用盾叶薯蓣生产薯蓣皂苷元预发酵与水解条件优化

采用RP-HPLC法检测薯蓣皂苷元,对薯蓣皂苷元提取过程中影响产率的多种因素,分预发酵、水解2部分分别用单因素和正交设计的方法进行优化.结果表明:40℃预发酵16 h,加6%浓H2SO4,料液比为1∶6,温度为121～126℃,水解5 h,产率高达3.62%,说明预发酵与水解条件优化可以提高盾叶薯蓣(Dioscorea zingiberensis C. H. Wright)生产薯蓣皂苷元的产率.     

药源植物盾叶薯蓣甾体皂苷及皂苷元的研究进展

盾叶薯蓣是重要的甾体激素类药源植物,其根茎中薯蓣皂苷元含量居薯蓣属植物之冠,为我国的特有种。为了寻找高含量的资源、筛选新的生理活性成分,多年来我国学者做了大量的研究工作。主要概括了盾叶薯蓣的资源分布、薯蓣皂苷元的提取工艺、化学成分、药理、含量测定等方面的研究。     

内生Bacillus svelezensis HBB5菌株发酵盾叶薯蓣产薯蓣皂苷元的研究

目的探讨内生Bacillus svelezensis HBB5菌株发酵宿主植物盾叶薯蓣产薯蓣皂苷元的能力。方法接种内生B.svelezensis HBB5及B.subtilis ATCC 6633菌株(0.35×10~8 CFU/mL)至含盾叶薯蓣地下茎组织的液体培养基,32℃、165~185 r/min连续发酵108 h,检测发酵液细菌、pH、淀粉、麦芽糖、葡萄糖、淀粉酶(α-amylase)及薯蓣皂苷元溶出率等指标。结果内生B.svelezensis HBB5菌株有较强的酸、碱耐受力[pH(4.8±0.2)~(8.4±0.2)],相比B.subtilis ATCC 6633[pH(5.2±0.2)~(8.7±0.2)]差异不明显;前者达峰值生长量(60×10~(8±2) CFU/mL)明显高于后者(32×10~(8±2) CFU/mL)。发酵36~60 h时,B.svelezensis HBB5、B.subtilis ATCC 6633菌株发酵液的淀粉、麦芽糖、葡萄糖浓度达峰值,分别为(37.41±3.12)、(27.83±2.14)ng/mL,(21.06±1.25)、(16.54±1.08)ng/mL,(54.33±3.12)、(36.65±2.10)ng/mL,前者均高于后者。同时,B.svelezensis HBB5菌株维持高的α-amylase酶活性及薯蓣皂苷元溶出率。结论内生B.svelezensis HBB5菌株拥有较强的耐酸碱、降解淀粉、提高薯蓣皂苷元溶出的能力,为工业生产薯蓣皂苷元提供了一个新的方法。     

盾叶薯蓣悬浮培养细胞生长及薯蓣皂苷元合成

研究了盾叶薯蓣细胞悬浮培养过程中细胞生长、薯蓣皂苷元合成、蔗糖和磷酸盐的吸收利用以及酸性磷酸酶活性与薯蓣皂苷元合成的关系。结果表明,对数生长期细胞最大比生长速率μm为0.19 d-1;倍增时间为3.68 d;薯蓣皂苷元的形成与细胞的生长相关,培养6 d时薯蓣皂苷元质量分数和产量分别为0.20%和25.93 mg/L;蔗糖利用率达到95.65%,磷酸盐吸收率达到最大,为90.36%。盾叶薯蓣细胞悬浮培养过程中酸性磷酸酶活性动态变化规律与薯蓣皂苷元的动态合成规律基本一致。此外,研究还发现在相同供磷水平下,酸性磷酸酶活性高低与薯蓣皂苷元合成能力呈正相关;而在不同供磷水平下,酸性磷酸酶活性高低与薯蓣皂苷元合成能力没有相关性。     

盾叶薯蓣中薯蓣皂甙元提取新工艺的研究

为研究新工艺提取盾叶薯蓣薯蓣中薯蓣皂甙元的最佳实验指标,以薯蓣皂甙元得率为评价参数,采用6因素5水平的正交实验,用分光光度法对25种提取方法所得到的薯蓣皂甙元进行比较分析。结果表明,硫酸浓度对薯蓣皂甙元提取的影响最大,在实验室条件下,可采用20g样品加甲醇回流提取4h,回流速度为10min／次,用2．5mol／L的硫酸水解6h,120号溶剂汽油回流提取2h,回流速度为15min／次,能清洁快速提取盾叶薯蓣中的薯蓣皂甙元。     

不同居群盾叶薯蓣生长、叶形态及皂苷元含量的研究

对引自湖北武当山、湖南南部和西北部的12个居群盾叶薯蓣的生长状况及叶形、叶色、叶长、叶宽、叶基、叶张角等12个形态指标进行了观测和比较分析,并测定了各居群的叶和块茎中的皂苷元含量。结果表明：1）在置信水平λ=8.0340时,11个居群可划分成2大类型：①长叶型：主要形态特征为叶片长度大于宽度,中裂片相对较长;②宽叶型：主要形态特征为叶片宽度大于长度,中裂片相对较短;2）不同居群盾叶薯蓣花序数、叶片总数、开花时间、花期长短、茎干重、叶干重等存在显著的差异;3）不同居群皂苷元含量差异也较显著,居群块茎中薯蓣皂苷元含量最高达3.98%（3号）、最低（7号）仅0.33%,而居群叶中约莫皂苷元含量最高达4.27%(4号）、最低（2号）为0.98%。     

盾叶薯蓣营养器官薯蓣皂甙元含量的动态变化

利用高效液相色谱(HPLC)法对盾叶薯蓣营养器官特别造根状茎中薯蓣皂甙元含量的动态变化、品种之间的差异以及雌雄株之间的差异进行了研究。结果表明:实生苗根状茎中薯蓣皂甙元的含量,2年生高于1年生;根茎营养繁殖的2年生根状茎中皂甙元的含量高于1年生的含量;花叶品种的含量高于绿叶品种的含量;雄株的含量比雌株的含量高。在地上的缠绕茎和叶中没有检测到薯蓣皂甙元。由根茎繁殖的1年生根状茎前期皂甙元含量增加缓慢,后期增加较快;2年生根状茎盛花期含量最高,开花后期含量最低,随后含量逐渐增加。为此应在花叶品种中选择产量高、抗性强的品种作为栽培品种。合适的采挖期仍以地上缠绕茎枯萎期为宜。     

盾叶薯蓣中薯蓣皂甙元不同提取方法的比较

为提高盾叶薯蓣(Dioscorea zingiberensis C.H.Wright)中薯蓣皂甙元得率,在实验室条件下,以薯蓣皂甙元含量为评价指标,采用4因素4水平的正交试验,用高效液相色谱法对16种提取方法所得的薯蓣皂甙元含量进行了比较分析.结果表明,硫酸的浓度对薯蓣皂甙元含量有极显著影响,在实验室条件下,可采用10 g样品加2.0mol·L-1硫酸200 mL水解4 h,水解物用石油醚回流提取5 h,能快速准确提取盾叶薯蓣中的薯蓣皂甙元.     

盾叶薯蓣叶片形态多样性研究

盾叶薯蓣不同单株、同株不同部位叶片形态变异较大。利用数量分类和统计的方法,以11个居群的82个盾叶薯蓣单株为材料,对各居群叶片的7个形态特征值进行了测量,并以此计算出5个导出值。统计表明,各个特征值变异很大,相对标准误差均超过了0.2;UPGMA法将82份单株聚为3个大类群,第一组为长叶型,第二组为宽叶型,第三组为普通型,大部分叶片属于第三组。同株不同部位叶片形态差异比较结果表明,基部和中部叶片差异较大,而中部和上部叶片形状接近。同一单株不同部位叶斑纹和叶尖类型相同。     

盾叶薯蓣营养器官薯蓣皂甙元含量的动态变化

利用高效液相色谱(HPLC)法对盾叶薯蓣营养器官特别是根状茎中薯蓣皂甙元含量的动态变化、品种之间的差异以及雌雄株之间的差异进行了研究。结果表明：实生苗根状茎中薯蓣皂甙元的含量,2年生高于1年生;根茎营养繁殖的2年生根状茎中皂甙元的含量高于1年生的含量;花叶品种的含量高于绿叶品种的含量;雄株的含量比雌株的含量高。在地上的缠绕茎和叶中没有检测到薯蓣皂甙元。由根茎繁殖的1年生根状茎前期皂甙元含量增加缓慢,后期增加较快;2年生根状茎盛花期含量最高,开花后期含量最低,随后含量逐渐增加。为此应在花叶品种中选择产量高、抗性强的品种作为栽培品种。合适的采挖期仍以地上缠绕茎枯萎期为宜。     

优化黄姜中甾体皂甙元测定的研究

对传统的黄姜中甾体皂甙元的测定方法进行了改进。提取甾体皂甙元时采用微量样品以氯仿浸提代替传统的回 流抽提法,以Liebemann-Barcharad试剂显色,用分光光度法测定。测定结果准确,高效低成本且步骤简单,应用广泛。     

盾叶薯蓣内生真菌及其对宿主培养物生长和皂苷元生产的影响

从盾叶薯蓣根状茎中分离并鉴定了9株内生真菌,经悬浮培养14d,分别制备灭活菌丝和菌液浓缩物。其中,内生尖孢镰刀菌Dzf17能有效地提高盾叶薯蓣无菌苗和培养细胞薯蓣皂苷元的含量和产率,且灭活菌丝的诱导效果要强于菌液浓缩物。Dzf17灭活菌丝处理无菌苗,薯蓣皂苷元的产率为78.697mg/L,是对照(27.471mg/L)的2.865倍;用Dzf17菌液浓缩物处理无菌苗,皂苷元产率为41.822mg/L,是对照的1.522倍。Dzf17灭活菌丝处理培养细胞,薯蓣皂苷元的产率为1.391mg/L,是对照(0.691mg/L)的2.013倍;用Dzf17菌液浓缩物处理培养细胞,皂苷元产率为1.214mg/L,是对照的1.757倍。结果表明,在盾叶薯蓣无菌苗或细胞培养中添加一定量的内生真菌灭活菌丝或菌液浓缩物对于提高薯蓣皂苷元含量和产量将是一种有效的方法。     

盾叶薯蓣元素组成特点及其与土壤营养元素的关系研究

盾叶薯蓣(Dioscorea zingiberensis Wright)根状茎与地上部分各元素的含量明显不同,根状茎中含镍、铁、磷、铝量远高于地上部分,镁、钙、锰量远低于地上部分;盾叶磐蓣对钾、锌、铁等元素的吸收量大于农作物;根状拳与地上部分的比值(R2／U2)较大;大量元素在根状茎中的含量(A)及地上部分含量(B)的大小排序差别较大,微量元素含量A、B值的大小排序完全一致。盾叶薯蓣根状茎的皂素平均含量为2．87％,皂素含量与土壤有机质、全氮、全磷、全钾、有效铁、有效锌含量关系密切。薯蓣皂素含量高的盾叶薯蓣集中分布在大巴山北坡东段化龙山脉一线。     

盾叶薯蓣环阿屯醇合酶全长基因的克隆与分析

环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase,CAS)是薯蓣皂甙元生物合成途径中的第一个关键酶.以基因组DNA为模板,利用染色体步行和长距离PCR方法首次克隆了盾叶薯蓣CAS全长基因.序列分析比较结果表明,盾叶薯蓣CAS全长基因为7 192 bp,由18个外显子和17个内含子组成.外显子总长为2 280 bp,编码759个氨基酸,最长的外显子为198 bp,最短的为47 bp;内含子总长4 912 bp,最长的内含子为1 551 bp,最短的为68 bp.Southern blot杂交分析表明,CAS基因在盾叶薯蓣基因组中为单拷贝.     

盾叶薯蓣花药培养及单倍体植株的获得

以处于单核期的盾叶薯蓣花药为材料,经愈伤组织途径成功获得单倍体盾叶薯蓣新材料。对盾叶薯蓣花药培养、植株再生过程的研究表明:来自不同居群的外植体对花药愈伤组织诱导有显著影响;W14是适合花药愈伤组织诱导的基本培养基;花药愈伤组织增殖和分化的适宜培养基为:MS基本培养基 BA2.0mg/L IAA0.2mg/L;生根培养基为添加了IBA2.0mg/L、NAA0.4mg/L和0.5g/L活性碳的MS培养基。以流式细胞仪和根尖染色体压片法检查花培植株的结果表明,有8%～12%的个体为单倍体。实验结果为进一步开展单倍体育种及相关理论研究提供了材料和技术基础。     

与盾叶薯蓣细胞共生培养的内生真菌分离及其生物学特性

从盾叶薯蓣根状茎中分离到一株与盾叶薯蓣细胞共生培养的内生真菌（RE0105）。测定了该菌ITS1-5．8S rDNA—ITS2序列并构建了系统发育树,发现RE0105与Libertella属形成一个类群,具有较近亲缘关系。该真菌能产生与宿主植物相同的代谢产物——薯蓣皂苷元。对RE0105培养特性研究表明：富含有机营养的培养基有利于其生长;盾叶薯蓣细胞提取物可明显刺激其生长;20μmol／L生长素NAA和2,4-D能够促进RE0105的生长。200μmol／L细胞分裂素KT和BA对RE0105生长具有一定的促进作用,但与生长素相比,细胞分裂素对RE0105生长的刺激作用较小。蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖、木糖和NH4NO3是RE0105生长的良好C源和无机N源,但NH4Cl和（NH4）2SO4对该菌生长具有明显抑制作用,并且显著影响其形态特征。     

盾叶薯蓣胚乳再生体系的建立及其染色体倍性鉴定

以盾叶薯蓣（Dioscorea zingiberensis）的胚乳为外植体,研究了不同植物生长调节剂对胚乳愈伤组织诱导及植株再生的影响,并鉴定了再生植株。结果表明：愈伤组织诱导形成的适宜培养基为MS＋2.0mg·L^–12,4-D＋0.5mg·L^–16-BA,不定芽分化的适宜培养基为MS＋2.0mg·L^–16-BA＋0.1mg·L^–1NAA,生根的适宜培养基为1/2MS＋0.3mg·L^–1NAA;再生植株炼苗移栽后,成活率可达80%;对获得的再生植株腋芽生长点进行染色体制片观察,发现染色体数目为20的细胞占观察细胞总数的10%,染色体数目为21–29的细胞占16%,染色体数为30的细胞占74%;获得了三倍体植株。