O139霍乱弧菌质粒基因组文库的建立及O抗原基因的筛选

合成O-抗原的基因是串联在一起的一个基因簇,提取O139霍乱弧菌基因组DNA,限制性内切酶EcoRⅠ酶切,电泳回收4～20kb的DNA片段,构建质粒基因组文库.随机筛选重组克隆,获得一株可与O139霍乱弧菌抗血清发生凝集反应的重组克隆,命名为大肠杆菌DH5a(pMG320).经鉴定分析重组克隆所表达的O-抗原具有良好的免疫原性及反应原性.酶切分析质粒pMG320,推知其O-抗原基因大小约4.6kb.这为今后O139霍乱疫苗的研制及O139霍乱弧菌O-抗原基因的结构和功能研究提供了条件.     

O139霍乱弧菌质粒基因组文库的建立及O抗原基因的筛选

合成O抗原的基因是串联在一起的一个基因簇,提取O139霍乱弧菌基因组DNA,限制性内切酶EcoRⅠ酶切,电泳回收4～20kb的DNA片段,构建质粒基因组文库。随机筛选重组克隆,获得一株可与O.139霍乱弧菌抗血清发生凝集反应的重组克隆,命名为大肠杆菌DH5α(pMG320)。经鉴定分析重组克隆所表达的O抗原具有良好的免疫原性及反应原性。酶切分析质粒pMG320,推知其O抗原基因大小约4.6kb。这为今后O.139霍乱疫苗的研制及O.139霍乱弧菌O抗原基因的结构和功能研究提供了条件。     

霍乱弧菌脂多糖O抗原基因在大肠杆菌中的克隆及表达

经典生物型及埃尔托生物型霍乱弧菌的染色体DNA片段分别与载体质粒pUC18,B.S(M13~+)进行克隆,从克隆株中筛选到能表达霍乱弧菌脂多糖O抗原基因的重组子。它们所表达的脂多糖O抗原具有很好的抗原性及免疫原性,其重组质粒pMG-301、pMG-302经酶切分析表明,外源片段大小分别为8.4kb,7.6kb,较文献报道的16kb要小,而且基因结构之间也存在很大差异。     

O139霍乱弧菌LPS基因在大肠杆菌中的克隆和表达

利用粘粒载体pCOS5构建了国内分离的O139霍乱弧菌的基因组文库,并从文库中筛选获得可以表达O139霍乱弧菌脂多糖的重组克隆株E.coliJM109(pMG310)。重组粘粒pMG310经酶切分析,所克隆的外源DNA片段大小为37kb。实验证明：重组克隆株E.coliJM109(pMG310)所表达的脂多糖具有良好的免疫原性及反应原性。     

变铅青链霉菌启动子的克隆和表达

利用启动子探测质粒pIJ486(Tsr~(?) Neo~(?))将变铅青链霉菌(streptomyces lividans)TK24染色体DNA的BamHI酶切片段插入pIJ486的BamHI位点。获得4个硫链丝菌肽抗性、新霉素抗性的重组质粒。它们分别命名为pMGI(10.6kb)、pMG40(7.6kb)、pMG50(10.8kb)和pMG88(7.92kb)。BamHI酶切分析及再转化试验表明,新霉素抗性的恢复确实来自载体的外源插入序列。用BgⅢ酶切已将pMG40的插入序列缩小到0.78kb的pMG40-2,pMG50的插入序列缩小到2.2kb的pMG50-25,仍保留启动子活性。重组质粒pMG50-25的新霉素抗性水平高达90μg/ml(卡那霉素抗性水平为500μg/ml),表明这是一个活性很强的启动子。     

贺氏福氏5型菌外膜蛋白ipa BC基因的高效表达及其免疫保护作用的研究

本文从一次克隆重组质粒pMG488中酶切回收了3．3kb的ipa Bc结构基因,将它在不同的位点插入带有PRPL启动子的载体pBV220中,构建了两种高表达重组质粒pMG501及pMG601。在大肠杆菌DH55a和无毒性福氏5M90TA菌中均获得了b、c多肽的高水平表达,初步的小鼠免疫攻毒试验显示b,c多肽可能有一定的免疫保护作用。     

霍乱弧菌染色体基因文库的构建

利用限制性内切酶Ｓａｎ３Ａ将霍乱弧菌１７８（埃尔托生物型,小川血清型）染色体ＤＮＡ进行部分酶切后,分离２０～５０ｋｂ的ＤＮＡ片断,与经过ＢａｍＨＩ酶切的柯斯质粒ｐＨＣ７９连接重组,通过体外包装系统形成噬菌体颗粒,感染受体菌Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１,构建成霍乱弧菌１７８染色体基因文库。为霍乱弧菌中未知基因的克隆及其它研究打下了基础。     

人淋巴细胞CD2基因5’侧翼序列的克隆和鉴定

本文报告以ＣＤ２ｃＤＮＡ５’端的片段作探针,从人Ｔ淋巴细胞基因组文库筛选阳性重组克隆,经限制性内切酶降解和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析,证明其中一个阳性克隆的插入片段中含ＣＤ２基因５’侧翼顺序。经插入片段的亚克隆、限制性内切酶图谱及ＤＮＡ序列分析,鉴定出一含转录起始点及其上游序列的４．０ｋｂ片段。将此片段中含转录起始点和两个ＤＮ（ａｓｅ）Ⅰ高敏感位点的２．５ｋｂ片段定向克隆到以虫萤光素酶为报告基因的表达载体ｐＭＧ３中,并用限制性内切酶对此２．５ｋｂ片段作不同程度缺失,构成一系列突变子。这些重组的表达质粒转染人ＪｕｒｋａｔＴ细胞后,以瞬时表达实验分析各突变子驱动虫萤光素酶基因的表达,结果发现在ＣＤ２基因５’上游具有很弱的启动子活性,初步测定该启动子位于－１．２ｋｂ～－９８ｂｐ域。ＣＤ２基因具有弱启动子、强增强子的特点与Ｔ细胞表面其它抗原分子基因是相似的。     

用PCR扩增和克隆马立克氏病病毒糖蛋白D基因

用ＰＣＲ技术,从ＧＡ株马立克氏病病毒（ＭＤＶ）感染的成纤维细胞（ＧＥＦ）基因组ＤＮＡ中扩增出ＭＤＶ糖蛋白Ｄ（ｇＤ）抗原基因片段的约１３００ｂｐ编码序列,将该ｐｃＲ扩增的产物于ＥｃｏＲＩ和Ｋｐｎｌ位点克隆到ｐＵＣ１８质粒载体中,在以ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（ｄｉｇ）标记的ｇＤＰＣＲ产物作为探针,进行原位杂交初步筛选到阳性重组质粒克隆,再根据酶切分析筛选到含ＭＤＶｇＤ基因的重组质粒ｐ１８ＭｇＤ。将ｐ１８ＭｇＤ质粒ＤＮＡ用ｄｉｇ标记后,在Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ中,该探针能识别ＭＤＶ基因组ＤＮＡ的ＢａｍＨＩ－Ａ克隆中的Ａ片段ＤＮＡ。酶切位点分析表明,该ｇＤ克隆也和已发表的ＭＤＶ的ＲＢＩＢ株ｇＤ一样,不含有ＥｃｏＲⅠ、ＨｉｎｄⅢ、ＰｓｔⅠ、ＳｍａⅠ、ｐｖｕⅡ等酶切位点。证明该重组质粒是ＭＤＶｇＤ克隆。     

枯草杆菌启动子—信号肽序列的克隆及序列分析

利用含红霉素抗生基因和缺启动子－信号肽序列的氨苄青霉素抗性基因的双功能质粒ｐＧＰＢ１４为探针载体,克隆了枯草杆菌的启动子－信号肽序列并对克隆的片段进行序列分析。枯草杆菌染色体ＤＮＡ经Ｓａｕ３Ａ酶解后与ＢａｎＨＩ酶切的质粒ｐＧＰＢ１４连接,转化大肠杆菌Ｃ６００,筛选抗氨苄青霉素及抗红霉素的转化子,从双抗性转化子中提取重组质粒并经酶切分析,显示克隆的ＤＮＡ片段在０．２７－１．５ｋｂ之间。用Ｓａｎｇｅｒ     

肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段在大肠杆菌中克隆的研究

在大肠杆菌中克隆肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段,为P1蛋白基因片段的扩增、表达及探讨羧基端基因片段功能打基础.采用PCR扩增方法获取P1结构基因.扩增产物用SalI和EcoRI酶切消化,回收1kb大小的DNA片段并与pUC19DNA连接,转入大肠杆菌JM109菌株.用X-gal平板及质粒图谱分析方法筛选重组克隆株,再用限制性核酸内切酶酶切图谱分析鉴定.经PCR扩增MPDNA获得1条5.0kbDNA片段.重组质粒限制性内切酶指纹图谱显示出2条带,1条为pUC19载体DNA带,另1条是1kb的插入片段.实验获得肺炎支原体P1蛋白结构基因及含P1蛋白羧基端DNA片段的重组克隆株.     

麦迪霉素4″—O—丙酰基转移酶（mpt）基因结构的研究

对含有麦迪霉素４″－Ｏ－丙酰基转移酶（ｍｐｔ）基因的ＢａｍＨＩ－ＢａｍＨＩ８．０ｋｂ的ＤＮＡ片段进行限制性酶切分析,绘制出了含有２１个酶切位点的限制性酶切图谱。以含有碳霉素异戊酰基转移酶基因（ＣａｒＥ）的２．４ｋｂ ＤＮＡ片段为探针,经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分子杂交,将ｍｐｔ定位于一个ＥｃｏＲＩ－ＥｃｏＲＩ－ＰｓｔＩ３．０ｋｂ的ＤＮＡ片段上,将该片段克隆至大肠杆菌／链霉菌穿梭质粒载体ｐＷＨＭ３     

犬细小病毒中国内蒙株VP2基因克隆及序列分析

从我国内蒙古地区流行的犬细小病毒病病犬的肠溶物中分离提纯犬细小病毒（ＣＰＶ）。提取病毒基因组ＤＮＡ,并以此ＤＮＡ为模板,采用人工合成的引物进行ＰＣＲ扩增,ＰＣＲ产物经ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ双酶切后,克隆于ｐＵＣ１９质粒的ＢａｍＨＩ／ＳａｃＩ位点。重组质粒ｐＵＣＶＰ２经ＰＣＲ鉴定、限制酶切分析和序列分析,结果表明：获得了犬细小病毒内蒙株（ＣＰＶ－ＩＭ）ＶＰ２基因的全长克隆,ＶＰ２基因全长１７５５ｎｔ,     

O139霍乱弧菌生物学特性研究

１９９２年以来,许多国家和地区先后暴发了Ｏ１３９霍乱大流行。本文从微生物学和分子遗传学的角度对来自不同地区的四株Ｏ１３９霍乱弧菌的生物学特性进行了研究。结果表明四株Ｏ１３９霍乱弧菌均呈典型弧形、单端单鞭毛,培养要求不高、耐碱,固体平板上菌落呈不透明。电镜下显示有菌毛、荚膜结构。有较广的抗生素敏感谱及霍乱Ｈｅｉｂｅｒｇ氏Ⅰ群的糖发酵能力。ＤＮＡＧ＋ＣＭＯＬ％测定值均在霍乱弧菌范围之内且数值接近。质粒图谱检测发现四株中有三株含有一个４．１０ＭＤａ大小的质粒,而另一株不含质粒。Ｏ１３９霍乱弧菌的生物学特性大多数与Ｏ１群菌相似,两者重大的区别在于Ｏ１３９菌具荚膜结构。     

用PCR技术克隆细小病毒H－1部分非结构蛋白基因

应用ＰＣＲ技术定向克隆了细小病毒Ｈ－１的非结构蛋白（ＮＳ）部分基因片段。自行设计并合成了ＰＣＲ引物△Ｐ３和△Ｐ４,在两个引物中分别引入两个突变碱基,使扩增后的ＤＮＡ片段的两端含有限制性核酸内切酶ＨｉｎｄⅢ或ＢａｍＨＩ的酶切位点,经双酿切法把该ＤＮＡ片段重组到ｐＵＣ１１８质粒中。对插入片段的ＤＮＡ序列测定和分析结果证实该片段为Ｈ－１ＮＳ－１基因序列。以此重组质粒为探针,采用分子杂交的方法,分别测定了Ｈ－１及ＭＶＭＤＮＡ在细胞内的复制水平。这一基因的克隆为制备Ｈ－１的质量监测、Ｈ－１及ＭＶＭＮＳ－１蛋白抑瘤作用机理及其在肿瘤细胞及正常组织中的转录表达等研究奠定了基础。     

人促红细胞生成素基因组基因的克隆及全序列分析

为了克隆到全长的人促红细胞生成素基因,从而在真核系统中及转基因动物乳腺中进行表达,从一个中国人的血细胞中提取基因组ＤＮＡ,构建了不完全基因组噬菌体文库,文库效价为５×１０４．这种文库的构建方法是用ＢａｍＨⅠ对基因组ＤＮＡ进行完全酶切,回收１０．５ｋｂ左右的酶切片段,插入到λ－噬菌体ＥＭＢＬ３载体中．筛选文库所使用的探针是用ＰＣＲ方法从基因组ＤＮＡ模板中扩增的５５６ｂｐ的ＥＰＯ基因片段．从该文库中筛选到了一个含有完整ＥＰＯ基因的插入片段长度为１２．５ｋｂ的阳性克隆．经全序列分析证实,所克隆的ＥＰＯ基因编码正确,但在５′－侧翼及第一内含子处与国外发表的序列相比较,发现两处核苷酸差异,这两个核苷酸的差异改变了５′－调控区的两个小的开放阅读框——ＯＲＦ１和ＯＲＦ３,其在基因表达调探方面的作用值得进一步探讨．     

酪氨酸羟化酶基因载体－pCMVTH 质粒的构建及在大鼠骨骼肌内的表达

为用转基因方法治疗巴金森氏病大鼠模型,本研究采用分子克隆技术,将合成多巴胺的关键酶－酪氨酸羟化酶（ＴＨ）的基因,克隆进入以巨细胞病毒ＣＭＶ为启动子的载体质粒内,经限制性内切酶定位分析证实该重组的ＤＮＡ质粒的可靠性。携带ＴＨ基因的ＰＣＭＶＴＨ质粒以ＬＩＰＯ－ＦＥＣＴＩＮ介导,在培养的原代骨骼肌细胞中高效表达。本研究为进一步用转基因的细胞植入脑内以治疗巴金森氏病打下一定基础。     

南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)基因在乳酸乳球菌MG1363中的整合及表达

根据南极假丝酵母脂肪酶B (CALB)的基因序列将CALB基因进行TA克隆、酶切鉴定及测序后,亚克隆至大肠杆菌-乳酸乳球菌穿梭表达栽体pMG36e-Nisl中,构建重组表达栽体pMG36e-Nisl-CALB.设计特异性引物P3和P4,对重组质粒pMG36e-NisI-CALB进行红霉素抗性基因的敲除,以构建食品级表达载体pMG36N-CALB,后再将两种重组质粒分别电转化入乳酸乳球菌MG1363,以Nisin为选择压力,考察CALB在MG1363中的表达情况.结果显示,成功构建了表达载体pMG36e-NisI-CALB及pMG36N-CALB,两株重组菌在含有20 IU Nisir/mL的培养基中均生长情况良好,遗传性能稳定,且经水解圈鉴定,CALB能够进行活性表达.进一步研究发现,CALB基因整合到乳酸乳球菌MG1363染色体中.     

柯萨奇B3病毒结构和非结构蛋白基因重组质粒的构建及其在体外真核细胞中的

制备ＣＶＢ３结构蛋白和非结构蛋白重组质粒ＤＮＡ疫苗时,采用ＲＴ－ＰＣＲ从ＣＶＢ感染的ＨｅＬａ细胞中扩增ＶＰ１、ＶＰ２、２Ａ和３Ｄ基因,重组入真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３中,构建ｐｃＤＮＡ３／ＶＰ２、ｐｃＤＮＡ３／ＶＰ１、ｐｃＤＮＡ３／２Ａ和ｐｃＤＮＡ３／３Ｄ重组质粒,经酶切和测下实扩增的序列并将各重组质粒体外转染真核细胞ＣＯＳ－７,用ＲＴ－ＰＣＲ检测ｍＲＮＡ的转录,用Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测表达产物。结果４种重组质粒酶切出相应大小的目的片段,经测序证实为ＣＶＢ３相应序列,Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ证实能够在体外真核细胞中表达。本文成功构建ＣＶＢ３结构与非结构蛋白的重组质粒ＤＮＡ疫苗,为进一步研究其免疫效果奠定了基础。     

霍乱弧菌脂多糖基因在大肠杆菌中的克隆

利用柯斯质粒pHC 79为载体,构建了霍乱弧菌178(埃尔托生物型,小川血清型)染色体基因文库。经血清凝集试验及菌落固相ELISA检测,从基因文库中筛选到13株能够表达霍乱弧菌脂多糖O抗原的阳性克隆。经热酚水法从转化于中提取并纯化的脂多糖能与霍乱弧菌抗血清发生特异性结合。针对重组柯斯质粒PMM—VO 38进行了多种酶切分析,测定其分子量为46kb。