化学合成的DNA定位断裂工具

化学合成的 DNA 定位断裂工具是80年代初发展起来的一种新型非酶 DNA 定位断裂工具.它由 DNA 识别结合系统及化学断裂系统组成,能在人们预先设计的任何位点断裂 DNA 分子,具有制备简便、价格便宜、不受酶的天然专一性限制等优点.可应用于基因分离、染色体图谱分析、大片段基因的序列分析以及 DNA 定位诱变、肿瘤基因治疗与新的化学疗法等分子生物学领域.     

45S rDNA基因的不稳定性及其与转录的相关性

45S rDNA基因由串联重复序列构成,是遗传不稳定性的热点区域,易于发生DNA断裂和重组。以Hela和CHO细胞系为研究对象,运用荧光原位杂交技术检测有丝分裂不同时期的45S rDNA基因的不稳定性表型。结果表明,位点特异性的染色体浓缩失败是其在中期染色体上不稳定性的主要表型。具有这种表型的染色体在后期可能会出现落后或粘连现象,甚至有可能引发断裂,形成卫星核。同时,免疫荧光双染色技术检测表明DNA双链断裂的标记蛋白(γH2AX)和RNA聚合酶I的上游结合因子(UBF)在有丝分裂的不同时期都存在共定位现象。该结果为探讨45S rDNA基因的不稳定性与转录的关系提供了直观的细胞学证据。     

一个新的白血病相关基因LRP16全长cDNA的克隆、序列分析及表达特征

 克隆一个与白血病复发相关基因 (LRP1 6)的全长 c DNA序列 ,对其进行染色体定位、组织表达谱分析 ,并对该基因编码蛋白质进行原核表达 .首先用获得的一段 3kb DNA片段在 NCBI提供的 h ESTs数据库中进行电子杂交并对重叠克隆片段组装 ,再设计引物进行 c DNA末端快速扩增(RACE技术 ) .采用 Northern印迹方法进行组织表达分析 .以高通量基因组序列 (HTGS)数据库为基础进行染色体定位 .对构建的克隆菌用 IPTG诱导重组蛋白表达后进行 SDS- PAGE,同时对重组体测序确证 .钓取了该基因全长 c DNA、推导所编码的氨基酸序列 ,并将该基因定位于染色体1 1 q1 2 .2 .原核表达筛选获得了该基因重组子的一个缺失体 .对 LRP1 6基因全长 c DNA的序列分析提示 ,该基因可能编码两种 N端不同的蛋白质 ,且该基因的转录本可能存在一种丰度较低的剪接体 .     

真核生物的基因组织和结构

真核生物的基因组DNA被包装在染色体中。染色体的化学物质是染色质,它是由DNA和核蛋白组成。染色体DNA含有几乎所有真核生物的基因、重复序列和基因间序列。基因是由一段DNA序列组成,有编码序列和非编码序列。真核基因的编码序列是不连续的,它被插入序列分隔,而各真核基因之间则由基因间序列相隔。基因的结构和表达与核内蛋白质有着密切的关系。     

人类21号染色体与疾病

21号染色体是人类染色体中最小的常染色体,由日本等13个国家的研究单位组成的国际基因组已完成了21号染色体的DNA序列分析,其99．7％的序列已被测定。21号染色体长臂（21q)DNA,由33546361bp组成,其中只剩下3个小的克隆裂隙和7个序列裂隙（约100kb)尚未确定,在21q,q的近着丝粒处有21q远,近区域存在很多重复序列。21号染色体有39个断裂点,原因是由于21号染色体与其他染色体发生相互易位、21号染色体内重排或受到辐射所致。人类21号染色体上的特异基因与小鼠16、17及10号染色体上的某些基因互为同质异构基因,显示了基因组在进化过程中的变异性和保守性,21号染色体基因密度较小,含有127个已知基因,98个预报基因和59个假基因,21号染色体与Down′s综合征,某些单基因遗传紊乱,某些复杂疾病（双相情感障碍、家族性复合高血脂症）、实体瘤及白血病的发生有关。     

染色体上大片段DNA的直接克隆及移植

应用Red重组体内直接克隆染色体上大于10 kb的DNA序列非常困难.利用一种抗性拆分-融合策略成功地从供体菌染色体上直接克隆了约50 kb的DNA序列,并将其移植到受体菌的染色体上.首先将抗性基因(如cat)的互补片段cmb定向整合到染色体上拟克隆区域的一侧,然后将含有抗性基因另一互补片段cma的线性质粒载体电转到细胞内进行定向捕获,通过抗性筛选获得克隆.使用该方法,成功地将供体菌DH1-Z基因组上约48kb的大片段DNA捕获至质粒载体上,捕获阳性率达80%.然后,将该质粒转化到受体菌DH36,利用双链断裂促进同源重组策略,替换受体菌染色体上对应区域,一次敲除基因组上4个非必需区,获得重组菌DH40.该方法也可用于微生物天然产物生物合成途径的异源表达、基因组组装和大片段DNA的功能研究.     

基因库构建

930110用渡式分拣法分寓的富含在小麦粲色体中的HpaⅡ文摩的构tC英3/Wang,M.L.…I NucleicAcids Res.-1992,20(8).一1897～190l[译自DBA,1992,11(13),92—07265] 由小麦同步细胞培养物分拣出已鉴~IJDNA含量的染色体。由分拣的染色体构建了HpaⅡ基因文库,已分析的克隆DNA序列的一半是唯一或低拷贝致的。用约一半的序列作DNA探针,检测小麦染色体-4A的序列。非甲基化序列并非沿谷类染色体随机分布这一结果表明,其基因可能是相对集中成簇分布的。(朱遐)930111半合成组含的抗体文库-通过麓机谱变构t基因库[羹]/Barbas,n1.C.F.…,Proc…     

哈氏弧菌dam基因的克隆与分析

利用兼并PCR的方法克隆得到哈氏弧菌T4的DNA腺嘌呤甲基化酶(dam)基因,序列分析表明该基因编码279个氨基酸,与其它已知弧菌的Dam具有较高的同源性,其中与副溶血弧菌Dam的相同性达95%。功能检验表明所克隆的dam基因在大肠杆菌中具有DNA腺嘌呤甲基化酶活性,能够甲基化大肠杆菌染色体DNA GATC序列中的腺嘌呤。运用染色体步移法获得dam基因上游的3251 bp DNA,发现该区域含有3个基因,其与dam在染色体上的相对排列顺序为:莽草酸激酶-脱氢奎尼酸合成酶-damX-dam。对dam上游DNA序列研究发现位于翻译起点ATG上游的78bp、112bp和477bpDNA片段皆具有启动子活性,但前者的活性明显高于后二者。     

玉米转录因子ABP9基因的BAC克隆鉴定及染色体定位

为得到玉米转录因子ABP9的准确基因组序列及其旁侧基因组序列,应用PCR法对玉米自交系齐319 BAC文库中含有ABP9基因的单克隆进行筛选,得到了19个一级阳性混池,从中选择BAC-103、BAC-159进一步筛选获得了4个阳性单克隆。以其中1个阳性单克隆BAC-103-C3为模板进行全序列测定,比对分析后将ABP9基因初定位于玉米自交系Mo17基因组的3号染色体上。另以玉米自交系齐319、自交系Mo17萌发种子的根尖染色体滴片为材料,以绿色荧光标记的ABP9基因ORF区质粒DNA为探针进行荧光原位杂交,确认在这2个自交系中ABP9基因定位于3号染色体上。ABP9基因组序列的获得及其染色体定位为该基因分子标记的开发及应用于分子育种奠定了基础。     

转Xa21基因水稻中T-DNA整合的遗传定位

利用转抗白叶枯病基因Xa21的水稻材料,通过TAIL－PCR方法扩增T－DNA整合的侧翼序列。从中筛选属于水稻基因组DNA的T－DNA整合的侧翼序列作为探针,将外源基因整合位点定位到窄叶青／京系17DH群体构建的水稻分子连锁图谱上。共获得属于水稻基因组DNA的T－DNA侧翼序列22个,其中的19个序列在定位群体的两个亲本之间显示RFLP多态性,分别定位在水稻基因组的第3,4,5,7,9,10,11和12染色体上。带有转基因Xa21的T－DNA整合的定位为研究外源基因在不同染色体位点的位置效应和稳定遗传打下基础。     

纤毛虫大核分化过程中DNA的重组

纤毛虫大核分化过程中DNA的重组,包括小核染色体的断裂、间隙片段的删除、大核特定序列的扩增以及在大核基因的两端加上端粒。本文重点介绍和讨论了DNA片段删除与重排的类型、间隙DNA片段的序列特点,以及DNA删除与重排的机理。     

人类基因组3pter-p26区域的序列比较分析

对人类基因组3号染色体短臂的3pter-p26区域进行了初步分析, 序列组装后整个区域全长约为8.1 kb, 靠近端粒区还存在一个约20~30 kb的空洞. 序列比较分析表明: (ⅰ) 该区域的GC含量为38.5%, 为人类基因组所有近端粒区域最低; (ⅱ) 共含有42个基因, 平均大小为97.5 kb, 以前通过基因连锁分析定位于该区域的基因Cntn3存在定位错误, 应位于3p12.3; (ⅲ) 该区域散在重复序列活跃程度高于全基因组平均水平, 其中(TA)_n含量是全基因组平均水平的2倍; (ⅳ) 该区域在小鼠6号染色体104.1~112.4 Mb的位置有一个保守的同源序列; 通过染色体进化分析推断, 3pter-p26区域可能于最近的一次染色体重排之后才转移到染色体的末端, 其发生时间应在人与小鼠的基因组分离之后, 在这次重排过程中, 染色体断裂点附近的一些序列, 连同所包含的基因发生了丢失, 而丢失的基因总拷贝数却在基因组的其他地方得到了增加; (ⅴ) 3pter-p26区域较低的GC含量可能不利于保持染色体末端的稳定, 容易发生DNA丢失, 而这又可能是引发基因表达异常导致疾病的原因之一.     

性染色体与精子功能研究进展

最新研究表明：Y染色体上男性特有序列(MSY)是一个包含不同DNA序列的嵌合体,包含多个回文序列。回文序列上经常发生臂间基因交换,使Y染色体具有自我保护能力。女性失活X染色体上有15%的基因逃离失活进行表达,可能在男女性别不同和女性个体间差异中起决定作用。精子在受精时,是一个综合运输体,不仅仅只向卵子转移DNA,还有RNA和蛋白质。     

超声处理导致交联DNA序列特异性断裂

目的:研究在交联状态下超声方法处理DNA是否导致DNA随机断裂。方法:通过建立一种新的Clone-Sequencing筛选技术,利用NCBI等相关网站,结合Vector-NTI等软件分析得到不同断裂位点的核苷酸序列,利用SPSS 18.0软件,对不同断裂位点核苷酸序列的分布进行统计学分析。结果:利用Clone-Sequencing技术得到216个来源于不同染色体位置的克隆片段,通过对其正义链和反义链的5’-DNA断裂末端的分析,得到432个超声断裂位点的核苷酸序列信息。对断裂位点核苷酸序列进行统计分析发现,超声处理后,交联DNA的断裂位点并不像过去认为的完全随机分布,而是存在明显的偏性,即对于所有16种不同的二核苷酸组合,超声处理导致交联DNA更易在5’-ApN-3’寡核苷酸中间的磷酸二酯键处断裂,且其相对断裂频率呈现d(ApN)>>d(GpN)>d(CpN)>d(TpN)的趋势。结论:传统的超声方法处理,交联DNA断裂位点并不是完全随机分布,而是存在着明显的序列偏好性,这一新发现提示,对于目前广泛使用的、涉及交联DNA超声处理的ChIP-Chip或ChIP-Seq等高通量及其衍生技术结果的统计分析,需要引入更加合理有效的分析策略。     

染色体粉碎——基因组灾难性事件产物

"染色体粉碎"是最初在肿瘤细胞中发现的一种复杂的基因组重排现象.在该事件中,细胞的一条或几条染色体在短时间内发生大量的DNA双链断裂,形成小的DNA碎片,之后这些碎片被细胞的DNA修复机制随机地拼接起来,形成新的染色体.染色体粉碎事件会造成大量的基因组重排,引起DNA拷贝数的变异和基因融合,从而导致正常细胞向肿瘤细胞的快速转化.这与传统的癌症发生理论不同,传统理论认为肿瘤的发生是由基因突变逐步积累而导致的,因此染色体粉碎现象可能揭示了一种肿瘤发生的新机制.目前,该现象的内在机制还不完全清楚,其判别标准也存在争议.本文综述了近年来关于染色体粉碎现象的判别标准和产生机制,探讨了该现象与肿瘤发生发展的关系,为进一步研究染色体粉碎事件提供参考.     

动物种群遗传多态性研究中的PCR技术

基因组DNA的变异是种群遗传多态性研究的基础。PCR技术可以在反应管内经济快速地扩增特定DNA序列,在动物种群遗传多态性研究中的应用主要包括三个方面：(1)种群遗传多态位点的检测;(2)基因定位或利用已经定位的单拷贝基因设计染色体位点特异的分子标记;(3)与DNA测序技术相结合,高效经济地获取特定基因座位的全部遗传变异。     

哈氏弧菌dam基因的克隆与分析

利用兼并PCR的方法克隆得到哈氏弧菌T4的DNA腺嘌呤甲基化酶(dam)基因,序列分析表明该基因编码279个氨基酸,与其它已知弧菌的Dam具有较高的同源性,其中与副溶血弧菌Dam的相同性达95%。功能检验表明所克隆的dam基因在大肠杆菌中具有DNA腺嘌呤甲基化酶活性,能够甲基化大肠杆菌染色体DNA GATC序列中的腺嘌呤。运用染色体步移法获得dam基因上游的3251 bp DNA,发现该区域含有3个基因,其与dam在染色体上的相对排列顺序为:莽草酸激酶-脱氢奎尼酸合成酶-damX-dam。对dam上游DNA序列研究发现位于翻译起点ATG上游的78bp、112bp和477bpDNA片段皆具有启动子活性,但前者的活性明显高于后二者。     

小麦面粉黄色素相关基因研究

小麦八氢番茄红素合成酶(PSY)基因和脂肪氧化酶(LOx)基因可能影响面粉黄色素含量。根据玉米P5y 基因序列设计引物,扩增出小麦PSY基因的部分片段,序列比较表明小麦和玉米PSY基因外显子DNA序列长度一致,但存在单核苷酸多态性(SNP)位点,序列一致性为90％;蛋白质氨基酸序列比较发现其序列一致性为97％, 说明一些SNP并未导致氨基酸的改变,该基因在玉米和小麦中应具有类似的功能活性。利用非整倍体材料将小麦 PSY基因初步定位到1D染色体。用同样方法,发现小麦的LOX基因与大麦、水稻、玉米的L0X基因具有很高的一致性,并将其初步定位到4BS染色体。     

黑曲霉糖化酶高产和低产菌株糖化酶基因调控区的克隆及其分析比较

以PCR合成的糖化酶高产菌株黑曲霉(Asp. Niger)T21糖化酶基因5’近端非编码区588bp(EcoRI-BamHI)的序列为探针,从T21染色体DNA中克隆到近2.0kb的糖化酶基因5’端非编码区序列,并以此序列为探针从糖化酶低产菌株黑曲霉3.795(T21的诱变出发株)的染色体DNA中克隆到1.5kb的糖化酶基因5’端非编码区序列。该二序列的分析测定结果表明,其结构特征与文献报道的黑曲霉糖化酶基因5’端非编码区的基本一致,被称为“核心启动子”(Core promoter)的TATAAAT框及GCAAT框,分别在翻译起始点的-109bp及-178bp处。此外,在曲霉amdS,amyB基因中已发现有调控功能的CCAAT序列存在于-449bp和-799bp处。高产和低产菌株糖化酶基因5’端非编码区序列的分析比较结果表明,有9个部位的碱基发生了变化。此实验结果为进一步研究黑曲霉糖化酶基因在转录水平上的调控规律打下了基础。     

锅柄式PCR及其在混合谱系白血病基因断裂区中的应用

染色体11q23的混合谱系白血病(MLL)基因的断裂点簇集群区(BCR)的转位,可引起婴儿急性白血病及与DNA拓扑异构酶Ⅱ抑制剂的生化治疗法相关的白血病。由于MLL基因包括大约30个不同的转位伴侣基因,几个断裂点所在的伴侣基因的序列还不清楚,因而对MLL基因断裂点的PCR克隆是很困难的。锅柄式PCR,即用已知5'端序列和未知的3'端伴侣基因序列以形似一个锅和一个柄的模板扩增断裂点基因DNA,是一种克隆MLL基因断裂区的新方法,可以扩增未知3'端序列的断裂点簇集群区。