水稻锌指蛋白基因O_sBBX22响应热胁迫的功能分析

利用RNA干涉技术研究水稻锌指蛋白基因O_sBBX22的生物学功能,为探讨O_sBBX22响应热胁迫的机制、培育抗逆水稻、减轻高温对水稻的损害奠定基础。通过观察转基因突变体植株和野生型植株在热胁迫下的表型差异,分析O_sBBX22生物学功能;采用半定量PCR和荧光定量PCR检测O_sBBX22以及相关的热激转录因子(HSF)、热激蛋白(HSP)基因在转基因突变体株系中的表达水平;通过原位组织化学检测过氧化氢在野生型、转基因突变体株系叶片中的定位和积累情况。结果表明,在0~5 h热胁迫条件下,与野生型株系相比,O_sBBX22的表达在转基因突变体植株中明显下调;而野生型O_sBBX22受热信号诱导,随着热激时间的增加,O_sBBX22的表达量呈先上升后下降的趋势,且在热激1 h时表达量最高。相关的HSF和HSP也受热信号诱导,野生型株系中的HSFA2a、HSFA7、HSP16.9和HSP100表达量均比转基因突变体株系高,且在热激1 h时,HSFA2a、HSP16.9和HSP100表达量最高,而HSFA7在热激3 h时表达最高。热胁迫3 h,经DAB染色,转基因突变体株系叶片上出现的红褐色斑点主要集中于叶脉和受损伤部位,且明显多于野生型。锌指蛋白基因O_sBBX22在水稻苗期热胁迫应答中具有重要的作用,野生型株系抗热能力明显高于O_sBBX22抑制表达转基因株系;HSFA2a、HSFA7、HSP16.9和HSP100可能参与了O_sBBX22介导的水稻耐热调控。     

灰葡萄孢丝裂原活化蛋白激酶编码基因bmp1和bmp3的功能

【背景】植物病原真菌丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号途径参与病菌有性生殖、细胞壁完整、菌丝侵染、致病力、胁迫响应等过程,灰葡萄孢MAPK信号途径参与病菌生长发育、致病力以及胁迫响应,但MAPK信号途径基因在灰葡萄孢中的功能尚未完全阐明,该信号途径对灰葡萄孢的生长发育和致病力的调控机制尚不明确。【目的】明确灰葡萄孢MAPK编码基因bmp1、bmp3在病菌生长发育、致病力以及氧化胁迫响应过程的功能,为进一步阐明MAPK信号途径调控灰葡萄孢生长发育和致病力的分子机制奠定基础。【方法】利用RNAi技术构建灰葡萄孢MAPK编码基因bmp1和bmp3的RNAi突变体,并以野生型BC22菌株为对照,对bmp1和bmp3基因的RNAi突变体的表型、致病力以及对氧化胁迫的敏感性进行分析。【结果】灰葡萄孢bmp1和bmp3基因的RNAi突变体其菌落形态、菌丝形态均与野生型BC22菌株没有明显差别;bmp1基因的RNAi突变体生长速率明显减慢,分生孢子产量明显降低;bmp3基因的RNAi突变体的生长速率与野生型BC22菌株没有明显差别,不能产生分生孢子。bmp1和bmp3基因的RNAi突变体在番茄果实的表面均不能产生明显的致病症状,而且不能穿透玻璃纸。bmp1基因的RNAi突变体在含有H_2O_2的培养基上受抑制的程度显著低于野生型,而在含甲萘醌的培养基上受抑制的程度显著高于野生型;bmp3基因的RNAi突变体在含有H_2O_2和甲萘醌的培养基受抑制的程度均显著高于野生型。【结论】灰葡萄孢bmp1基因正调控病菌生长、分生孢子形成、致病力和穿透能力,参与调控病菌对氧化胁迫的响应;灰葡萄孢bmp3基因正调控病菌分生孢子形成、致病力、穿透能力以及对氧化胁迫的响应。     

拟南芥AMP1负调控植物对高盐胁迫的反应

高盐胁迫严重影响植物的生长发育及农作物产量,因此鉴定盐胁迫响应相关基因至关重要。拟南芥的AMP1编码一个推测的谷氨酸羧肽酶,参与植物的生长发育、光形态建成与种子休眠。研究证明了AMP1的一个新功能,它的缺失提高了缺失突变体amp1的抗高盐胁迫的能力,研究证明amp1突变体的强抗高盐胁迫表型一方面是由于在高盐胁迫下amp1突变体比野生型中积累了更多的甜菜碱和脯氨酸降低了突变体细胞的水势,另一方面高盐胁迫条件下amp1突变体中高盐胁迫响应的下游基因RD29A,以及AHA3的表达量也高于野生型,后者可促进Na+的外排;高盐条件能够对植物造成氧化胁迫,研究发现AMP1的缺失还上调了抗氧化相关基因ZAT10/12的表达量,进而降低了在高盐胁迫条件下amp1突变体内过氧化物的积累水平,减轻对细胞的损伤和生长的抑制,这些都提高了amp1突变体的抗高盐胁迫的能力。以上结果证明在拟南芥中AMP1负调控植物对高盐胁迫的反应过程。     

AtWRKY40参与拟南芥干旱胁迫响应过程

以拟南芥(Arabidopsis thaliana)野生型、AtWRKY40缺失突变体和过表达株系为材料,研究AtWRKY40在植物干旱胁迫响应过程中的作用及其生理和分子机制。结果显示,AtWRKY40受干旱胁迫诱导;AtWRKY40缺失导致干旱胁迫下种子萌发率降低,叶片失水加剧,而AtWRKY40过表达植株呈现出相反的表征;干旱胁迫下,At WRKY40缺失突变体植株叶片过氧化氢(H_2O_2)、超氧阴离子(O_2~-·)及丙二醛(MDA)含量显著高于野生型及其过表达株系,超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性、脯氨酸(Pro)和可溶性糖含量以及相关基因AtCu/ZnSOD、AtCAT1、AtP5C1S、AtG6PD5和AtBAM4表达量显著低于野生型,同时AtWRKY40过表达株系的渗透物质含量和保护酶活性及其基因表达量则高于野生型。由此说明,AtWRKY40通过调节植株抗氧化能力及渗透调节能力参与拟南芥干旱胁迫响应过程。     

核黄素参与水稻非生物胁迫响应的分析

为探究核黄素在水稻非生物胁迫响应中的作用,以粳稻Kitaake和籼稻T98B为试验材料,考察了核黄素对2种材料的盐、高温、渗透、碱和氧化胁迫响应的影响,重点测定了盐和高温胁迫下水稻体内核黄素合成基因的表达和相关生理指标。结果表明,(1)施加外源核黄素有效提高了2种水稻材料的盐和高温胁迫耐受性,降低了渗透胁迫耐受性,而其氧化和碱胁迫耐受性不受影响。(2)逆境胁迫均不同程度地促进了核黄素在2种水稻材料中的积累,尤其在盐和高温胁迫下促进效果最明显。(3)盐和高温胁迫均诱导了核黄素合成酶基因的表达,促进了核黄素的生物合成,改善了水稻的胁迫耐受性。研究表明,非生物逆境胁迫能促进核黄素在水稻体内的合成和积累,外源核黄素也能明显提高水稻对盐和高温胁迫的耐受性,但却降低了其对渗透胁迫的耐受性。     

拟南芥ACOL8基因在乙烯合成与响应中的功能分析

植物激素乙烯在多种生理生化过程中发挥重要作用,但其在特定组织器官中的合成机制尚不完全清楚。拟南芥中存在12个功能未知的ACC氧化酶类似蛋白（ACO-like homolog,ACOL）,运用基因定点编辑技术构建了ACOL8的功能丧失型突变体,发现该基因的突变削弱了经典的乙烯“三重反应”。与野生型相比,突变体黄化幼苗下胚轴及主根的长度显著增加,这与突变体对外源ACC的敏感性下降现象一致。同时还发现ACOL8基因的表达受乙烯信号的正反馈调控,EIN3过表达增强其表达水平,而etr1-3的突变则产生相反效应。再者,在正常条件下,ACOL8基因的突变并未影响拟南芥的生长;但在盐胁迫条件下,突变体的根冠比显著下降,这说明该基因参与植物的盐胁迫响应。综上,这些结果说明ACOL8可能具有ACC氧化酶的功能,参与乙烯的合成与响应。     

水稻PHD-finger转录因子基因OsMsr16增强耐盐性的可能性研究

Os Msr16(Oryza sativa L.multi-stress-responsive gene 16)是一个新的水稻植物同源结构域(PHD)-finger家族转录因子基因。之前研究显示,Os Msr16受到低温、高温和干旱胁迫的诱导表达。本研究中,q RT-PCR分析表明Os Msr16同样受到盐胁迫的诱导表达,推测该基因可能参与植物在高盐胁迫下的生理调控。苗期盐处理条件下,与对照相比,过表达Os Msr16的转基因水稻植株叶片失绿面积较少,存活率更高。盐胁迫条件下,转基因植株中积累更高含量的脯氨酸和可溶性糖,而丙二醛含量和双氧水含量明显降低。转基因植株中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性和过氧化氢酶(catalase,CAT)活性明显高于对照。以上结果说明Os Msr16基因可能在植物防御盐胁迫过程中发挥重要作用。     

拟南芥钾转运突变体atkup12鉴定及非生物胁迫的敏感性检测

[目的]鉴定获得拟南芥HAK/KUP/KT高亲和钾离子转运突变体atkup12,通过检测种萌期atkup12突变体在低钾、盐及氧化胁迫下的生长指标以初步明确拟南芥AtKUP12基因是否参与植物对非生物胁迫的响应。[方法]以拟南芥atkup12突变体基因组和总RNA反转后的cDNA为模板,通过PCR扩增确定AtKUP12基因T-DNA插入失活的纯合突变体。将野生型和atkup12突变体点种于0.5μmol/L低钾、不同NaCl浓度和1μmol/L甲基紫精的胁迫培养基,测定并比较突变体与野生型拟南芥在根长、种子萌发率及子叶绿化率间的差异。[结果]利用双引物法,结合反转录PCR,在DNA及RNA水平鉴定获得了AtKUP12基因的纯合突变体。低钾胁迫下,atkup12突变体种苗的根长比较野生型拟南芥短40%左右,较野生型受到了显著抑制;不同NaCl浓度胁迫下,atkup12突变体种子的萌发率较野生型显著降低;1μmol/L甲基紫精显著的抑制了突变体种苗的子叶绿化率。[结论]成功鉴定获得了AtKUP12基因T-DNA插入失活的纯合突变体,且AtKUP12基因的缺失会增加植物对盐、低钾及氧化等非生物胁迫的敏感性。     

水稻盐碱逆境响应锌指蛋白基因OsZFP6表达特性及功能研究

筛选到C2HC型锌指蛋白,其编码304个氨基酸,命名为OsZFP6。分别使用碱性盐(NaHCO3)和H2O2对水稻两周龄幼苗进行胁迫处理,检测到OsZFP6相对表达量受其诱导,并在叶和根中出现差异,因此,推测OsZFP6参与相应的逆境响应调节途径。我们将一个绿色荧光蛋白(GFP)与之融合,发现OsZFP6定位在细胞核。此外,对过表达OsZFP6的水稻转基因植株进行NaHCO3胁迫处理,结果表明过表达植株均具有较强的耐受性;并且在株高、鲜重生理指标上,野生型植株低于过表达OsZFP6植株,在野生型植株体内的MDA、H2O2含量高于过表达植株;说明OsZFP6在响应NaHCO3胁迫时可以通过清除过氧化物来增强植物的抗性。初步推测OsZFP6基因参与响应碱性盐胁迫途径的调控,可能在转录调控中直接或间接发挥重要作用。     

赤霉素调节植物对非生物逆境的耐性

赤霉素（GAs）是一类重要的植物激素,调控植物生长发育的诸多方面．最近的研究表明,GA也参与对生物与非生物胁迫的响应,然而GA参与非生物胁迫响应的遗传学证据及其机制有待于进一步研究．本实验室前期研究证明,水稻EullfELONGATEDUPPERMOSTINTERNODE）通过一个新的生化途径降解体内的活性赤霉素分子,并参与调控水稻对病原菌的基础抗病性．本研究发现,euil突变体对盐胁迫能力降低,而超表达EUll基因的水稻和拟南芥耐盐性显著提高．进一步研究发现,积累高含量赤霉素的水稻euil突变体对脱落酸（ABA）的敏感性下降,而赤霉素缺失的EUll超表达转基因水稻和拟南芥均改变了对于ABA的敏感性．EUll基因的转录受逆境诱导,其功能缺失与超表达调控了逆境标志基因的表达．综上推测,GA可能是通过影响ABA的信号途径从而改变了植物对非生物胁迫的响应．     

水稻PKC蛋白Os07g48290与CATs的互作及表达模式分析

过氧化氢酶(catalase,CAT)能有效消除或减轻氧化损伤,其酶活性受磷酸化修饰调控。现运用PCR技术从水稻中克隆了一个与蛋白激酶Cδ(protein kinase Cδ,PKCδ)同源的Os07g48290基因。亚细胞定位分析发现Os07g48290主要定位在细胞膜上。酵母双杂交实验发现,Os07g48290能与CATs(CatA、CatB和CatC)相互作用,其中Os07g48290-CatC间的互作更强。双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)与共定位实验进一步证实了Os07g48290与CATs的互作,并且其互作场所均位于细胞膜上。此外,Os07g48290和CATs的表达模式分析发现,Os07g48290和CATs主要在叶片中表达,而且其转录表达受NaCl与H_2O_2胁迫处理的诱导。总之,实验结果提示Os07g48290与CATs间可能存在磷酸化的互作形式,并以这种方式参与了水稻的盐及氧化胁迫的响应。     

拟南芥APX家族基因在植物生长发育与非生物逆境胁迫响应中的作用分析

活性氧造成的氧化胁迫是植物主要非生物逆境胁迫之一。在不利的生长条件下,植物细胞内的各种代谢过程不协调可导致过氧化氢(hydrogen peroxide, H_2O_2)含量增加,从而对细胞造成多种威胁和伤害。抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)是植物中清除H_2O_2的一种重要酶,拟南芥(Arabidopsis thaliana) APX家族包括8个成员:APX1～APX6、sAPX和tAPX。本研究以拟南芥野生型和突变体为材料,对拟南芥不同发育时期和不同逆境胁迫下的8种APX基因表达模式进行了分析,同时研究了其相应的缺失突变体对盐、干旱和热胁迫的耐受性。mRNA差异表达模式分析显示:在拟南芥生长的第4～8周,APX1表达量最高,APX2表达量最低,APX4、sAPX和tAPX随着生长发育的时间进程表达量逐渐减少,但APX6表达量不断增加;在非生物胁迫下,APX1、APX2和APX6受热胁迫诱导表达明显,sAPX响应盐胁迫,APX3和APX5对盐、干旱和热胁迫均表现出明显的诱导表达应答。盐和干旱胁迫耐受性分析结果表明:无论是在拟南芥的萌发期还是成熟期,任何一个APX基因缺失均使抗逆性降低;在萌发期,与盐胁迫相比,突变体对干旱胁迫更敏感;在成熟期,与野生型和其他突变体相比,apx1和apx6对盐和干旱胁迫更加不耐受。生理指标检测结果显示:干旱胁迫10 d后,所有突变体植株中的H_2O_2含量均明显高于野生型,其中apx1、sapx和tapx中最高;盐胁迫5 d后,突变体中丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量显著高于野生型;热胁迫2h就会导致apx1、apx2和apx6中H_2O_2和MDA含量大幅增加,其中在apx2中最高。本研究结果表明,拟南芥APX基因家族的8个成员均不同程度地参与植物生长发育及非生物胁迫响应的过程,在不同发育时期或逆境响应过程有特定的一种或几种APX发挥主要作用。     

胁迫相关蛋白激酶OsSAPK9调控水稻对铝胁迫的反应

水稻胁迫相关蛋白激酶(OsSAPKs,stress-activated protein kinase genes in rice)在调控水稻非生物胁迫信号传导中起着重要作用。本研究对OsSAPK9在水稻耐铝(Al)胁迫中的功能进行了初步研究。结果表明10 mmol/L Al处理12 h以上,OsSAPK9过表达转基因水稻植株根部Al的吸收量显著低于野生型植株; Al胁迫处理20 d,OsSAPK9过表达转基因植株株高降低百分比显著低于野生型植株。进一步分析发现OsSAPK9过表达转基因水稻植株根部超氧化歧化酶(SOD,Superoxide Dismutase)和过氧化物酶(POD,Peroxidase)的活性高于野生型,而根上部的SOD、POD和过氧化氢酶(CAT,Catalase)的活性则低于野生型植株。上述结果为改良水稻的耐铝性以及进一步揭示OsSAPK9调控水稻耐铝胁迫反应的分子机制提供了信息。     

高温胁迫对烟草叶绿体NADPH脱氢酶复合体活性的促进

为探讨叶绿体NAD(P)H脱氢酶复合体(NDH)在植物抵御热胁迫中的生理意义,比较了烟草ndhJK基因缺失突变体(ΔndhJK)和野生型对50℃高温胁迫的响应.高温下,野生型中一条NBT-NADPH氧化还原酶活性带有所增加,免疫印迹分析确定了此活性染色带是NDH亚复合体,该活性带中的NDH-K表达量也在热胁迫条件下明显地增加.与ΔndhJK相比,在高温胁迫下,野生型中远红光诱导的P700 氧化速率明显地变慢,而远红光关闭后的P700暗还原速率则显著地变快,表明高温促进NDH介导的围绕光系统I的循环电子传递.根据这些结果推测,在热胁迫条件下野生型中对NADPH底物专一的NDH活性的增加可能有利于减少NADPH的积累,减轻叶绿体间质的过度还原.     

花色素苷对拟南芥耐盐性的影响

为探讨花色素苷在盐胁迫中的防御作用及其机制,以模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)花色素苷合成途径相关基因缺失突变体(DFR基因缺失突变体tt3,CHS基因缺失突变体tt4,CHS、DFR基因双缺失突变体tt3tt4)及其野生型(WT)为材料,采用叶绿素荧光和超氧阴离子(O_2·~–)组织定位等方法,分析了tt3,tt4,tt3tt4和WT对盐胁迫处理的生理响应。结果表明,盐胁迫下3种缺失突变体叶片花色素苷含量的增加显著低于野生型,与WT相比,叶绿素荧光参数Fv/Fm、Yield、ETR、q P和NPQ下降较快,膜渗漏率升高显著,叶片O_2·~–积累程度为tt3tt4tt3/tt4WT。这表明花色素苷在植物抵御盐胁迫过程中起着重要作用,它可能是作为渗透调节剂及抗氧化剂来增强植物的耐盐性。因此,花色素苷含量可以作为筛选耐盐作物的指标。     

水稻受盐抑制基因OsZFP1的转基因分析

OsZFP1(水稻锌指蛋白1)基因编码的蛋白含有3个推测的Cys2/Cys2-型锌指结构域,它的表达受盐胁迫负调控.构建了以35S为启动子的OsZFP1基因的植物表达载体,并将其转入拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)植物和水稻(Oryza sativa L.)愈伤组织中以过量表达OsZFP1基因.转基因的拟南芥植株和水稻愈伤组织对盐处理的敏感性都比野生型要高.这一结果表明OsZFP1基因可能编码一种负调控蛋白,它可能抑制某些盐诱导基因的表达.在ABA处理下,转基因拟南芥植株比野生型植株抽苔晚,说明OsZFP1基因的作用可能受ABA调节.     

水稻OsMGD2和OsMGD3基因的功能鉴定及对烟草耐低磷胁迫的影响

【目的】单半乳糖甘油二酯合酶（MGD）是合成单半乳糖甘油二酯（MGDG）的关键酶,在植物响应低磷胁迫过程中起着重要作用。为系统了解水稻OsMGD2和OsMGD3基因在低磷胁迫响应中的作用和功能。【方法】采用盆栽试验分析正常和低磷条件下野生型（SR1）和过表达OsMGD2和OsMGD3转基因烟草的生理响应和脂质组分的变化。【结果】无论在正常还是低磷条件下,转基因烟草与野生型的磷含量无显著差异,然而转基因烟草的生物量、叶绿素含量和光合能力均显著高于野生型。转基因烟草在低磷胁迫下的磷脂（PL）含量、双半乳糖甘油二酯（DGDG）含量、DGDG/MGDG比值和半乳糖脂（GL）/PL比值均显著高于野生型烟草,且OsMGD3转基因烟草的脂质含量和比值均高于OsMGD2转基因烟草。【结论】通过调控水稻OsMGD2/3基因表达,可提高植物低磷下的膜脂重塑能力,维持植物在低磷胁迫下的较高的光合和生长能力,增加植物的低磷耐受性。     

一份水稻矮杆小粒突变体的形态特征和基因定位

从水稻T-DNA插入突变体库中鉴定出一个矮杆小粒突变体t129,该突变体与野生型植株相比,植株明显矮化,籽粒粒长明显缩短,千粒重下降。遗传分析表明,t129的突变性状由一对隐性核基因控制,该基因(T129)经图位克隆定位于水稻第5染色体长臂上,引物InDel43和InDel57之间,物理距离为430 kb,并与标记InDel51共分离。本研究明确了该矮杆小粒突变体的表型特征及遗传规律,为进一步研究调控水稻株高和粒型基因奠定基础。     

水稻幼苗条纹突变体yss1的转录组分析

利用60Co辐射诱变籼稻品种"Ⅱ-32B",筛选得到一个水稻幼苗条纹突变体yss1,该突变体在水稻五叶期前表现出明显的条纹叶表型;色素分析表明yss1叶片中叶绿素和类胡萝卜素含量明显低于野生型,五叶期后突变体和野生型无显著差异。利用转录组分析水稻三叶期野生型和突变体yss1中的基因表达,表明与野生型相比,yss1中表达差异显著的基因432个,其中274个表达上调,158个表达下调。GO分析显示叶绿素合成途径中多数基因表达上调,类胡萝卜素合成过程中的相关基因受到不同程度地调控。因此,推测YSS1基因通过调节叶绿素和类胡萝卜素合成过程中的基因表达,进而调控光合色素的合成。