小激活RNA(saRNA)——肿瘤治疗新途径

在基因的表达调控过程中,一系列非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA)发挥着广泛作用.然而,作为其重要成员的小激活RNA(small activating RNA, saRNA)却没有得到足够的认识和关注.本篇综述旨在介绍saRNA的机制与功能,并评估它的应用前景.文中归纳该领域的最新进展,特别是有关肿瘤治疗的研究. saRNA能识别基因启动子上特定序列、诱导相应基因的转录,从而实现基因激活.这不仅与siRNA(small interfering RNA)的抑制作用相反,而且有其独特的动力学特征.目前,saRNA研究主要集中于肿瘤领域,并发现它对某些肿瘤的生长和转移具有抑制作用,因而有望开辟肿瘤治疗的新途径.本文结尾简要探讨了saRNA在开发新抗癌药物等方面的应用潜力.     

RNA激活效应研究

RNAa(RNA activation)即RNA激活效应,是指某些小分子非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)在转录水平上激活基因表达的现象,这种发挥激活作用的小RNA分子又叫激活小RNA(small activating RNA,saRNA)。saRNA与干扰小RNA(small interfer-ing RNA,siRNA)同属小分子双链非编码RNA家族,既有相似的分子特征,在靶序列、作用动力学和调控方式等方面又有显著差别。虽然RNAa的作用机制尚未完全明了,但其在肿瘤治疗中的应用前景吸引了人们的关注。本文就RNAa近年的研究进展进行了简要综述。     

人类癌组织中端粒酶活性与p16基因表达的相关性

端粒酶是一种由RNA和蛋白质组成的RNA酶,依其自身序列逆转录合成端粒序列并添加到染色体末端,以保证细胞分裂的稳定性。近年来的研究已证实端粒酶的激活是许多恶性肿瘤发生的先决条件。p16基因作为一种重要的抑癌基因,其编码产物P16蛋白可通过p16-cyclinD/CDK-pRB途径调控细胞周期。在多种肿瘤中均出现p16基因表达异常,其表达缺失与人类肿瘤的发生发展关系密切。就端粒酶活性与p16基因表达在人类癌组织中的相关性及其可能作用机制进行总结分析。     

利用RNA干扰抑制p21WAF1/CIP1基因的表达及周期阻滞效应

目的：构建p21WAF1/CIP1基因小干扰RNA（siRNA）的真核表达载体,观察其对p21WAF1/CIP1表达的影响和细胞周期的变化。方法：合成了针对p21WAF1/CIP1基因的siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSliencer2.1-U6neo上,将重组质粒和带FLAG标签的p21WAF1/CIP1共转染293T人胚肾细胞,通过Westernblot检验RNA干扰（RNAi）敲低外源p21WAF1/CIP1的效果;将重组质粒单独转染293T人胚肾细胞,利用p21WAF1/CIP1抗体检测RNAi敲低内源p21WAF1/CIP1的效果;利用流式细胞仪检测敲低后细胞周期的变化。结果：测序证明构建了p21WAF1/CIP1siRNA真核表达载体;Westernblot和流式细胞分析证明,构建的siRNA能有效降低p21WAF1/CIP1基因的表达,并且使G1期细胞数减少14.03%,S期细胞增多13.45%。结论：构建了p21WAF1/CIP1siRNA的真核表达载体,该siRNA能有效抑制p21WAF1/CIP1基因的表达并部分解除了G1期阻滞。     

稳定表达外源性p16基因肺癌A549细胞株的建立及鉴定

为构建稳定表达外源性抑癌基因p16的肺癌A549细胞株,用脂质体介导的基因转染方法,借助真核质粒表达载体（pcDNA3)。将抑癌基因p16转移入此基因缺失的人肺癌细胞株A549细胞中,经G418筛选,获得稳定表达的细胞克隆,用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）及免疫组织化学鉴定p16基因的表达,同时对克隆细胞分泌蛋白进行活性检测。结果显示转染p16基因的A549细胞中可以检测到p16mRNA及蛋白的表达,说明建立的p16真核表达载体能在肺肿瘤细胞中分泌表达蛋白,表达P16抑癌蛋白的A549细胞株的建立有助于研究抑癌基因p16在肺癌发生中的作用。     

RNA激活

通常认为，RNA可以沉默基因的表达，而不是增强基因的表达。但为什么科学家又观察到RNA的激活现象呢？     

MicroRNA与肺癌发生、诊断及治疗

微小RNA(miRNAs)是一大类小的非编码RNA,它通过与靶mRNA 3′非翻译区部分互补配对来调节特定基因的表达。近来研究表明,miRNA可作为癌基因或抑癌基因在肺癌发生发展过程中起重要作用。比较癌组织和非癌组织中miRNA表达谱的差异可筛选出部分miRNA分子作为肺癌诊断和预后判断的潜在生物标记。调节具有致癌或抑癌功能的miRNA表达可能成为肺癌治疗新方法,而结合传统放化疗及其敏感性miRNA标志也为肺癌治疗研究提供了新的策略。该文对miRNA在肺癌发生与发展、基因诊断和治疗中的作用做一综述。     

基于CRISPR/Cas9的激活系统研究进展

基因编辑技术自问世以来就一直作为生物技术领域的研究热点。基因编辑工具成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关系统(CRISPR/Cas系统)具有特异性、简便性和灵活性等优点,为研究人员提供了丰富的遗传操作工具,也让CRISPR/Cas系统的应用在多种生物中得到了飞速发展。特别是将转录激活因子与失活的Cas蛋白结合,可在RNA转录水平实现基因表达特异性调控,为生物技术在医学研究及农业领域的发展做出了重要的贡献。外源基因的过表达是验证基因功能和基因调控的常用方法,然而由于载体容量的限制难以实现多基因过表达。基于CRISPR/Cas9激活系统可在不同向导RNA的引导下对多个基因进行调控,实现调控水平验证基因功能。本文通过对CRISPR/Cas9激活系统组成及不同激活策略进行总结,整理针对过度激活的解决方案,为CRISPR/Cas9激活系统应用于棉花遗传改良及除草剂抗性研究提供更多参考。     

穿心莲内酯恢复突变型p53野生型功能的作用及机制研究

目的 p53是人体内重要的肿瘤抑制因子,但在人类肿瘤中因高频突变而失去抑癌功能。突变型p53 (mutant p53,mutp53)可促进肿瘤的发生、发展和转移。由于在肿瘤细胞中通常有较高表达,mutp53已成为区别于正常细胞的一个特异性抗肿瘤靶点。本研究旨在探索穿心莲内酯的抗肿瘤作用机制,为寻找靶向mutp53的抗肿瘤化合物提供理论依据。方法 构建可以快速筛选具有恢复mutp53下游转录因子的荧光素酶系统,观察穿心莲内酯对H1299-p53 R273H-PUMAluciferase和H1299-p53R175H-PUMA-luciferase细胞中PUMA基因的表达情况;采用免疫荧光实验,检测穿心莲内酯对HT29(R273H)和SK-BR-3 (R175H)细胞中mutp53的表达影响;采用免疫印迹实验进一步观察穿心莲内酯恢复了mutp53肿瘤细胞中p53下游靶蛋白PUMA、p21、Noxa的表达;随后采用MTT和流式细胞分析,检测穿心莲内酯对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响;此外,还通过si RNA敲低Hsp70表达后,研究穿心莲内酯对mutp53下游基因的重激活作用。结果 穿心莲内酯可以...     

p53/miR-34a调控网络在肿瘤中的作用

MicroRNA是重要的调控分子,长约22 nt,属于非编码RNA,对肿瘤的发生和发展起着重要的作用。miR-34a是研究比较清楚的microRNA,目前认为是重要的抑癌micro RNA。p53是一个重要的抑癌基因。p53与miR-34a形成的正反馈调控网络具有抑制肿瘤细胞生长、转移及抑制肿瘤干细胞的功能。现综述p53/miR-34a调控网络研究的最新进展,并探讨其在肿瘤诊断及治疗中的应用。     

癌症中p53失活的分子机制和靶向p53的抗癌药物研究进展

肿瘤抑制因子p53主要作为转录因子发挥作用.当细胞受到诸如缺氧、DNA损伤等胁迫时,p53蛋白迅速在细胞内积聚并激活,从而调控一系列基因的转录,导致细胞周期停顿、凋亡或衰老,避免细胞癌化.p53功能的失活往往导致癌症发生.编码p53蛋白的TP53基因的突变是p53失活的主要方式.突变型p53不仅失去抑癌作用,而且还具有...     

血红素加氧酶-1对肝癌细胞细胞周期调控因子的影响

目的观察血红素加氧酶-1（heme oxygenase 1,HO-1）对人肝癌细胞HepG2细胞周期调控因子的影响。方法构建含有野生型和突变型HO-1基因的重组载体pcDNA3．1（＋）-wtHO-1和pcDNA3．1（＋）-mHO-1G143H。利用脂质体介导的方法将构建好的重组载体转染肝癌细胞系HepG2,以空载体转染作为对照组。通过G418筛选建立稳定表达野生型和突变型HO-1的HepG2肝癌细胞系。经半定量RT—PCR、Western印迹检测转染细胞系中HO-1 mRNA和蛋白的表达水平。在HO-1表达改变的稳转细胞系中,利用Western印迹检测转染细胞系中P21、P27蛋白表达水平。结果成功实现了野生型和突变型HO-1在HepG2细胞中的过表达;野生型和突变型HO-1过表达均能诱导抑癌基因p21和p27的表达。结论HO．1过表达诱导抑癌基因p21和p27的表达与血红素分解产物无关。HO-1可能通过其它机制调节p21和p27的表达。     

抑癌基因的负转录调控

抑癌基因在正常细胞中适度表达,抑制细胞永生及转化,其转录下调见于某些肿瘤,而在衰老细胞中常见表达上调或活性增强。抑癌基因INK4a／ARF、p53和p21^Cipl的表达及其负调控与肿瘤及细胞衰老的关系十分密切。     

miRNA在肿瘤分子诊断和治疗中的研究进展

微小RNA(miRNA)是一类真核生物内源性、长18~25个核苷酸的小分子单链RNA,能够通过与靶mRNA特异性的碱基互补配对引起靶mRNA的降解或者翻译抑制,miRNA调节的紊乱将对细胞产生重要的影响。在肿瘤中,抑癌性miRNA的缺失会增加其靶向致癌基因的表达,而致癌miRNA(被称为oncomirs)的升高能够降低其靶向肿瘤抑制基因的表达。这一认识使得应用靶向致癌性miRNA与恢复抑癌性miRNA的功能来治疗肿瘤成为可能。随着临床研究的不断深入,miRNA不断为肿瘤分子诊断和治疗提供新的思路和治疗手段。     

抑癌基因p53蛋白产物与DNA相互作用的研究进展

抑癌基因p53蛋白产物是一种多功能的转录调控因子,其C-末端含DNA结合区,N-末端含转录激活区。它能通过磷酸化或构象变化来激活其DNA结合活性,从而与某些基因的启动子区结合而激活它们的转录,而对不具有与其结合位点基因的转录起抑制作用。p53蛋白还能作为一种DNA复制因子,通过与某些基因的复制起始区结合而对它们的复制或修复进行调控。对基因转录或复制的调控都最终反映在对细胞周期的调控上。     

维甲酸对人成骨肉瘤MG-63细胞增殖和相关基因表达的影响

目的:研究维甲酸对人成骨肉瘤MG-63细胞增殖和相关基因表达的影响,以探索其对成骨肉瘤细胞的生物学效应.方法:以1μmol/L维甲酸处理人成骨肉瘤MG-63细胞,生长曲线测定,流式细胞仪分析、光镜观察和免疫细胞化学检测等研究维甲酸对MG-63细胞的生长曲线、细胞周期和相关癌基因、抑癌基因表达的影响,并对其作用机理进行初步分析.结果:维甲酸处理7天后,MG-63细胞生长抑制率达到42.2%,G0/G1期比例达到61.8%,细胞形态铺展,排列趋于规则,癌基因c-myc、c-fos的表达降低.而抑癌基因Rb、p27表达上调.结论:1μmol/L维甲酸可以有效抑制细胞的增殖活动,改变细胞恶性形态特征,下调癌基因c-myc、c-fos和上调抑癌基因Rb、p27的表达,从而对人成骨肉瘤细胞分化具有诱导作用.     

RNA:诱导基因沉默

在生物体中,双链RNA(double-strand RNA,dsRNA)裂解后的小RNA可以诱导细胞质和基因组水平外源基因沉默。所谓基因沉默(gene silencing)是指生物体中特定基因由于种种原因不表达。小RNA能诱导互补信使RNA在转录后降解。RNA沉默是基因组水平的免疫现象,代表了进化过程中原始的基因组对抗外源基因序列表达的保护机制,在动植物进化中起着重要作用,RNA沉默具有抵抗病毒入侵、抑制转座子活动等作用,并调控蛋白编码基因的表达,具有十分诱人的应用前景。     

人细胞周期蛋白G2基因真核表达载体构建及其功能研究

构建人cyclin G2基因真核表达载体,进一步研究cyclin G2对体外培养细胞增殖的调节作用及可能的调节机制。以人口腔癌前上皮细胞系POE4总RNA的反转录产物为模板,应用RT-PCR方法克隆cyclin G2基因cDNA,成功构建真核表达载体pIRES -G2;应用脂质体介导的基因转染技术,以体外培养的肿瘤细胞系HeLa细胞和正常细胞系CV-1细胞作为受体细胞,进行转基因表达研究,发现cyclin G2高表达对体外培养细胞的增殖起明显抑制作用;应用p16INK4a、p21WAF1、p27KIP1三种周期蛋白依赖性激酶抑制因子的单克隆抗体对转基因的HeLa细胞进行免疫细胞化学研究,发现转染pIRES-G2的实验组细胞中,p21 WAF1蛋白染色阳性细胞数明显多于转染空载体的对照组,平均光密度值高于对照组,两组间均有显著性差异（p<0.01）,提示cyclin G2抑制细胞增殖作用可能是通过诱导p21WAF1的表达而实现。     

低分化胃腺癌组织AUF1与p16表达的负相关

RNA结合蛋白AUF1（AU-富含元件结合/降解因子）通过结合并促进抑癌基因p16 mRNA降解来抑制p16表达.然而,AUF1-p16调控过程在肿瘤发生发展过程中的意义有待探讨.本研究用Western印迹与RT-PCR技术分别检测临床50例患者低分化胃腺癌组织和癌旁组织细胞中AUF1和p16蛋白、p16 mRNA的表达情况,并分析其关联性;用RNA Pull-down技术检测其AUF1与p16 mRNA的结合情况.结果显示,低分化胃腺癌组织AUF1蛋白表达水平明显增高,且与p16蛋白和p16 mRNA相对表达水平呈负相关;RNA pull-down分析结果显示,癌组织AUF1与p16-3′UTR的结合活性明显强于癌旁组织. 提示AUF1-p16调控过程可能是低分化胃腺癌组织p16水平降低的重要机制.     

miR-199a-3p负调控CBX7影响肺癌细胞NCI-H460的生物学行为研究

目的:探讨mi R-199a-3p负调控CBX7影响肺癌细胞NCI-H460的生物学行为。方法:qRT-PCR法检测并比较肺癌组织、癌旁正常组织、肺癌细胞、正常肺上皮细胞中的mi R-199a-3p m RNA相对表达量。比较远处转移肺癌组织、未转移肺癌组织中mi R-199a-3p m RNA相对表达量。qRT-PCR法、Western Blot法检测并比较肺癌组织、癌旁正常组织中的CBX7 m RNA及蛋白的表达水平。荧光素酶活性法检测mi R-199a-3p与靶基因CBX7的结合。比较mi R-199a-3p模拟物转染组与阴性对照组的肺癌细胞中的CBX7 m RNA相对表达量及CBX7蛋白表达水平。CCK8实验检测mi R-199a-3p对肺癌细胞增殖的促进作用。Tranwell实验检测mi R-199a-3p对肺癌细胞侵袭与迁移能力的影响。结果:肺癌组织中mi R-199a-3p明显高于癌旁正常组织,发生远处转移的肺癌组织中mi R-199a-3p m RNA的表达量明显高于未发生转移的肺癌组织,差异有统计学意义(P<0.001)。肺癌组织中CBX7m RNA、CBX7蛋白表达水平均明显低于癌旁正常组织,差异有统计学意义(P<0.001)。荧光素酶活性法证实mi R-199a-3p可与靶基因CBX7结合抑制CBX7的表达。肺癌细胞中mi R-199a-3p m RNA的相对表达量明显高于正常肺上皮细胞,CBX7 m RNA相对表达量明显低于正常肺上皮细胞(P<0.05)。对于肺癌细胞,mi R-199a-3p模拟物转染组的CBX7 m RNA相对表达量及CBX7蛋白表达水平均明显低于阴性对照组(P<0.001)。CCK8实验证实mi R-199a-3p能够促进肺癌细胞的增殖,Tranwell实验证实mi R-199a-3p对肺癌细胞侵袭与迁移具有积极的促进作用。结论:mi R-199a-3p在肺癌的发生发展过程中发挥重要作用,能够通过抑制CBX7基因的表达,促进肺癌细胞的增殖、侵袭和转移。