产黄青霉谷胱甘肽S-转移酶基因PcgstA的克隆与鉴定

从青霉素工业生产菌产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)中首次克隆了一个谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因,定名为PcgstA.该基因的开放阅读框长840bp,含有两个内含子,编码一个238氨基酸残基的蛋白质.其推断的氨基酸序列与一些已经鉴定的丝状真菌GST具有50%左右的序列一致性.PcgstA的完整编码区经RT-PCR扩增、验证,插入原核表达载体pET11a,转化大肠杆菌BL21(DE3)-RP菌株,表达得到重组PcGSTA蛋白.酶活测定证实,重组PcGSTA具有GST活性,其对底物CDNB(1-chloro-2,4-dinitrobenzene)的比活为(0.159±0.031)μmol/(min·mg).利用TaqMan探针法,对PcgstA的表达情况进行了比较.结果表明,在添加了侧链前体苯乙酸的青霉素生产培养基中,PcgstA的表达水平和在不含苯乙酸培养基中的表达相比明显下调,显示了该基因与苯乙酸代谢的关系.     

产黄青霉原生质体融合杂种的产青霉素能力及非强制选择杂种的探讨

4个产黄青霉选育系谱的14列营养缺陷型原生质体融合率为0.01一8．88％。原生质体经紫外光照射后融合,有可能在非选择性的cM上分离出杂台二倍体。系谱内杂台二倍体的青霉素产量与直接亲本是否比原始亲本显著减产有关。系谱问杂合二倍体中双亲与产量有关的基因之间没有明显的显隐关系或累加效应。系谱I与I的杂合二倍体F16②—c24的分离子HP7②一1显示出比原始亲本更好的选育潜力。     

一个新的产黄青霉谷胱甘肽转移酶基因的克隆和鉴定

以产黄青霉(Penicillium chrysogenum Thom)cDNA为模板,克隆得到一个新的谷胱甘肽转移酶基因PcgstB,其开放阅读框长651bp,编码216个氨基酸的蛋白质。与已知序列进行BLASTp比较显示,该蛋白具有保守的GST结构域,与烟曲霉GstB的序列一致性最高,达65%。将PcgstB与原核表达载体pTrc99A连接得到表达质粒pTrc-gstB,转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导后获得以可溶形式表达的重组PcGstB蛋白。以1-chloro-2,4-dinitrobenzene(CDNB)为底物检测,确认该蛋白具有GST活性。     

产黄青霉ds RNA病毒通过原生质体融合的转移

将国内青霉素产生菌(Penicillium chrysogenum)的黄孢子系统及绿孢子(包括淡绿,灰绿)系统的十多个菌株,经过病毒提取、电镜观察、奥氏免疫双扩散、凝胶电泳及放射免疫测定,证明黄孢子系统的菌株含有不同滴定度的、直径40nm的球形病毒,而绿孢子系统中检查不出病毒。从营养要求、孢子颜色不同的带病毒和无病毒菌体中分离原生质体,进行不同组合的原生质体的融合杂交,获得营养互补融合的异核体。异核体1中,病毒通过胞质融合转移到原来无病毒的灰绿孢子菌株及细胞核融合后的杂合二倍体中。灰绿孢子的病毒量接近二倍体的1/3。二倍体菌落生长稳定,低温保存二年后经0.01—0.02M对氟苯丙氨酸(PFA)诱发和分离,产生亲本类型的分离子,分离子及二倍体仍然含有病毒。异核体2作亲本性分离,黄孢子仍有病毒,淡绿孢子及细胞核融合后产生的二倍体均无病毒,表明非感染性为显性。此种淡绿孢子的突变体中存在非感病菌系,它不支持病毒的复制。提取各杂交组二倍体内的病毒所特有的dsRNA时,可看出dsRNA的存在和病毒的存在一致。多数杂合二倍体的青霉素产量比亲本高。     

产黄青霉菌丝联合及病毒传递

通过营养要求、孢子颜色不同的带病毒和无病毒产黄青霉Penicillium chrysogenum菌株间的菌丝联合,在基本培养基(MM)上获得了营养互补的异核体。异核体菌落上出现亲本类型分离并产生深绿色角变或斑点。经孢子体积,DNA含量及营养类型测定证明角变和斑点为杂合二倍体。经电子显微镜观察,奥氏免疫双扩散,2.4％聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射免疫测定检验了胞质融合或胞质和核融合后代病毒的传递,结果表明黄孢子后代带病毒而杂合二倍体及绿孢子后代均不带病毒。看来,这些绿孢子菌株(821和822)抗病毒感染。     

产黄青霉菌株39B分离培养及其白藜芦醇代谢积累条件研究

在虎杖组织培养过程中获得1株产黄青霉菌株(Penicillum chrysogenum,39B)菌株,其发酵液经TLC和HPLC检测含白藜芦醇,对其培养条件及白藜芦醇积累特性进行了研究,通过正交优化试验得到该菌最佳培养条件:20g/L葡萄糖,2g/L硝酸铵,pH值7.0,28℃,100r/min。3mmol/L苯丙氨酸、Mg2+、Zn2+能促进其生长和白藜芦醇的积累,其白藜芦醇含量达8.6617μg/100mL。     

产黄青霉d8RNA病毒通过原生质体融合的转移

将国内青霉素产生菌(Penicillum chrysogenum)的黄孢子系统及绿孢子(包括淡绿,灰绿)系统的十多个菌株,经过病毒提取、电镜观察、奥氏免疫双扩散、凝胶电泳及放射免疫测定,证明黄孢子系统的菌株含有不同谪定度的、直径40nm的球形病毒,而绿孢子系统中检查不出病毒。从营养要求、孢子颜色不同的带病毒和无病毒菌体中分离原生质体,进行不同组合的原生质体的融合杂交,获得营养互补融合的异核体。 异核体1中,病毒通过胞质融台转移到原来无病毒的灰绿孢子菌株及细胞核融合后的杂合二倍体中。灰绿孢子的病毒量接近二倍体的l／3。二倍体菌落生长稳定,低温保存二年后经0.01—0.02M对氟苯丙氨酸(PFA)诱发和分离,产生亲本类型的分离子,分离子及二倍体仍然含有病毒。异核体2作亲本性分离,黄孢子仍有病毒,淡绿孢子及细胞核融合后产生的二倍体均无病毒,表明非感染性为显性。此种淡绿孢子的突变体中存在非感病菌系,它不支持病毒的复制。提取各杂交组二倍体内的病毒所特有的dsRNA时,可看出dsRNA的存在和病毒的存在一致。多数杂合二倍体的青霉素产量比亲本高。     

根霉吸附水体中重金属铬与吸附机理的研究

以根霉RhizopusLH2死菌体为吸附剂进行水体中六价铬的吸附研究.结果表明,Cr(VI)的生物吸附最优条件为:温度28℃,pH为2;线性回归相关系数为0.98,符合Langmuir吸附等温线模型;傅立叶红外变换光谱分析推断吸附机理为质子化氨基在Cr(VI)的生物吸附中起主要作用.     

木霉生物吸附重金属铬机理的研究

利用木霉（Trichoderma lhd）菌体作为吸附剂,对水体中的六价铬进行生物吸附,借助傅立叶红外变换光谱和拉曼光谱对六价铬的生物吸附机理进行了探讨。实验条件优化结果表明,温度28 ℃以及酸性环境条件（pH 1）有利于Cr （VI） 的生物吸附,12小时内,Cr （VI） 的生物吸附去除效率达99 %。吸附机理实验结果分析表明,相比于对照实验,2350 cm^-1吸收峰的出现为吸附剂表面质子化的氨基如＞NH2^＋, NH^＋, ＞C=NH^＋―等基团吸附Cr （VI）所致。拉曼光谱中吸收峰2097 cm^-1强度显著增强进一步表明,Cr （VI）的生物吸附是吸附剂表面氨基基团在起作用。     

产黄青霉菌响应苯氧乙酸的Ca2+信号转导机制

【目的】研究青霉素V生产过程中—Ca~(2+)信号转导途径参与产黄青霉菌对外源侧链前体苯氧乙酸的应答机制。【方法】考察4种不同机制的Ca~(2+)信号干扰剂[利心平、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、苏拉明和硫酸新霉素]对青霉素V产量和产黄青霉菌生物量的影响。运用Fluo-3/AM荧光染料对细胞进行染色,通过荧光显微镜成像和酶标仪定量检测两种方法监测胞内Ca~(2+)浓度的变化。【结果】苯氧乙酸添加后胞内Ca~(2+)相对含量高于对照组49.86%,而1 mmol/L磷酸酯酶C底物抑制剂硫酸新霉素的添加使得胞内Ca~(2+)相对含量降低了53.31%,同时青霉素V产量降低78.71%,表明产黄青霉菌可通过肌醇1,4,5-三磷酸信号途径调节胞内Ca~(2+)浓度来响应苯氧乙酸的胁迫。【结论】首次探究了Ca~(2+)信号转导途径在产黄青霉菌对苯氧乙酸应答中的作用,为丝状真菌中Ins(1,4,5)P3-Ca~(2+)信号转导途径的研究提供理论依据。     

产脂肪酶真菌的选育及酶学性质研究

从富含油脂土壤中筛选出一株产碱性脂肪酶酶活达6.40U/mL的真菌菌株,经显微形态及ITS序列分析鉴定为产黄青霉Penicillium chrysogenum,该菌株命名为Penicillium chrysogenum J23。该菌的最佳产酶培养条件为：蔗糖1.0%、蛋白胨2.0%、橄榄油1.0%、MgSO4·7H2O 0.05%、接种量1.0%、初始pH 9.0、摇床转速200r/min、30℃培养48h。其所产脂肪酶的最适反应温度与pH分别为33℃和7.5,在pH6.0－10.0酶具有良好的稳定性,在50℃处理2h仍可保持30%以上的酶活力,50mmol/L的Ca2+、Mg2+、K+分别对酶有较强激活作用,而50mmol/L的Fe2+、Mn2+、Cu2+、Pb2+、Li2+对酶则有不同程度的抑制作用。     

千层塔内生真菌SHB发酵产石杉碱甲条件的研究

为提高千层塔产黄青霉属内生真菌SHB液体发酵产石杉碱甲的产量,通过单因子和正交试验研究了真菌SHB液体发酵的条件。结果表明,千层塔内生真菌SHB液体发酵产石杉碱甲的适宜条件：温度为28℃,起始pH为6．4,接种量为12％,种龄为48h,转速为160r／min,发酵时间为8d。在此条件下,石杉碱甲的产量可达4．761μg／mL。     

产黄青霉的杂交育种

选育高产菌株是工业微生物提高产量最有 效的方法。我们于1974-1977年,对产黄青霉 (Penicillium clirysogenusn)采用杂交育种和诱变 育种相结合的方法,选得了一株高产菌株杂 3-25-103,从1977年开始用于生产。该菌株在 20吨和58吨罐试验共229批,与同期对照菌 利“相比,青霉素发酵单位平均提高8%。青霉素 滤液产量比1976年同期提高6.45%。     

碳源对产紫青霉产菊粉酶的影响

试验不同碳源对产紫青霉菊粉酶生产情况的影响。结果表明,果糖、菊糖、菊芋浸汁作为碳源是菊粉酶生产较理想的诱导因子,但过量的果糖会产生阻遏。经菊糖作为主要碳源和唯一碳源筛选的菌株产酶能力可提高6－7倍。同时在发酵前期加入易利用的碳源培养菌体,后期利用菊糖诱导酶的产生,可使酶产量提高2倍。     

铅离子的生物吸附动力学及吸附热力学研究

目的：研究非活性深红酵母（Rhodotorula rubra）对重金属离子Pb^2＋的生物吸附热力学和动力学特性。方法：采用恒温摇床振荡吸附的实验方法,研究Pb^2＋生物吸附的动力学和热力学,并以适当的数学模型对实验数据进行拟合;对吸附前后的酵母进行红外光谱及X射线光电子能谱分析。结果：在20℃～45℃温度范围内,吸附5min时即达到了饱和吸附量的80%以上,2h左右达到平衡;深红酵母对Pb^2＋的生物吸附过程适宜用Elovich方程来描述;由二级动力学方程计算的生物吸附活化能为21.56kJ/mol;生物吸附平衡可用Langmuir等温式、Freundlich等温式及Dubinin-Radushkevich等温式来描述,拟合相关系数均接近0.99;Langmuir方程计算所得ΔH^0为13.93kJ/mol。结论：深红酵母对Pb^2＋的生物吸附是非均相的扩散过程,由快速吸附和慢速吸附两个阶段组成,以物理吸附为主,并伴随有化学吸附。     

白腐真菌吸附铅的研究

含重金属废水的传统处理方法有化学沉淀法、离子交换法、吸附法、电解法和膜分离法等,它们虽然也能达到一定的净化效果,但因过程繁琐并易造成二次污染而不够理想,尤其是金属离子浓度较低时,往往操作费用和原材料成本相对过高。近年来采用生物吸附法去除废水中的重金属...     

菌丝空泡形态比例与青霉素合成的关系

采用图像处理技术量化菌丝空泡区域比例,并研究菌丝空泡与青霉素合成的关系.结果表明:当空泡区域比例达到20％时,青霉素开始大量合成;当空泡比例达到30％～35％时,青霉素合成最为旺盛;当空泡区域比例超过40％时,青霉素效价下降.菌丝空泡的过度膨胀是发酵进入衰退期的重要标志.