和测序证实构建正确,25℃、180 r/min、0.5 mmol/L IPTG诱导下可溶表达hβNGF-MBP融合蛋白。hβNGF-MBP经Factor Xa酶切后可去除MBP标签,SDS-PAGE分析纯化的hβNGF位于13 k D左右,纯度可达95%。Western blot鉴定为hβNGF,结果表明,比活约为1×10~6 U/mg。在大肠杆菌中成功可溶表达hβNGF,并具有较高的生物学活性。     

重组人胸腺素β4二串体蛋白的原核表达、纯化及生物活性

目的:获得具有生物学活性的重组人胸腺素β4二串体蛋白(Tβ4②)。方法:人工合成人Tβ4全长基因,构建Tβ4②基因,并将该基因克隆入载体pET-22b(+)中,转化宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达后,经疏水作用层析纯化重组Tβ4②蛋白,采用Western印迹鉴定表达产物,并对其进行生物活性检测。结果:表达和纯化了Tβ4②蛋白,重组人Tβ4②在体外可促进人脐静脉内皮细胞的增殖和迁移。结论:重组人Tβ4②具有与化学合成Tβ4相同的功能,并有更高的生物学活性。     

基于β-catenin/Lef1相互作用为靶标的新型抗肿瘤药物高通量筛选模型的建立

旨在以β-catenin/Lef1相互作用为靶标,建立基于ELISA原理的适用于靶向β-catenin/Lef1相互作用小分子抑制剂筛选的高通量筛选模型。利用DNA重组技术,将构建的β-catenin-pET-30a(+)重组质粒转化大肠杆菌Escherichia coli Rosetta (DE3),经诱导培养后进行β-catenin原核表达。采用亲和层析方法分离纯化β-catenin后,以GSTPulldown实验进行生物学活性鉴定。利用ELISA原理建立β-catenin/GST-Lef1结合的分子模型,通过优选GST-Lef1最佳包被浓度和β-catenin最佳反应浓度,建立适用于靶向β-catenin/Lef1相互作用小分子抑制剂筛选的高通量筛选模型。SDS-PAGE和Western blotting实验证实β-catenin的原核表达。GST Pulldown实验证实纯化的β-catenin具有良好的生物学活性。通过对基于ELISA原理建立的β-catenin/GST-Lef1结合的分子模型优化,选用10μg/mL GST-Lef1和6μg/mLβ-catenin建立ELISA高通量筛选模型,其Z?因子为0.76。本研究成功建立了基于ELISA原理的β-catenin/GST-Lef1结合的分子模型,为靶向β-catenin/Lef1相互作用小分子抑制剂的高通量筛选奠定了基础。     

小鼠HSP60基因的克隆与表达条件的优化

目的:克隆小鼠热休克蛋白60(HSP60)基因,在大肠杆菌中表达,并进一步对其表达条件进行优化.方法:采用RTPCR技术克隆出非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠HSP60的cDNA序列.构建重组表达载体pET28a- HSP60,以其转化大肠杆菌感受态细胞BL21( DE3),在不同的菌体浓度、不同浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、不同诱导时间以及不同温度条件下诱导,检测重组蛋白的表达情况.结果:获得一个含有1 721bp的cDNA的片段,重组蛋白HSP60在E.coli BL -21 (DE3)中的最佳表达条件是菌体密度A600nm为0.6,诱导时间为5h,诱导物(IPTG)浓度为4mmol/L,诱导温度为35℃,重组蛋白大小约为60kD.结论:成功克隆了小鼠HSP60基因,并在大肠杆菌中获得高效表达,为重组蛋白的分离纯化及进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

Flt3配体胞外域的原核表达纯化及活性鉴定

目的:构建pET32a(+)-hFLext原核表达载体,诱导hFLext蛋白表达、纯化及活性鉴定.方法:以人淋巴细胞cDNA文库为模板,克隆hFlext,构建pET32a(+)-hFLext重组表达载体.转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导蛋白表达,镍珠亲合层析纯化蛋白,SDS-PAGE及Western blot鉴定.细胞增殖实验检测其生物学活性.结果:成功克隆获得hFLext,并构建了pET32a(+)-hFLext重组表达载体.在大肠杆菌BL21,经1 mM IPTG 30℃诱导12 h,成功表达Trx-hFLext融合蛋白,主要以包涵体形式存在.经8M尿素变性包涵体蛋白,逐步透析复性,镍珠亲合层析纯化蛋白,SDS-PAGE及Western blot鉴定,成功获得高纯度的Trx-hFLext融合蛋白.细胞增殖实验证实其具有生物学活性,能够有效刺激脐血细胞增殖.结论:成功构建了pET32a(+)-hFLext重组表达载体,表达、纯化了具有生物学活性的Trx-hFLext融合蛋白,为造血干/祖细胞的体外扩增研究奠定了基础.     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的表达及其活性检测

目的:构建肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)高表达工程菌株,以获得具有生物学活性的重组TRAIL蛋白.方法:合成TRAIL基因,转到大肠杆菌中,IPTG诱导获得成功表达;进一步优化,增加可溶形式的蛋白质.利用硫酸铵对发酵液进行沉淀,经Ni柱、阴离子和阳离子交换柱层析,最终获得蛋白质纯品,对其进行体外活性检测.结果:经过IPTG诱导后,TRAIL达到菌体总蛋白的30％;经过优化,可溶形式蛋白达到55％.纯化获得纯度高于95％的TRAIL样品,体外测活结果表明:TRAIL蛋白能有效抑制多种肿瘤细胞增殖,抑制率达到70％-92％.结论:重组TRAIL以可溶形式得到高效表达,且具有较好的生物学活性,为其开发成药用蛋白奠定基础.     

重组人半乳凝集素-1的原核表达、纯化及生物活性检测

目的:在大肠杆菌中表达半乳凝集素-1(galectin-1),并进行纯化及生物活性检测。方法:将人半乳凝集素-1基因克隆至带有His融合标签的原核表达载体pQE-30上,转化大肠杆菌M15,经IPTG诱导表达,表达产物经亲和层析纯化后,进行Western印迹鉴定,并用红细胞凝集试验检测其生物学活性。结果:双酶切鉴定和核苷酸序列测定表明重组表达质粒pQE-30-Galectin-1构建正确;重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白的50%,主要以可溶形式表达,纯化后蛋白纯度达95%以上,且具有良好的红细胞凝集活性。结论:在大肠杆菌中表达了重组人半乳凝集素-1,且具有良好的生物活性。     

大西洋鲑鱼Ⅳ型抗冻蛋白的表达与纯化

[目的]构建Ⅳ型抗冻蛋白(AFPⅣ)大肠杆菌表达系统,纯化诱导表达的可溶性AFPⅣ,并进行质谱鉴定。[方法]构建pET22b-His6-AFPⅣ重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),并优化IPTG诱导条件,通过亲和层析进行分离纯化,收集样品并冻干保存,对Ⅳ型抗冻蛋白样品进行质谱(MALDI-TOF-TOF)鉴定。[结果]构建了pET22b-His6-AFPⅣ重组质粒,IPTG诱导表达产生可溶性AFPⅣ,且最佳诱导浓度为0.2 mmol/L,诱导时间4h,纯化后AFPⅣ浓度为136μg/ml。[结论]成功构建了AFPⅣ原核表达系统,优化了IPTG诱导条件,重组AFPⅣ得到纯化,并获得冻干样品5 mg,经质谱鉴定确认为AFPⅣ。     

人神经生长因子基因在大肠杆菌中的克隆、表达及产物纯化

从人胎盘组织中提取总DNA, 经PCR扩增编码人β神经生长因子（β-NGF）成熟肽的基因,并克隆到大肠杆菌表达载体pET15b中。重组质粒pET15b-NGF经测序与报道的完全一致。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导表达得到16kD的目的蛋白带,与预期的大小一致,NGF表达量约占全菌总蛋白的25%.经过亲和层析柱（Ni2+-charged IDA his-bind column）纯化后得到了单一的NGF蛋白条带,蛋白纯度可达90%以上,从每升表达菌液中可以得到4.56mgNGF。表达产物的Western 印迹鉴定结果显示：重组人神经生长因子能与兔抗人β-NGF的多克隆抗体发生特异性结合反应,在16kD处出现单一的条带,表明诱导表达的重组NGF具有免疫学活性。鸡胚背根神经节感觉神经元鉴定试验表明,本实验表达的重组NGF具有良好的生物学活性。     

单纯疱疹病毒1型囊膜糖蛋白gD在大肠杆菌中的表达、纯化及其免疫活性的鉴定

目的:在大肠杆菌中表达1型单纯疱疹病毒(HSV-1)囊膜糖蛋白gD,纯化重组蛋白并对其免疫活性进行鉴定。方法:将HSV-1 gD 基因克隆入原核表达载体pET-28b,利用异丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组质粒转化的大肠杆菌,探讨IPTG浓度、诱导时间、诱导温度对重组蛋白表达的影响;盐酸胍裂解变性包涵体,镍柱亲和层析法纯化gD蛋白,并对纯化后的蛋白进行透析复性;Western blot和ELISA检测gD蛋白的免疫活性。结果:酶切和测序结果表明gD基因克隆入pET-28b载体。该重组质粒转化的大肠杆菌经IPTG诱导后重组蛋白主要以包涵体形式存在,大小约40kDa。gD蛋白诱导表达的最佳条件为0.5mmol/L IPTG于37℃诱导8h。镍柱亲和层析法纯化获得的gD蛋白总量为3.1mg/L,透析复性后获得的gD蛋白总量为1.3mg/L,复性率为41.37%。Western blot及ELISA检测表明表达的gD蛋白具有免疫活性。结论:在大肠杆菌中表达并纯化获得具有免疫活性的HSV-1 gD蛋白,为进一步制备HSV-1诊断试剂和预防疫苗奠定了基础。     

人IL-6基因的克隆及其在原核生物中表达及条件的优化

构建人白细胞介素6(IL-6)的原核表达载体并优化其表达条件,为IL-6的高效表达提供试验依据。以人T细胞cDNA为模板通过PCR方法扩增IL-6基因,将其克隆到原核表达载体pET28a(+)中,酶切及测序鉴定重组体。将构建好的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,产物用Western blotting及人IL-6检测试剂盒分析鉴定。在保持菌种不改变的前提下,分别改变IPTG的浓度、培养时间、卡那霉素浓度、培养温度等来优化IL-6表达条件。结果显示,原核表达载体pET28 a(+)-IL-6成功构建,可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,得到相对分子质量约22 kD的IL-6蛋白,经Western blotting鉴定正确,经人IL-6试剂盒检测显示具有较高的免疫活性。在IPTG浓度400μmol/mL,卡那霉素浓度50μg/mL,40℃培养6 h的条件下,目的蛋白表达量最高,可占总蛋白表达量的40%。成功构建人IL-6原核表达载体且获高效表达,为研究IL-6生物学活性及产品开发提供了试验基础。     

可溶性GST-rh TRAIL55-281最佳表达条件及凋亡活性研究

将本室构建的重组质粒pGEX-5X-TRAIL55-281转入大肠杆菌JM109和HB101中,鉴定后诱导表达,然后针对培养温度、培养时间及诱导剂IPTG浓度设立梯度试验,发现重组质粒pGEX-5X-TRAIL在JM109与HB101中的表达情况相近,可溶性的人GST-rh TRAIL55-281最佳表达条件为26℃,0.06 mmol/L IPTG,200 r/min.利用亲和层析法纯化出大量可溶性GST-rh TRAIL55-281后,通过Western Blot及流式细胞仪检测发现GST-rh TRAIL55-281有较好的免疫学活性与生物学活性.为今后TRAIL作为抗肿瘤药物的开发做必要的准备.     

人分泌磷蛋白2基因的克隆、原核表达与活性检测

提取人肝癌组织RNA,通过RT-PCR扩增人SPP2成熟蛋白编码区基因并克隆至原核表达载体pET-22b（＋）,将测序正确的质粒转化大肠杆菌BL2l（DE3）,IPTG诱导重组蛋白表达,用Ni-NTA柱进行纯化,SDS-PAGE电泳及Western blot检测并证实目的蛋白的表达,通过重组蛋白对木瓜蛋白酶的抑制作用验证其生物学活性。重组质粒测序和酶切结果显示SPP2成熟蛋白基因已成功克隆到pET-22b（＋）。IPTG诱导重组菌后有25kDa大小的目的蛋白表达。优化诱导表达条件,获得可溶性表达的目的蛋白,纯化后纯度达90%,western blot表明其具有His标签抗原活性。重组SPP2成熟蛋白可抑制木瓜蛋白酶的水解作用（酪蛋白为底物）,重量抑制比为1∶3.1,抑制比活性为2511U/mg。     

四川白鹅CD4基因胞外去信号肽区的可溶性表达及纯化

根据Gen Bank公布的四川白鹅T细胞表面分子CD4基因序列设计特异性引物,扩增其胞外去信号肽区基因,将其构建成原核重组表达质粒go CD4-p ET-32a(+),并在大肠杆菌原核表达系统中进行可溶性表达并纯化,为进一步应用与研究提供基础。通过从成年四川白鹅胸腺组织中提取RNA,经反转录合成c DNA为模板扩增CD4基因胞外去信号肽区,并构建原核表达载体go CD4-p ET-32a(+)。在大肠杆菌Rosetta(DE3)p Lys S系统中进行原核表达,通过改变表达温度、培养基、诱导剂IPTG浓度、诱导时间以及抗性浓度等条件,最终获得可溶性表达并经NINTA亲和层析获得纯化蛋白。结果显示,鹅CD4胞外区蛋白只有在16℃的TB培养基中目的蛋白his-go CD4可表达,鉴定结果与预期相符,诱导表达成功且多以不可溶的包涵体形式存在。研究发现改变IPTG浓度对表达产物存在形式影响较大,最终筛选出以0.4 m M的IPTG条件作为可溶性表达的最佳诱导浓度。NI-NTA亲和层析获得纯化蛋白并经Western-blot验证。     

鸡贫血病毒凋亡素基因的可溶性融合表达及抗肿瘤活性分析

为获得高效可溶表达的鸡贫血病毒凋亡素基因(CAV-Apoptin),根据大肠杆菌密码子偏爱性优化CAV-Apoptin基因序列,将其连接到含msyB伴侣基因的pBCX载体上,转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,经SDS-PAGE鉴定后应用镍柱亲和层析纯化蛋白质,采用显微镜观察、CCK-8实验与DNA ladders测定其抗肿瘤细胞的活性。结果显示,成功构建大肠杆菌表达载体pBCX-CAV-Apoptin,在37℃正常培养条件下的大肠杆菌中得到大量可溶性表达产物,融合蛋白质分子量大小约为42 kDa,50 ml菌液即可获得1.5 mg左右的纯化重组蛋白,CCK-8实验结果显示纯化后的重组蛋白作用36 h后可对套氏淋巴瘤JEKO-1、REC-1细胞生长产生超过60%的抑制率;显微镜观察与DNA ladder实验证明重组蛋白可诱导JEKO-1、REC-1细胞的凋亡,对HUVEC没有诱导凋亡的作用。免疫印迹分析表明重组凋亡素对JEKO-1细胞诱导了Caspase-3的激活,而对Caspase-8的表达没有影响。研究表明融合蛋白msyB-CAV-Apoptin可达到高效可溶表达,且表达产物具有特异抗肿瘤活性。     

棉花咖啡酸-O-甲基转移酶基因的原核表达及蛋白纯化鉴定

为获得大量高纯度的GhCOMT2蛋白以便研究其功能和性质,以pMD18-GhCOMT2质粒为模板,PCR扩增GhCOMT2基因的cDNA编码区,构建原核表达载体pET-28a-GhCOMT2,经酶切鉴定并测序后转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中进行诱导表达,并采用Western blotting方法鉴定表达产物.结果表明:在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中成功表达了与标签蛋白融合的GhCOMT2蛋白,大小约为40.062 kD,浓度为0.62 mg/mL.重组蛋白的最佳诱导条件为:0.2 mmol/L IPTG在16℃诱导12 h.重组蛋白以可溶形式高效表达,用蛋白标签亲和层析柱(His TrapTM HP)获得纯化重组蛋白,Western blotting分析表明其能与His多克隆抗体起特异性反应.     

分选酶A(SrtA)的GST融合表达、纯化及活性测定

构建GST/金黄色葡萄球菌分选酶A (SrtA)的原核表达载体,在大肠杆菌中表达、纯化分选酶,并利用展示在酵母表面的底物检测分选酶的活性.以pMD20-SrtA为模板,PCR扩增得到SrlA△N59基因,经BamH I和Xho I双酶切,连接到原核表达栽体pGEX-4T-1中,构建重组表达栽体pGEX-SrtA△N59,转化大肠杆菌BL21( DE3),IPTG诱导表达,GST亲和层析分离纯化得到SrtA△N59,与展示在酵母表面的底物序列QALPETGEE-linker-EGFP作用,产生游离的EGFP,通过酶标仪检测EGFP荧光强度确定分选酶的活性.结果显示,重组表达栽体pGEX-SrtA△N59经IPTG诱导,表达出相对分子质量约为42 kD的融合蛋白,SDS-PAGE分析,该融合蛋白是以可溶形式表达.分离纯化得到的分选酶与底物作用,其荧光强度由568.66±12.14增加至921.43±13.02.以上结果表明,成功构建了重组表达裁体pGEX-SrtA△N59,并在大肠杆菌中获得了可溶表达的有活性的分选酶.