大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的克隆、表达及初步纯化

为研究大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（LTB）的佐剂活性。从大肠杆菌中调出LTB的原始基因,将该基因克隆、构建pET21b—LTB表达载体、转化大肠杆菌B121（DE3）进行表达,并对表达产物进行初步纯化;经DNA测序、SDS—PAGE、ELISA检测,结果表明成功构建了能够稳定表达可溶性LTB的菌株,并获得初步纯化LTB的方法。为今后LTB的研究及应用奠定了基础。     

霍乱弧菌及其毒素的单克隆抗体

淋巴细胞杂交瘤技术和单克隆抗体(McAb)已经广泛地应用于细菌学研究中。目前,国内外研究制备的抗霍乱孤菌脂多糖(LPC)和抗霍乱弧菌肠毒素(CT)及其亚单位的McAb达100多株,为霍乱弧菌抗原分析、CT及其亚单位的结构与功能研究以及与大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)的鉴别等,提供了有力的工具。     

重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位基因表达系统构建

从E .coli 4 4 815株基因组DNA中扩增不耐热肠毒素B亚单位 (LTB)基因并分析了核苷酸序列 ,构建pET32a的LTB表达载体 ,在E .coliBL2 1DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达 ,采用SDS PAGE鉴定表达产物。克隆的LTB基因与报道的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为 99.12 %～ 99.71%和 97.5 8%～ 99.19% ,pET32a LTB BL2 1DE3系统表达的rLTB量约占细菌总蛋白的 30 %。     

工程菌产霍乱肠毒素B亚单位的纯化

 本实验室使霍乱肠毒素(CT)B亚单位基因在大肠杆菌中获得表达,并能分泌到胞外。将该菌株培养物上清经过超滤浓缩后,用偶联上霍乱毒素IgG的CNBr-Sepharose 4B进行亲和层析,得到表达产物霍乱毒素B亚单位纯蛋白。经PA-GE、HPLC及琼脂免疫扩散等方法鉴定证明该蛋白与天然霍乱肠毒素B亚单位完全相同。     

大肠杆菌肠毒素的研究

大肠杆菌产生不耐热肠毒素(LT),国内外报道较多,而产生耐热肠毒素(ST),国内尚未见报道。近年来,我们从急性腹泻病人粪便分离的菌株进行了肠毒素的研究。其结果如下。     

重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的中试发酵及纯化工艺

重组基因工程菌经中试发酵后,诱导表达出以包涵体形式存在的重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)蛋白。采用Q Sepharose High Perfomance阴离子交换层析,将洗涤、裂解后得到的可溶性蛋白进行纯化,得到纯度高达98%的重组LTB蛋白。利用Sephadex G-25分子筛层析法将重组LTB蛋白中的盐和尿素脱去,使蛋白复性,最终获得目的蛋白纯度为95%。将得到的重组LTB蛋白进行免疫双扩散实验,结果表明此蛋白具有良好的生物学活性。通过高效表达重组LTB蛋白的大肠杆菌发酵,确定了其中试发酵工艺,并建立了Q柱一步纯化即可获得目的蛋白的方法,该工艺简捷、高效、易于工业化生产,为重组LTB蛋白的生产和应用奠定了基础。     

人产肠毒素大肠杆菌ST、LT—B肠毒素基因融合的研究

将人产肠毒素大肠杆菌(ETEC),编码耐热肠毒素(ST)的基因片段与编码不耐热肠毒素B亚基(LT—B)的基因进行融合,并在此基础上进行不同数目sT基因的串联,ELJlSA检测融合基因表达蛋白产物观察到sT与LT－B之间存在着相互影响。ST的检测滴度随基因串联个数增加而逐渐升高,而LT的ELISA滴度则减弱。说明了ST可以通过基因串联提高表达产物抗原活性,这为产肠毒素大肠杆菌多价疫苗的研制提供了重要的研究基础。     

霍乱毒素和大肠埃希菌肠毒素的免疫调节作用

一般都知霍乱毒素和产毒性大肠矣希菌（大肠杆菌）不耐热肠毒素具有很强的免疫原性,这些细菌肠毒素的Ｂ亚单位尚有促进免疫耐受性的免疫调节作用,现综述这些有关分子调节白细胞群体的机制。     

人产肠毒素大肠杆菌ST、LT—B肠毒素基因融合的研究

将人产肠毒素大肠杆菌(ETEC),编码耐热肠毒素(ST)的基因片段与编码不耐热肠毒素B亚基(LT-B)的基因进行融合,并在此基础上进行不同数目ST基因的串联,ELISA检测融合基因表达蛋白产物观察到ST与LT-B之间存在着相互影响。ST的检测滴度随基因串联个数增加而逐渐升高,而LT的ELISA滴度则减弱。说明了ST可以通过基因串联提高表达产物抗原活性,这为产肠毒素大肠杆菌多价疫苗的研制提供了重要的研究基础。     

柯萨奇病毒A16型VP1亚单位疫苗构建

柯萨奇病毒A16型(coxsackievirus A16, CVA16)属于小RNA病毒科肠道病毒属,是手足口病(hand foot and mouth disease, HFMD)的主要病原体之一。近年来发现,CVA16感染的病患可引起脑部、肺部和心脏等的继发感染,甚至还可能引发肺炎、心肌炎和难治性休克等致死性并发症。大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit, LTB),可作为特异性抗原的黏膜佐剂,用以增强特异性抗原的血清IgG抗体应答。大肠杆菌Ⅱ型不耐热肠毒素B亚单位(Escherichia coli type-Ⅱheat-labile enterotoxin B subunit, LT2B)具有比LTB更强的佐剂活性。本实验对CVA16VP1与LT2B融合蛋白作为抗原的免疫原性的研究,将初步评价产生的抗体的抗体效价,为进一步研究柯萨奇病毒的新型疫苗奠定基础。本研究构建pET32-CVA16VP1-LT2B融合表达载体,诱导表达CVA16VP1-LT2B蛋白,用于免疫小鼠,采取血清,检测特异性抗体效价。结果表明,本研究成功构建了pET32-CVA16VP1-LT2B融合表达载体,并成功提取到纯化的CVA16VP1-LT2B蛋白,间接ELISA检测出抗体效价为1∶800。     

人产肠毒素大杆菌ST,LT—B肠毒素基因融合的研究

将人产肠毒素大肠杆菌,编码耐热肠毒素的基因片段与编码不耐热肠毒素Ｂ亚基的基因进行融合,并在此基础上进行了不同数目ＳＴ基因的串联,ＥＬＩＳＡ检测融合基因表达蛋白产物观察到ＳＴ与ＬＴ－Ｂ之间存在着相互影响。     

B型肉毒毒素保护性抗原Hc在大肠杆菌中的可溶性高表达

目的：通过序列优化及表达条件改进,在大肠杆菌中高效可溶性表达B型肉毒毒素保护性抗原He（Bont／B-He）。方法：对Bont／B-He基因片段优化,用大肠杆菌常用密码子替换稀有密码子,并将（C＋C）含量由76．2％降至56-3％;人工合成多条具有重叠互补序列的寡核苷酸片段,采用重叠延伸PCR方法获得了Bont／B-He的全长基因,并构建了原核可溶性表达载体;将经酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌B121（DE3）感受态细胞,用IPTC诱导Bont／B-He的表达并进行纯化及Western印迹鉴定。结果和结论：目的蛋白在大肠杆菌B121（DE3）中获得了可溶性高表达,占菌体裂解液上清总蛋白的26．7％,表达量达到30mg／L,是目前国内外已知表达的最高水平;经Ni柱一步纯化后,目的蛋白纯度可达到80.3％,为肉毒毒素中和抗体的制备及亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

大肠杆菌O157噬菌体中vt2基因A、B亚单位的克隆与序列分析

根据GenBank中毒素基因 vt1、vt2序列设计合成 4 对引物,以大肠杆菌 O157 菌株 DNA为模板,扩增 vt1、vt2,从只含有vt2的菌株中诱导释放噬菌体,以噬菌体DNA为模板进行PCR扩增,获得vt2、vt2 A、vt2 B 3条特异性DNA带;将 vt2 A、vt2 B扩增产物纯化后,分别插入 pMD18 T载体,测序结果与相应序列比较,vt2 A和 vt2 B亚单位的基因序列与 GenBank中编码 VT2 毒素的 A、B亚单位的核苷酸序列(X07865,NC_002655, BA000007,AF291819)的同源性分别为98%~99%、96%~100%,确定 vt2 位于噬菌体,并为进一步研究大肠杆菌 O157 中VT噬菌体的毒力转导、VT2毒素的表达和应用奠定基础。     

产肠毒素大肠杆菌亚单位疫苗3STaM(G)-K99和3STaM(S)-K99的纯化及其免疫学性质的研究

产肠毒素大肠杆菌(ETEC)是一种导致新生犊牛和仔猪腹泻的主要病原体之一.ETEC的毒力因子主要有黏附素(CFs)、不耐热性肠毒素(LT)和耐热性肠毒素(ST)三种.在前期研究中,利用PCR和酶切连接技术成功构建了两种ETEC亚单位疫苗3STaM (G)-K99和3STaM(S)-K99,且在大肠杆菌中获得高效表达.本研究利用阴离子交换层析纯化融合蛋白3STaM (G)-K99 and 3STaM(S)-K99,辅以弗氏佐剂免疫新西兰大白兔,通过Elisa分析其免疫学性质,并利用肠毒素中和实验在昆明系乳鼠中评价其激发抗STa中和抗体的能力.实验结果表明:亚单位疫苗3STaM(G)-K99 and 3STaM (S)-K99能够激发相对较高水平、可针对天然STa、ETEC和融合蛋白STa-K99的特异性抗体.其次,亚单位疫苗中STa突变体(STaM)组分的肠毒素活性显著降低,且其所激发的特异性抗体属于中和抗体,能有效抑制天然STa的肠毒素活性.亚单位疫苗3STaM (G)-K99 and 3STaM(S)-K99为研制预防ETEC感染性腹泻的多价基因工程疫苗提供了基本素材和理论指导.     

肠毒素型腹泻活疫苗菌株的构建

将不耐热的肠毒素基因克隆,在限制性内切酶Xba I位点加入4对核苷酸,由于密码阅读框移位,使肠毒素的活力中心A亚单位结构改变,而具抗原性的B亚单位仍保持原状。改造后的肠毒素基因与载体pBR322、pGA22的一部分及pED100的tra基因相连接,得质粒pBRC21、pPMC4及pPMC5,均可指导合成无毒肠毒素LTA~-B~+,其抗原效价为天热肠毒素菌株的30倍左右。用转化或诱动的方法将pPMC4引入从猪分离并能在猪肠道内滞留定居的菌株中;大部分菌株用接合的方法引入pPMC5,共得30多个株菌,可用于制备猪痢口服活菌疫苗。pPMC5还可供构建预防牛、羊和人的痢疾活菌疫苗菌株用。     

对几种细菌不耐热肠毒素的分析

如今已知肠毒素可致腹泻,然而其抗原成份尚未十分清楚。为了探讨各种细菌肠毒素的成份状况而选取大肠杆菌、不凝集弧菌和国际标准产毒株569B等3种细菌的肠毒素作实验观察。现将结果报道如下。     

大肠杆菌纤毛株的调查

大肠杆菌纤毛株大多数能产生耐热肠毒素与不耐热肠毒素,该菌借其纤毛附着在肠壁细胞上,引起感染而致病。菌株的纤毛同时也是一种重要的保护抗原。国外已有用此抗原制备成菌苗,广泛用于接种。为了查明仔猪患黄、白     

霍乱肠毒素A2亚单位15肽(10一24)的合成及其有关生物活性初步测定

本文根据Merrifleld固相方法,人工合成了霍乱肠毒素A2亚单位第10—24位氨基酸序列。合成中采用树脂一氯甲烷为载体,双环己基碳化二亚胺(D．C．C．I)作为连结剂。最终合成产物经过高压液相氨基酸分析证实：含有A。亚单位第10—24位十五个氨基酸组成成分,经初步活性测定证实有抗原性;能激发家兔产生特异性抗体,在琼脂双扩散试验中能产生抗原抗体特异性沉淀反应。它不具有改变血管通透性的毒性活力,小鼠皮肤反应阴性。肠袢结扎试验显示：不引起肠液贮留;当与B亚单位结合后,在肠内可抑制霍乱毒素的作用。     

肠毒素大肠杆菌定居因子CS3和肠毒素融合抗原基因在减毒鼠伤寒沙门氏菌中的共表达

不耐热肠毒素（LT）和耐热肠毒素（ST）是产肠毒素大肠杆菌的主要致病因素,CS3为该菌的优势定居因子,是定居因子CFA/Ⅱ菌毛抗原的共有抗原组分。采用基因操作技术将编码CS3和融合肠毒素蛋白基因转化到减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗侯选株X4072中进行表达。用重组菌株口服免疫小鼠后,免疫动物能产生抗CS3、LT和ST的血清抗体。特别有意义的是,所产生的抗ST抗体能中和天然ST的生物活性。这一结果为研究载体疫苗防治肠毒素大肠杆菌腹泻疾病奠定了基础。     

CTB/CS3融合蛋白与GM1结合能力和免疫原性的分析

免疫霍乱毒素B亚单位（CTB）或肠毒素大肠杆菌（ETEC）定居因子CS3可使人体对ETEC的侵染有保护作用.为探索研制ETEC双组分亚单位疫苗的可行性,利用大肠杆菌诱导表达系统表达了CTB与CS3的融合蛋白（CTB/CS3）.蛋白质印迹结果表明,诱导表达的29 ku蛋白具有CTB和CS3蛋白双重抗原性.经Ni-NTA亲和层析纯化获得重组蛋白CTB/CS3,复性的重组蛋白可以部分形成五聚体并保留了与神经节苷脂GM1的结合能力.动物实验表明,融合蛋白CTB/CS3具有CTB和CS3蛋白的双重免疫原性,同时,CTB的免疫载体作用提高了CS3的免疫强度.