马氏钳蝎的哺乳动物神经毒素的分离和纯化

用CM-Sephadex C-50柱层析法将马氏钳蝎(Buthus martensi Karsch)粗毒分成13个蛋白组分。其中XI峰对哺乳动物(小鼠)、甲壳动物(潮虫科鼠妇属甲壳虫)和昆虫(丽蝇幼虫)都有较强毒性;XII峰对前两类动物有较强毒性;VIII峰对后两类动物有较强毒性。XI峰通过DEAE-Sephadex A-50柱层析被分成XI-1和XI-2两个组分。XI-1峰与XII峰再分别经过Sephadex G-50柱层析被纯化后,经聚丙烯酰胺碱性不连续圆盘电泳和等电聚焦圆盘电泳鉴定均为单一区带。它们都是神经毒素,分别被命名为马氏钳蝎神经毒素I和II。经小鼠腹腔注射,测定粗毒、神经毒素I和II的LD_(50)分别为2.4mg/kg、0.48mg/kg和0.63mg/kg。毒素I有较好的耐热性。工作中还测定了神经毒素I和II的氨基酸组成,它们分别由67和63个氨基酸残基组成,最小分子量分别为7567和7181。     

马氏钳蝎哺乳动物神经毒素Ⅱ的部分氨基酸顺序

用DABITC-PITC双偶合微量手工顺序方法和羧肽酶法,测定了马氏钳蝎哺乳动物神经毒素Ⅱ的N-端和C-端部分氨基酸排列顺序。N-端氨基酸顺序为:H-Val-Arg-Asp-Ala-Tyr-lle-Ala-Asp-Pro-Asn-Asn-(Cys)-Val-Tyr-Glu-(Cys)-Ala-。C-端氨基酸顺序为:-Arg-Ile-Ser-Ile-OH。     

不同产地中华马氏钳蝎神经毒素的分离纯化和部分性质比较研究

经Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－５０,Ｓｐ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ－２５两次柱层析,从没产地的东亚马氏钳歇粗毒中分别得到了一组碱性哺乳动物神经素和一种甲壳类神经毒素,对它们进行的等电点、分子量、动物毒性等部分性质的研究与比较结果表明,淅川、常德与益都产的蝎毒无论在柱层析行为上,还是在等电点、分子量、各组分的毒性大顺序及某些对应组分的结晶行为上有很大相似性,仅存在略微的差异。     

马氏钳蝎毒昆虫类神经毒素的分离、纯化及性质研究

经Sephadex G-50,sp-Sephadex C-25二步柱层析法,从山东马氏钳蝎(Bu-thus martensii Karch)粗毒中分离出四种对美洲(虫非)蠊有强直麻痹反应的毒性蛋白组份。其中二个组分在SDS聚丙烯酰胺电泳和等电聚焦电泳上均呈现单一区带,命名为BmK IT-Ⅰ,BmK IT-Ⅱ其pI分别为8.2和8.4,分子量分别为8400和7560。同时还分析了二个组份的氨基酸组成。经DABITC/PITC双偶合法测定了BmKIT-Ⅰ和BmK IT-Ⅱ的N端部份氨基酸排列顺序,它们分别为H_2NVal.Arg.Asp.Ala……H_2NVal.Arg.Asp.Gly……。 电生理学研究表明,纯化的BmK IT-I(1×10~(-5)g/ml)对(虫非)蠊腹Ⅵ神经节的突触传递有阻断作用,阻断后用生理溶液洗,则突触传递可恢复。从同一蝎毒粗毒中分离纯化的哺乳动物类神经毒素BmKⅢ在浓度高出100倍(1×10~(-3)g/ml)时也可以阻断(虫非)蠊腹Ⅵ神经节的突触传递,但用生理溶液冲洗没有观察到恢复。     

具有中等毒性的马氏钳蝎神经毒素的纯化和初步晶体学…

运用柱层析技术对产自淅川和常德的马氏钳蝎毒素进行分离纯化,得到８种哺乳动物神经毒素。运用制备型等电聚焦电泳技术,对常德样品中具有中等毒性的蝎神经毒素进一步纯化,获得了高纯度样品。两个产地的蝎毒素ＢｍＫ５均已经成功地获得了大晶体。空间群均为Ｐ２１２１２１,晶胞参数分别为：ａ＝３８．４６埃,ｂ＝３７．２８埃,ｃ＝３６．９７埃;ａ＝３８．４４埃,ｂ＝３７．５５埃,ｃ＝３６．８３埃。对两个产地的晶体分别收     

具有中等毒性的马氏钳蝎神经毒素的纯化和初步晶体学研究

运用柱层析技术对产自淅川和常德的马氏钳蝎毒素进行分离纯化,得到８种哺乳动物神经毒素。运用制备型等电聚焦电泳技术,对常德样品中具有中等毒性的蝎神经毒素（ＢｍＫ５）进一步纯化,获得了高纯度样品。两个产地的蝎毒素ＢｍＫ５均已经成功地获得了大晶体。空间群均为Ｐ２１２１２１,晶胞参数分别为：ａ＝３８．４６埃,ｂ＝３７．２８埃,ｃ＝３６．９７埃（淅川）;ａ＝３８．４４埃,ｂ＝３７．５５埃,ｃ＝３６．８３埃（常德）。对两个产地的晶体分别收集了２．１埃（淅川）和１．６２埃（常德）分辨率的衍射数据。     

一种强毒性中华马氏钳蝎哺乳动物神经毒素新晶型的初步晶体学研究

经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０和Ｓｐ－ＳｅｐｈａｄｅｘＣ－２５两次柱层析,从常德马氏钳蝎毒素中分离得到一种强毒性的哺乳动物神经毒（Ｂｍｋｌ）,等电聚焦及ＳＤＳ－电泳显示它为单一组份,其ｐＩ为９．４４,ＭＷ为７．１ＫＤ．毒性试验结果表明,该组份对小白鼠的最小致死刘量为０．５μｇ／ｇ小白鼠,对昆虫及甲壳动物也有毒性．已获得该毒素的一种新晶型的大晶体。其空间群为Ｐ２１２１２,晶胞参数为：α＝８３．４６Ａ,ｂ＝４０．３６Ａ,ｃ＝２４．００Ａ,单位晶胞体积为８０８４２．６９Ａ,一个不对称单位含１个分子,已收集了分辨率为１．７５Ａ的数据．     

两个东亚钳蝎抗哺乳动物神经毒素的cDNA序列

从我国山东东亚马氏钳蝎尾腺中分离纯化ｍＲＮＡ,经逆转录构建了ＢｍＫ蝎毒ｃＤＮＡ文库。利用ＰＣＲ扩增,筛选到两个抗哺乳动物毒素的ｃＤＮＡ基因,并测定了序列。这两个ｃＤＮＡ阅读框均为２５２ｂｐ组成,可翻译８４肽的毒素前体,包括Ｎ端１９个氨基酸组成的信号肽,６４个氨基酸残芭的成熟毒蛋白,以及Ｃ端一个额外的碱性氨基酸Ａｒｇ。其中由一ＣＤＮＡ所推导的氨基酸序列（ＢｍＫＭ１）一已知的天然毒素ＢｍＫ１蛋白序列完     

东亚钳蝎中一个中性哺乳动物神经毒素全长cDNA的克隆和分析

构建了东亚钳蝎毒腺cDNA库,根据东亚钳蝎中性哺乳动物神经毒素BmKM4的氨酸序列设计并合成引物用PCR方法从库中筛选到BmKM4全长cDNA序列。它由5′UTRc、可读框和3′UTR组成。与其他东亚钳蝎哺乳动物神经毒素cDNA的相应区域相比,BmKM4cDNA的5′UTR的高度保守,而其3′UTR则变异较大。AUG的旁侧序列为AAAATGAA,与绝大多数蝎毒素基因一致。在BmKM4mRNApoly(A)属上游17nt处,有一典型的腺苷化信号（AATAAA）。可读框编码84个氨基酸的毒素前体,包括N端19个氨基酸组成的信号肽,中间64个氨基酸残基组成的成熟毒素,以及C末端的额外碱性氨基酸Arg。根据一般规律,尾端Arg在毒素前体的成熟过程中会被切除。     

东亚钳蝎中一个中性哺乳动物神经毒素全长cDNA的克隆和分析

构建了东亚钳蝎毒腺cDNA文库,根据东亚钳蝎中性哺乳动物神经毒素BmKM4的氨基酸序列设计并合成引物,用PCR方法从文库中筛选到BmKM4全长cDNA序列.它由5′UTR、可读框和3′UTR组成.与其他东亚钳蝎哺乳动物神经毒素cDNA的相应区域相比,BmKM4cDNA的5′UTR高度保守,而其3′UTR则变异较大.AUG的旁侧序列为AAAATGAA,与绝大多数蝎毒素基因一致.在BmKM4mRNApoly(A)尾上游17nt处,有一典型的腺苷化信号(AATAAA).可读框编码84个氨基酸的毒素前体,包括N端19个氨基酸残基组成的信号肽,中间64个氨基酸残基组成的成熟毒素,以及C末端的额外碱性氨基酸Arg.椐据一般规律,尾端Arg在毒素前体的成熟过程中会被切除。 Abstract:A full-length cDNA sequence encoding the precursor of a neutral mammalian neurotoxin,BmKM4,was first isolated from a cDNA library made from thc venom gland of Chinese scorpion Buthus martensii Karsch.ABmKM4-specific primer and a primer corresponding to the partial sequence of pSPORT1 vector were used as forward primer and reverse primer,respectively,to screen the cDNA library by PCR reaction.Sequence analysis of positive clones showed that the BmKM4 cDNA is composed of three parts:5'UTR,open reading frame and 3'UTR.Compared with the corresponding regions of other scorpion mammalian neurotoxin cDNAs,the 5'UTR of BmKM4 cDNA is highly conservative versus highly variable for 3'UTR.The lateral sequence of initiation codon (AUG) is AAATGAA which is in consistent with that of most scorpion toxin genes.On the 3'-end,a putative polyadenylation signal (AATAAA) was 1Tnt upstream of Poly (A) tail.The open reading frame encodes a precursor of 84 amino acid residues,including a signal peptide of 19 residues,a mature toxin(BmKM4) of 64 residues,and a basic residue (Arg) tailwhich would be removed in the processing step.     

马氏钳蝎中性神经毒素BmK M4 0.20nm晶体结构测定

BmKM4是一种中性蝎神经毒素,在BmK系列中具有中等毒性,属GroupⅢα-型毒素.纯化样品结晶为六方晶体,空间群为P61.运用X射线衍射分析技术,通过分子置换法在0.20nm分辨率水平测定了BmKM4晶体结构,并对模型结构进行了修正.最后的晶体学R因子为0.142,自由R因子为0.173,模型的标准键长偏差为0.0015nm,标准键角偏差为1.753°.在一个不对称单位里加入了64个水分子.精化的结构显示第10位残基含有1个反常的非脯氨酸顺式肽键.将精化后的结构与GroupⅡα-型蝎毒素BmKM8(酸性弱毒素)的结构进行比较,并以此为基础讨论该cis肽键可能的结构意义.     

马氏钳蝎毒素中多肽BmK4112的分离纯化和一级结？…

对马氏钳蝎粗毒中多肽进行分离纯人级鉴定。应用凝胶过滤、离子交换和ＨＰＬＣ的反相色谱方法分离纯化样品。应用二疏基苏醇（ＤＴＴ）还原,碘乙酸保护法对纯化样品进行修饰,修饰样品经酶解后应用Ｅｄｒｎａｎ降解法,并结合ＥＳＩ－ＭＳ法和串联质谱法（ＭＳ－ＭＳ）分析肽的序列。比较修饰前后的质谱,测定分子中的二硫链数目。分离纯化工获得多肽ＢｍＫ４１１２,其一级结构为ＴＰＹＰＶ ＮＣＫＴＤ ＲＤＣＶＭ ＣＧＬＧＩ     

一种东亚钳蝎碱性神经毒素的纯化和初步晶体学研究

经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０和ＳＰ－ＳｅｐｈａｄｅｘＣ－２５两次柱层析,从河南淅川马氏钳蝎毒素中分得一种碱性神经毒素ＢｍＫＭＩ８．等电聚焦和ＳＤＳ电泳显示单一组分,其ｐＩ为９．１,Ｍｒ为７１００．毒性测试结果表明,该组分对小白鼠有较强的毒性,对昆虫也有一定的毒性,已获得该毒素的两种晶型的大单晶,并测定其空间群为Ｐ２＿１２＿１２＿１,晶胞参数为：ＢｍＫＭＩ８－Ａ：ａ＝３６．７,ｂ＝２６．６,ｃ＝５２．０,ＢｍＫＭＩ８－Ｂ：ａ＝３６．６４Ａ,ｂ＝３７．３１,ｃ＝３７．９５,已收集了ＢｍＫＭＩ８－Ｂ分辨率为１．７４的Ｘ射线单晶衍射数据。     

一种东亚钳蝎碱性神经毒素的纯化和初步晶体学研究

经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０和ＳＰ－ＳｅｐｈａｄｅｘＣ－２５两次柱层析,从河南淅川马氏钳蝎毒素中分得一种碱性神经毒素ＢｍＫＭＩ８。等电聚聚焦和ＳＤＳ电泳显示单一组分,其ＰＩ为９．１,Ｍｒ为７１００,毒性测试结果表明,该组分对小白鼠有较强的毒性,对昆虫也有一定的毒性。已获得该毒素的两种晶全型的大单晶,并测定其空间群为Ｐ２１２１２１,晶胞参数为：ＢｍＫＭＩ８－Ａ：ａ＝３６．７Ａ,ｂ＝２６．６Ａ,ｃ＝５２     

东亚马氏钳蝎(Buthus martensi karsch)蝎毒神经毒素的园二色性研究

本文研究了从东亚马氏钳蝎中纯化的神经毒素BmKⅢ的园二色性,并对不同类型毒素的CD光谱进行了比较.BmKⅢ在水溶液中的近紫外CD谱在274和290nm处显示二正峰,279nm处显示一肩峰.远紫外CD谱在209nm处呈一强负峰,为典型的β-折迭图谱.在中性水溶液中,其主链构象参数分别为4.0%α-螺旋,63%B-折迭,33%无规卷曲和回折.溶液的pH对BmKⅢ的构象影响不大,但分子在碱性溶液中构象的变化较之中性及酸性溶液稍大.温度的升高对其分子的构象有影响,但这种温度诱导的构象变化是可逆的.SDS的加入可诱导β-折迭转变为α-螺旋.在同时存在β-疏基乙醇时,分子的有序结构完全消失.几种不同的哺乳动物神经毒素以及它们同甲壳动物神经毒素的比较研究指出,它们的远紫外CD谱很相似, 但其近紫外CD谱却有差异,尤其是哺乳动物类同甲壳动物类毒素之间差异更大.     

马氏正钳蝎的形态和结构特征

马氏正钳蝎(Mesobuthus martensii)又称东亚钳蝎,是中国最常见的蝎种。针对该蝎种系统性研究相对薄弱的现状,本文通过扫描电子显微镜、体视显微镜、解剖学等手段对马氏正钳蝎的形态结构进行了研究,全面系统地描述了马氏正钳蝎的外部形态和内部结构特征,完善了该蝎种生物学特征的基础数据,特别是对其呼吸系统、生殖系统及毒腺的结构进行了详细的研究,观察和分析了马氏正钳蝎的螯肢、眼睛、步足及听毛、生殖孔、栉齿感受器、书肺、毒腺等结构特征及相关功能,探讨了不同视觉蛋白的差异性表达、感光功能差异性与蝎子生存进化的相关性。     

马氏钳蝎酸性神经毒素(Bmk M8)0.25nm分辨率晶体结构测定

马氏钳蝎中一种酸性弱神经毒素BmK M8的晶体结构测定.BmK M8的X射线衍射数据用面探测器收集,利用碱性蝎神经毒素AaHⅡ的晶体结构作初始模型,取1.5～0.35nm范围的强度数据,应用分子置换法,经交叉旋转函数,PC-refinement和平移函数的计算,确定了BmK M8分子在晶胞中的正确取向和位置,建立初始模型.从该模型提供的初始位相出发,得到了BmK M8晶体的初始相角,采用立体化学制约的最小二乘修正技术在0.8～0.25nm分辨率范围内进行了结构精化.修正结果,最后的晶体学 R因子为0.171,键长标准偏差为 0.0019nm,键角标准偏差为2239°.BmK M8分子由1段两圈半a螺旋(由19～28位氨基酸组成)和3段反平行的β折叠(由2～4,32～37,45～51位氨基酸组成)构成三维折叠的核心,由此核心向外伸出3个Loop区.描述了BmK系列之一的BmK M8分子的肽链折叠特征,辨识出可能存在于所有蝎毒素中的共同的结构模块(Motif),并讨论了保守的芳香残基和荷电残基的空问分布特征及其与毒性的可能关系.这是首次报道一种酸性神经毒素的晶体结构.