重组人ASCT2的C-末端胞外结构域的原核表达、纯化及鉴定

中性氨基酸转运蛋白（ASCT2）是人类内源性病毒的包膜蛋白合胞素在细胞膜上的主要受体,其最大的胞外结构域存在于C-末端的105个氨基酸（以下简称TAIL）。通过RT-PCR方法从人乳腺癌MCF-7细胞中克隆ASCT2基因编码区全长序列,再从中扩增ASCT2的TAIL序列,与pET-41b（克隆位点的N-和C-端分别有谷胱甘肽转移酶和His6标签序列）连接构建原核表达载体,重组质粒在大肠杆菌中获得表达,免疫印迹显示重组蛋白TAIL在细菌裂解液上清和沉淀（包涵体）中均有表达,可溶性部分经亲和层析纯化获得高纯度的TAIL蛋白,该蛋白可结合在表达合胞素的MCF-7细胞表面,提示其可能具有结合合胞素的活性。     

重组人ASCT2胞外结构域ECL2在大肠杆菌中的表达及其鉴定

中性氨基酸转运蛋白(ASCT2)是人类内源性病毒的包膜蛋白合胞素在细胞膜上的主要受体,ECL2是该受体的其中一个较大的胞外结构域.通过RT-PCR方法从人乳腺癌MCF-7细胞中克隆ASCT2基因编码区全长序列,再从中扩增ASCT2的胞外区ECL2序列,与pET-41b连接构建原核表达载体,重组质粒在大肠杆菌中获得高效表达,重组蛋白在N-和C-端分别融合谷胱甘肽转移酶(GST)和His6标签,融合蛋白在上清液和包涵体中均有表达,可溶性部分经亲和层析纯化获得高纯度的重组蛋白,该蛋白可结合在表达合胞素的MCF-7细胞表面,具有结合合胞素的潜在活性,这些结果为进一步研究ASCT2与合胞素的相互作用奠定了基础.     

人FGFR1的BacMam系统构建、表达、纯化与鉴定

目前激酶类蛋白的表达大多由昆虫细胞表达系统实现,采用BacMam系统来表达受体型酪氨酸激酶人FGFR1,旨在获得更接近天然结构与功能的重组蛋白.首先,将pDEST20载体的多角体蛋白启动子替换成CMV enhancer启动子,获得BacMam表达载体pDEST20-CMVe.通过Gateway系统,将FGFR1具有酪氨酸激酶活性的区域克隆至改造后的载体中.利用昆虫细胞Sf9产生病毒,P2代病毒转导哺乳动物细胞FreeStyle 293-F进行表达,经亲和纯化后,成功获得了75 kD的融合蛋白.通过磷酸化底物的反应检测此FGFR1激酶的活性.结果表明,BacMam系统是一个良好的表达重组激酶FGFR1的平台,并且所表达的激酶活性高于昆虫细胞表达的激酶蛋白.     

HIV-1包膜蛋白gp41优势抗原的构建及可溶性表达

目的:筛选1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)中国流行株中包膜蛋白gp41的优势抗原片段,构建具有区域流行代表性的HIV-1 gp41重组抗原,为改进现有HIV-1初筛试剂盒中使用的同类抗原奠定基础。方法:利用免疫斑点杂交和生物信息学方法,从收集自重庆、广州、上海的区域代表性150份HIV-1感染者血清标本中筛选gp41抗原性强的候选样本,利用RT-PCR及巢式PCR方法扩增包含重要抗原表位决定蔟的gp41基因片段,与原核表达载体pQE30连接,转化大肠杆菌M15构建gp41重组抗原表达菌株,表达后经亲和层析纯化、SDS-PAGE和Western印迹鉴定。结果:兔源HRP标记的gp41多抗能识别标本中gp41抗原性差异,得到候选样本,扩增包含gp41主要抗原表位片段;构建了包含gp41抗原表达簇的重组原核表达质粒,表达、纯化后经His标签抗体Western印迹鉴定为阳性。结论:高纯度的重组优势gp41抗原的构建和鉴定,为进一步改进现有HIV初筛诊断奠定了基础。     

人类免疫缺陷病毒1型gp140包膜蛋白三聚体在哺乳动物细胞中的高效表达及其性质鉴定

本研究目的是通过优化1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)gp140编码基因的密码子和克隆设计,从而实现在293T哺乳动物细胞中高效表达,并对纯化获得的gp140蛋白进行抗原性质鉴定。在本研究中选择HIV-1B亚型NL4-3全基因序列为模板进行gp140克隆构建,通过密码子优化、信号肽替换、增加柔性linker、三聚体折叠序列等方法优化设计。通过HIV-1转录反式激活因子tat共转HEK293T细胞进行gp140蛋白表达,采用镍柱纯化。SDS-PAGE、Western blot、ELISA、负染电镜等结果显示目的蛋白纯度高于70%,每升培养基可获得0.5mg gp140蛋白,并且具有良好的抗原活性,电镜下呈现三聚体结构。通过弗氏佐剂与目的蛋白混合免疫Balb/c小鼠,检测小鼠免疫血清显示gp140蛋白能有效刺激机体产生免疫应答。本研究通过优化表达获得B亚型HIV-1NL4-3gp140蛋白,为HIV-1病毒包膜蛋白结构和重组疫苗研究奠定基础。     

利用细胞筛选法从噬菌体抗体库鉴定人源HIV-1单克隆中和抗体

以细胞法从HIV-1CRF07_BC特异性噬菌体抗体库中筛选和鉴定针对病毒包膜蛋白(Envelope,Env)的人源单克隆中和抗体。将pCH064.2-Env质粒转染293T细胞,以表达Env的活细胞淘洗噬菌体抗体库;利用细胞ELISA方法筛选Env特异性噬菌体阳性克隆,并测定抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)序列;以Ni+2-NTA层析柱纯化抗体Fab,SDS-PAGE分析抗体纯度;采用基于转染细胞和重组蛋白的ELISA以及流式细胞技术分析抗体的结合活性;以HIV-1假病毒系统评价抗体的中和活性。四轮淘洗使细胞特异性噬菌体得到约650倍的高度富集,细胞ELISA筛选到28个抗HIV Env的阳性克隆,序列分析发现五个具有不同VH和VL序列的抗体Fab(2801、2837、2863、2870和2920)。这些抗体与转染env的293T细胞反应,但不与重组表达的可溶性gp120蛋白反应,说明它们有可能针对依赖于Env复合物的空间构象表位。我们发现2801、2863和2870三个Fab抗体对HIV-1CRF07_BC亚型CH120.6毒株具有较强的中和活性,其IC50值分别为2.24μg/mL、0.89μg/mL和3.09μg/mL。其中,2801和2863对B亚型HIV-1毒株SF162具有较强的交叉中和作用,其IC50值分别为0.69μg/mL和3.52μg/mL。提示表达于293T细胞表面的HIV-1 Env可以有效富集和筛选噬菌体抗体库,并能成功分离和鉴定依赖于Env空间构象表位的HIV-1中和抗体。因此本研究为探讨HIV-1中和抗体的反应机制和研发艾滋病疫苗提供了新的技术平台。     

应用斑点金免疫渗滤试验快速同步检测抗HIV-1,HIV-2 IgG抗体

应用斑点金免疫渗滤试验(dotimmunogoldfiltration assay,DIGFA)建立了一种同步快速检测四种抗HIV-1/2IgG抗体的HIV诊断试纸.通过基因工程技术在大肠杆菌中表达了5种HIV抗原蛋白片段(P24,GP41,GP36,GP120V3,GP120C).这5种抗原蛋白首先被固定在硝酸纤维素膜上,然后滴加待测血清,其中的病毒抗体通过免疫反应与抗原结合,再加胶体金标记的葡萄球菌蛋白A(SPA),待其渗过膜片后,洗涤,即可形成肉眼可见的红色斑点.用已确证的21份HIV阳性血清(其中包括1份HIV-1标准阳性血清和1份HIV-2标准阳性血清)和30份阴性血清进行了试验,结果表明该快速检测方法与ELISA方法无显著差异.该检测方法不需任何仪器,仅凭肉眼即可判定结果,整个检测过程不超过5分钟.与传统的的ELISA法相比,具有方便快速,成本低廉,应用范围广等优点.同时,此HIV快速诊断试纸可以同步检测并区分针对HIV-1和HIV-2感染的不同检测标志物(抗P24、GP41、GP120和GP36抗体),这对提高快速检测的灵敏度和准确性,以及对判断HIV感染者是否临近或已进入AIDS期有着较高的应用价值.     

HIV-1Gag蛋白在大肠杆菌和重组杆状病毒系统中的高效表达及通用型温控原核表达载体的构建

将中国株HIV－1B亚型的gag全基因序列,克隆到杆状病毒表达载体pfastbacI中,构建了重组质粒pfastGag,利用细菌／杆状病毒表达系统筛选重组杆状病毒,在昆虫细胞中高效表达了HIV－1Gag蛋白。通过改造原核表达载体pBV220和pET28,构建了一种新的通用型温控原核表达载体质粒pVV5,该载体携带PrPl串联温控启功子及His—Tag纯化标签,利于目的蛋白表达与纯化。将HIV－1gag基因的1148一1857编码序列,分别插入到pVV5b、pET28b的相应位点,构建了重组表达质粒pEG1b、pEG7b,二者在不同受体菌中,表达重组蛋白的量分别占全菌体蛋白总量的42％和28％。利用IMAC金属螯合层析柱,对包涵体中的重组p24蛋白进行纯化,纯度超过80％;纯化后的重组蛋白可与HIV－1型标准阳性血清发生较强的免疫学反应。     

棉铃虫病毒gp41基因的克隆表达及抗体制备

根据棉铃虫单核衣壳核多角体病毒(Helicoverpa armigerasingle nucleocapsid nucleopolyhedrovirus,HaSNPV)gp41基因的序列,设计引物,引入适当的酶切位点,通过PCR的方法扩增目的片段。将扩增出的基因片段克隆至原核表达载体pET-28a,构建重组质粒并转化至大肠杆菌中,经IPTG诱导表达。纯化蛋白产物并免疫家兔产生抗血清。该抗血清可与原核表达的His-GP41融合蛋白及在感染的昆虫细胞中表达的GP41蛋白发生特异性免疫反应。该抗体的获得为深入研究GP41的功能提供了基础。     

HIV P66蛋白的表达、纯化及活性检测

此研究的目的是体外表达HIV-1逆转录酶P66亚单位蛋白,并得到纯度较高且具有活性的重组蛋白。首先通过PCR方法从含HIV-1 HXB2标准株全基因的质粒中扩增出全长p66基因,插入表达载体pTWIN1,构建pTWIN-p66质粒。再将该质粒转化到表达菌BL21,在IPTG诱导下表达P66蛋白。表达产物经几丁质柱一步纯化后得到P66蛋白纯品。纯化的P66蛋白分别催化B95-8细胞总RNA、RT试剂盒中对照RNA进行逆转录;同时以试剂盒中的M-MLV RT为对照进行相同的逆转录,PCR后电泳比较活性。结果显示我们构建的pTWIN-p66质粒在IPTG诱导下在原核细胞中P66亚单位蛋白表达量较高,经一步纯化后蛋白凝胶扫描纯度达88%,并具有较好的逆转录活性。与M-MLV RT体外活性比较,两者活性相当。该研究为进一步开发国产HIV确证诊断试剂及抗AIDS药物的研究打下了初步基础。     

重组人肝素酶在毕赤酵母中的表达

目的:建立肝素酶表达系统,大量制备人肝素酶,用于肝素酶的深入研究,及其抑制剂筛选模型的建立。方法:采用RT-PCR方法从肝癌细胞HepG2中克隆肝素酶全长cDNA,转入毕赤酵母表达体系,经甲醇诱导表达。结果:四唑蓝活性检测结果表明,表达产物具有肝素酶活性;Western印迹证实表达产物可被肝素酶抗体识别。结论:表达产物中含具有肝素酶活性的重组人肝素酶。     

三种乳腺特异表达载体表达特性的比较

为了比较不同来源乳腺特异表达载体的表达特性 ,将人溶菌酶 (hLYZ)cDNA分别克隆入自行构建的p2 0 5C3载体和国外引进的pBJ41和pBC1载体。重组载体p2 0 5C3LYZ、pBJLYZ和pBCLYZ分别用 2 5kDaPEI包裹后 ,通过尾静脉途径注射哺乳期小鼠。注射后 72h采集乳样 ,经微球菌溶解实验证明 ,3组小鼠乳汁中hLYZ的表达量分别为 87、69、60mg L ;从每组小鼠的 1 2种组织提取总RNA ,经Dotblotting检测证明 ,三种重组载体除在乳腺中表达外 ,p2 0 5C3LYZ还在小鼠的脾和肠、pBJLYZ在脾、pBCLYZ在脾和肾中具有一定的异位表达 ;在有hLYZmRNA转录的上述脏器中用微球菌溶解试验均可检测到hLYZ活性。这些实验结果表明 ,自行构建的乳腺特异表达载体的表达特性与从国外引进的表达载体无明显差别。     

巴斯德毕赤酵母表达系统及其高水平表达策略

毕赤酵母表达系统是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一,与现有的其它表达系统相比,巴斯德毕赤酵母在表达产物的加工、外分泌、翻译后修饰以及糖基化修饰等方面有明显的优势,现已广泛用于外源蛋白的表达。该文综述了其自身的优点,表达载体和宿主菌的特点,以及高水平表达外源基因的策略。     

鸡输卵管特异表达载体的构建及其体内表达

用高保真PCR法分别从中国狼山鸡基因组DNA中扩增出卵清蛋白基因(ov)的5′和3′调控区,将其克隆入pGEMT载体,经序列测定证明与已发表的ov基因相应区域无差异。将上述调控序列插入黏粒载体,构建成鸡输卵管特异表达载体pOV。再将lacZ报告基因克隆在上述载体5′调控区的下游,获得的重组载体命名为pOVlacZ。用脂质体包裹的pOVlacZ注射产蛋鸡,RTPCR检测结果表明lacZ基因仅在注射鸡输卵管的膨大部表达,不能在肝、脾、肾、心等组织表达。在上述组织中,仅输卵管膨大部能检测出β半乳糖苷酶活性(1167mUml),注射雌激素对报告基因的表达具有促进作用(1533mUml),重组酶能被分泌到鸡蛋的蛋清中(1733mUml)。结果表明,克隆的鸡ov基因调控区能有效驱动报告基因在输卵管的特异表达,构建的载体能用于鸡输卵管生物反应器的研制。     

大肠杆菌和酵母表达系统的研究进展

20世纪70年代以来,分子生物学及基因组学迅猛发展,其在生物及医学领域发挥着越来越重要的作用。在发酵工业中,分子生物学技术广泛应用于菌种的遗传改造和基因工程菌株的构建,以期提高发酵产物的产量并丰富发酵产物的类型。其中,利用原核及真核表达系统进行外源基因的扩增、表达以生产蛋白疫苗、核酸疫苗和酶制剂等是近十年来发酵工业的新兴领域。本文从表达载体和宿主菌改造两方面综述近些年来大肠杆菌及酵母表达系统的新进展与新技术。     

鸡输卵管特异表达载体的优化及体内表达

为了实现鸡输卵管特异表达载体在相应组织特异高产表达, 并简化质粒DNA的制备过程, 本研究在已经构建的鸡输卵管特异表达载体pOV1基础上进行了优化改造, 为进一步进行重组药物蛋白的暂态表达及转基因鸡研究奠定基础。首先用限制性内切酶将克隆在pOV1载体的鸡卵清蛋白基因5￠-和3￠-调控区切出, 同时克隆到切除neo基因及CMV启动子的pcDNA3.0载体, 构建成另一输卵管特异表达载体pOV2; 将鸡卵清蛋白基因5￠-调控区单独克隆入同样载体, 获得第三个鸡输卵管特异表达载体pOV3。为了检验三个输卵管表达载体驱动外源基因在鸡体内输卵管细胞中表达的有效性和特异性, 将LacZ报告基因分别克隆入pOV1、pOV2、pOV3中5'-调控区的下游, 获得的重组载体pOV1LacZ、pOV2LacZ和pOV3LacZ经聚乙烯亚胺包裹后, 经翅静脉注射产蛋鸡。用RT-PCR和酶活性检测法对LacZ基因在载体注射鸡体内的表达进行检测, 结果显示肝、脾、肾、心等组织中无LacZ基因的表达, 而输卵管膨大部不仅有LacZ基因的表达, 而且表达的重组酶能分泌到蛋清中, 雌激素注射对报告基因的表达具有促进作用, 其中pOV3LacZ的表达水平较高。这些试验结果表明, 鸡输卵管特异表达载体pOV3具有结构相对简单、表达水平较高、组织特异性较好等优点, 能用于鸡输卵管生物反应器的研制。     

Expression of glucose transporters in cancers

It has been known for 80 years that cancer cell growth in an energy-related process supported by an increased glucose metabolism. This phenomenon suggests a need for a corresponding increased uptake of glucose across the plasma membrane through an enhancement in the glucose transporter proteins, SGLT proteins as well as GLUT proteins. The results of many studies have demonstrated that the expression of glucose transporters, especially GLUT1, is increased in a variety of malignancies. GLUT1 overexpression has been found to be associated with tumor progression. It was found that GLUT1 overexpression is associated with poor overall survival in various malignant tumors.     

鹿茸富脯氨酸多肽-APRP基因融合表达载体的构建及表达

目的:构建鹿茸富脯氨酸多肽(APRP)基因融合表达载体,并诱导表达融合蛋白GST-APRP。方法:以鹿茸顶端组织总c DNA为模板,PCR方法扩增目的片段,连接p MDTM18-T载体,转化E.coli DH5α进行TA克隆。酶切与测序鉴定合格后,将目的片段与p GEX-6P-1质粒连接,完成p GEX-6P-1-APRP融合表达载体的构建。利用原核表达系统进行初步诱导表达。SDS-PAGE蛋白电泳检测蛋白表达情况。结果:PCR成功扩增出目的基因片段,目的基因片段大小为216 bp。提取表达载体质粒经酶切及测序分析证实p GEX-6P-1-APRR融合表达载体构建成功。利用终浓度为0.5 m MIPTG诱导,融合蛋白成功表达,分子量为35 k Da。结论:目前利用基因工程技术获得特定的鹿茸多肽的报道很少。本研究结果表明,利用原核表达系统可在体外对鹿茸富脯氨酸多肽基因(APRP)进行融合表达,并且融合蛋白GST-APRP以可溶形式表达,有利于进一步研究APRP。这也为研究其他鹿茸多肽单体成分提供重要参考。     

小鼠白细胞介素33真核表达质粒的构建及表达

克隆小鼠IL-33基因构建其真核表达质粒,并转染COS-7细胞检测其表达。提取C57BL/6小鼠肺组织总RNA,经反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增小鼠IL-33基因,酶切后插入pcDNA^TM3.1/myc HisA构建其真核表达质粒pcDNA-3.1-IL-33,重组质粒转染COS-7细胞,RT-PCR和免疫印迹法（western blotting）检测目的基因表达。结果显示,pcDNA3.1-IL-33中插入的片段序列测定结果与小鼠IL-33cDNA序列一致,重组质粒转染COS-7细胞后检测到相应mRNA及蛋白表达。成功克隆了小鼠IL-33基因cDNA,并构建其真核表达质粒。