柑橘抗寒细胞变异体的获得及其抗性遗传稳定性的研究

锦橙(Citrus sinensis (L.) Osbeck cv. Jincheng)珠心愈伤组织悬浮细胞通过γ射线诱变与高浓度羟脯氨酸离体选择的方法,获得了抗性细胞系,并再生植株。抗性细胞系及其再生植株比供体(对照)的抗寒性分别提高1.4 ℃和2.4 ℃,连续3年测定结果表明再生植株抗寒性的增强是稳定的。其叶片总DNA的RAPD分析说明供体与变异植株可能在DNA水平上存在细微的差异,冷驯化进一步加强抗性细胞系与再生植株在抗氧化酶SOD、过氧化氢酶(CAT)活性和脯氨酸(Pro)、丙二醛含量上的差异。变异系抗性增强的生理基础涉及Pro代谢外的其他途径,抗氧化酶活性的提高与其抗寒性的增强有关。     

草木樨状黄芪抗甲硫氨酸变异系的离体筛选及鉴定

通过组织培养体系进行了草木樨状黄芪(Astragalus melilotoides Pall.)抗甲硫氨酸变异系的筛选。无菌苗幼茎切段诱导的愈伤组织经NaN3诱变后,经过筛选获得了抗14mmol/L甲硫氨酸的变异细胞系,并分化出大量植株。再生植株已经在大田中开花结实。经分析表明：抗性细胞系脱离选择压6个月后,放在含15mmol/L甲硫氨酸的培养基上培养25天后,其相对增长率是对照的10．2倍。抗性系再生植株游离甲硫氨酸是对照的2．12倍,并且天冬族氨基酸都有明显增加。SDS-PAGE及过氧化物酶同工酶分析表明：在蛋白质及同工酶酶谱上抗性系再生植株均出现与对照不同的差异。     

草木樨状黄芪抗甲硫氨酸变异系的离体筛选及鉴定

通过组织培养体系进行了草木樨状黄芪(Astragalus melilotoides Pall.)抗甲硫氨酸变异系的筛选。无菌苗幼茎切段诱导的愈伤组织经NaN_3诱变后,经过筛选获得了抗14mmol/L甲硫氨酸的变异细胞系,并分化出大量植株。再生植株已经在大田中开花结实。经分析表明:抗性细胞系脱离选择压6个月后,放在含15mmol/L甲硫氨酸的培养基上培养25天后,其相对增长率是对照的10.2倍。抗性系再生植株游离甲硫氨酸是对照的2.12倍,并且天冬族氨基酸都有明显增加。SDS-PAGE及过氧化物酶同工酶分析表明:在蛋白质及同工酶酶谱上抗性系再生植株均出现与对照不同的差异。     

苜蓿抗甲硫氨酸变异体的筛选

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)下胚轴愈伤组织用NaN_3溶液诱变处理后,在含有全致死浓度甲硫氨酸的MS培养基上进行了6个月的连续筛选培养,获得了能抗100mmol/L甲硫氨酸的变异细胞系,并分化成再生植株。所获变异细胞系在脱离选择压力6个月后,对甲硫氨酸的抗性仍比对照高7.2倍,并表现出对乙硫氨酸的交叉抗性(为对照抗性的3.3倍)。抗性细胞系及其再生植株的甲硫氨酸、赖氨酸、苏氨酸和异亮氨酸含量均比对照有大幅度增加。抗性系的SDS-PAGE电泳图谱及过氧化物酶同工酶谱带均与对照有显著不同,并出现了新带,表明变异系已经产生变化了的基因产物。     

花椰菜与黑芥非对称体细胞杂种的鉴定分析

选用兼具抗黑腐病、黑胫病、根肿病的野生种质黑芥(B.nigra)作为供体,具有良好原生质体培养能力的花椰菜(Boleracea var.botrytis L.)基因型"0307"作为受体,供体叶肉原生质体经不同剂量UV照射处理后,通过PEG介导,与不经任何处理的受体下胚轴原生质体融合,培养获得再生植株.形态学观察显示再生植株的表型多样,呈偏向受体花椰菜类型及中间类型分布:SRAP分子标记特征表明,杂种中受体的遗传信息较为完整,而来自供体的特异扩增带丢失量约为20.0%-97.8%,且不同杂种中存在热点丢失序列;约23.0%的再生植株其染色体数目小于供、受体染色体数之和;采用流式细胞仪对再生株的细胞DNA含量进行分析,结果显示,20%的植株其DNA含量小于供、受体DNA含量总和.对22棵再生植株进行了黑腐病人工接种抗性鉴定,17棵再生植株表现良好抗性,初步证明通过非对称体细胞杂交技术已将外源抗性基因转入花椰菜中.实验表明UV辐射处理,导致再生植株中供体遗传信息的部分丢失或者染色体在不同程度上的消减,获得了花椰菜与黑芥的非对称体细胞杂种,但UV的剂量效应不明显.     

美洲拟鲽抗冻蛋白基因转化番茄的形态学与苹果酸脱氢酶同工酶检测

将带有afp基因的Ti质粒pMon(232),作为供体DNA,用花柱道和子房注射DNA的方法转化番茄品种“中蔬四号”对D1D2代进行田间抗寒性观察,发现在春季平均气温低于正常年分4．4℃条件下,有些组分田间长势明显好于对照。初步确认已获得抗寒性。对D2代转基因植株进行MDH同工酶分析,均与对照有明显差异,间接验证了外源DNA的导入,说明同工酶分析,可作为转基因植株早期筛选的生化指标。     

红豆草抗甲硫氨酸变异体的筛选

用ＮａＮ３ 诱变过的红豆草（Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓｖｉｃｉａｅｆｏｌｉａ Ｓｃｏｐ．）愈伤组织筛选得到了能抗８０ ｍ ｍ ｏｌ／Ｌ甲硫氨酸的变异细胞系——ＯＮｍ ｅｔｒ,并得到了再生植株。ＯＮｍ ｅｔｒ 脱离选择压力６ 个月后,其抗性仍比野生型的高５．６ 倍。同时还表现出对乙硫氨酸的交叉抗性,其抗性是野生型的６．５ 倍, 表明该抗性系抗性表达稳定。ＯＮｍ ｅｔｒ 愈伤组织中甲硫氨酸、赖氨酸、苏氨酸含量分别是野生型的４．００、１．０９、１．５０ 倍。ＯＮｍ ｅｔｒ再生植株中甲硫氨酸、赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸含量分别为野生型的２．０、３．５、３．５、２．５ 倍。在ＯＮｍ ｅｔｒ 愈伤组织可溶性蛋白ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱中,出现了两条新多肽（３０ ｋＤ、２６ ｋＤ）。ＯＮｍ ｅｔｒ 细胞系过氧化物酶同工酶谱中亦出现了两条新酶带。这些变化表明该变异系已经产生变化了的基因产物     

籼稻体细胞胚胎发生及器官发生的比较研究

在以幼穗为外植体的诱导培养及其以后的继代培养与悬浮培养中,从以下几个方面对３个籼稻品种的体细胞胚胎发生（Ｅ）与器官发生（Ｏ）的特点作了比较研究．在形态上,（Ｅ）型愈伤由胚状体组成,具有层次分明的结构．胚状体由胚芽、胚根及盾片组成．而（Ｏ）型的愈伤没有上述组织的分化．没有层次结构。植株再生能力方面．与器官发生途径相比较,体细胞胚胎发生途径之分化频率高．保持再生能力持续的时间长．从每个愈伤上发生的再生植株数多．（Ｏ）型愈伤结构较疏松．建立结构良好的、细胞团较小的悬浮细胞系容易．但这种细胞系在液体条件下几乎丧失再生能力．而（Ｅ）型愈伤则相反．建立好的悬浮细胞系．需要时间较长．但在悬浮条件下仍然具有再生植株的能力。在诱导条件方面．２,４－Ｄ及激动素分别作用时可诱导器官发生,共同作用时则诱导体细胞胚胎发生．再生植株途径方面,由于水稻同时具有器官发生及体细胞胚胎发生的特点．无论在诱导条件上还是在（Ｅ）与（Ｏ）本身的特点上均不似萝卜或烟草那样专一．并且有（Ｅ）与（Ｏ）相互转化和混合发生的复杂情况．     

烟草种间的体细胞杂交──Ⅰ．通过原生质体融合将波缘烟草部分核基因组转移给普通烟草

通过“供体──受体”原生质体融合获得５个“波缘烟草＋普通烟草”体细胞杂种细胞系（ＴＵ＿１至ＴＵ＿５）。对５个杂种细胞系的细胞学观察表明,其中２个系为多细胞融合产物,其平均染色体数目分别为１６７．２和１９８．４;３个系为二细胞融合产物,其平均染色体数目分别为５４．３７０．６和６２．８。杂种细胞系的一个明显特征是所有观察的中期细胞均存在数量不等的畸变染色体。对５个杂种细胞系再生植株叶片苹果酸脱氢酶和酯酶的同工酶分析结果表明,它们均为程度不同的不对称核杂种,即只含有供体亲本（波缘烟草）的部分核基因组。以小麦ｒＤＮＡ为探针对杂种细胞系基因组ＤＮＡ的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果表明,杂种中双亲的载有ｒＤＮＡ的染色体可能均有部分消除;此外,杂种中新ＤＮＡ片段的存在说明双亲ｒＤＮＡ可能发生了分子间重组。两个由多细胞融合产生的杂种细胞系（ＴＵ＿２和ＴＵ＿５）再生苗不易生根而且形态上异常。３个由二细胞融合产生的杂种细胞系（ＴＵ＿１、ＴＵ＿３和ＴＵ＿４）再生苗可生根长大,形态上类似受体亲本;对其根尖的细胞学观察表明,染色体数目在５１─６６之间,说明均为只含有少量供体亲本染色体的不对称核杂种。     

欧石楠体细胞胚发生过程中的DNA甲基化

利用甲基化敏感扩增多态性（MSAP）方法,对欧石楠大田苗、胚性愈伤组织和再生苗的DNA甲基化进行了研究。从64对选扩增引物中筛选出19对,共扩增得到506条带,统计显示,大田苗、胚性愈伤组织和再生苗的全基因组DNA甲基化水平分别为31．42％、27．86％和29．05％,3种试材发生甲基化变异的有175条带,变异率为34．58％。体细胞胚诱导形成胚性愈伤组织过程中,甲基化水平降低,而在再生苗中有所恢复,与大田苗接近。在外侧胞嘧啶甲基化水平上,胚性愈伤组织的甲基化水平有所增加,且在再生苗中可部分维持。另外,在175条变异带中,再生苗恢复到大田苗DNA甲基化模式的有62条,占总变异条带的35．43％,而与胚性愈伤组织维持相同DNA甲基化模式的有59条,占33．71％。回收部分甲基化变异条带,最终得到8条有效的基因组DNA序列。BLASTnI：对分析表明,在欧石楠基因组中,包括抗性基因、蛋白激酶、质体基因等在内的多种DNA序列均存在DNA基化修饰现象。