间充质干细胞的生物学特性及临床应用

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),也被称为多能干细胞,最早于1987年被Friedenstein等人~([1])在骨髓中发现并成功分离培养.MSCs几乎存在于所有类型的组织中,是基质细胞的起源细胞.MSCs可以分化为不同的细胞类型,如脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、肝细胞等~([2]).根据国际细胞治疗协会的规定,MSCs表达CD105(SH2),CD73(SH3),     

两种不同密度分离液分离的脐血CD34+、CD34-细胞造血活性比较

目的:比较两种不同密度的ficoll-泛影葡胺分离造血干细胞群的效果,找出更适合分离脐血造血干、祖细胞的分离密度,为脐血造血干细胞的医学研究及临床应用提供一定依据。方法:采集脐血6份,根据密度梯度离心法,用质量分数为(1.068±0.001)g/m L、(1.077±0.001)g/m L ficoll-泛影葡胺分离液等量分离同一份脐血,分别计数这两种分离液的单个核细胞获得率及细胞存活率,得到的单个核细胞再分别经免疫磁珠分选法获得高纯度的CD34~+细胞及除去了CD34~+的单个核细胞(CD34~(-depleted) MNCs),统计分析这两种不同密度分离液获得的CD34~+细胞、CD34~(-depleted)MNCs在甲基纤维素中形成CFU-GM集落数。结果:1(1.068±0.001)g/m L、(1.077±0.001)g/m L两种分离液分离的单个核细胞平均密度分别为(1.52±1.0)×10~6个/m L、(2.84±0.98)×10~6个/m L,(P0.05);经免疫磁珠纯化后的CD34~+细胞占单个核细胞(MNCs)的比率分别是(1.26±0.47)%、(1.07±0.15)%,(P0.05);2(1.068±0.001)g/m L分离的单个核细胞经免疫磁珠纯化后1.5×10~3个CD34~+细胞形成CFU-GM的集落(140.5±14.5)显著多于(1.077±0.001)g/m L的集落数(118.3±13.8)(P0.05);(1.068±0.001)g/m L分离的5×10~4个CD34~(-depleted) MNCs形成的CFU-GM集落数(132.0±5.1)也显著多于(1.077±0.001)g/m L的集落数(101.3±9.4),(P0.05)。结论:与1.077 g/m L Ficoll相比,1.068g/m L Ficoll-泛影葡胺分离液分离的单个核细胞中的CD34~+、CD34~-细胞造血活性更强,更适合用来分离脐血中造血干细胞群。     

应用单克隆抗体对烟草花叶毒病抗原决定簇及其抗原型的分析研究

收集国内9省、市、自治区14个烟草花叶病毒(TMV)分离物,在隔离条件下繁殖毒源,以同一方法,相同条件提纯并定量。以20μg/ml 为起始浓度,作10~(-1),10~(-2)、10~(-3)、10~(-4)……10~(-9)9个稀释度(设健康寄主对照),分别与适宜浓度(通过逐一测定滴度而选定的)10个 TMV 单克隆抗体(McAb)〔设多克隆抗体、正常细胞腹水(SP2/0)对照〕进行 ELISA 试验,结果从14株分离 TMV 分离物中识别到8种抗原决定簇,并将这些 TMV 分离物划分为六个抗原型。这揭示了应用 McAb 区分 TMV 株系是一个很有希望的方法     

生物分离法制备细胞色素C质量的影响因素

细胞色素C为临床上应用广泛的生化药品。为了提高细胞色素C的质量,对制备过程中影响细胞色素C质量的因素进行考察,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)对不同工艺制备的细胞色素C进行纯度分析,并对SDS-PAGE图谱中约2.5×10~4的蛋白质进行液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)分析与鉴定。结果表明:在SDS-PAGE电泳图中,使用三氯乙酸(TCA)沉淀剂的传统工艺制备的细胞色素C样品除了有1.22×10~4的细胞色素C,还包括1个约2.5×10~4的蛋白分子;而不使用三氯乙酸沉淀剂的新工艺制备的细胞色素C样品,仅有1.22×10~4的细胞色素C,而未发现约2.5×10~4的蛋白。SDS-PAGE图谱中分子量2.5×10~4的蛋白分子的LC-MS/MS分析与鉴定结果表明其与猪源细胞色素C覆盖率最大(达到76%),结合其分子量大小,可以证明该蛋白为细胞色素C二聚体。细胞色素C制备过程中三氯乙酸沉淀剂易导致细胞色素C形成二聚体,故三氯乙酸是影响细胞色素C质量的关键因素之一。     

新疆石河子地区印度麻花叶病植株病毒分离物的鉴定

1984年,从新疆石河子农学院实验站印度麻花叶病植株上,分离到一株病毒分离物Sc-1,经汁液摩擦接种试验表明,它可以侵染10种豆科植物和2种藜科植物。在印度麻、蚕豆、豌豆、箭舌豌豆、扁豆、山藜豆、田菁和红三叶草上引起系统花叶,在豇豆上产生局部枯斑和系统花叶,在苋色藜、昆诺藜上表现为系统黄斑。失毒温度为55～60℃,稀释限点10~(-3)～10~(-4),体外保毒期3～4天。可经汁液和蚜虫传播,不通过种子传毒。病毒粒体为线条状,大小为13～15×750nm。光学显微镜检查可见,病叶表皮细胞内形成不定形的内含体。电镜下可见风轮状、环状内含体。分离物Sc-1与菜豆黄色花叶病毒(BYMV)抗血清呈阳性反应。我们将Sc-1归为菜豆黄色花叶病毒(BYMV),且为豇豆株系。     

补骨脂素对中波紫外线导致人皮肤HaCaT细胞光老化的保护作用

目的:研究补骨脂素对中波紫外线(UVB)导致人皮肤HaCaT细胞光老化的保护作用及其作用机制。方法:选择不同浓度的补骨脂素,MTT法筛选药物的浓度;使用中波紫外线(UVB)照射永生化的HaCaT细胞建立UVB光老化模型;使用三种不同浓度的补骨脂素处理光老化模型,MTT法检测细胞的增殖及氧化试剂盒检测细胞中氧化酶的活性。RT-PCR及Western Blot分别检测JNK和白介素-8(IL-8)mRNA及蛋白表达量。结果:与空白组相比,10~(-7)mol/L、10~(-6)mol/L、10~(-5)mol/L补骨脂素组对HaCaT具有无明显的增殖作用(P0.05);与模型组相比,10~(-7)mol/L、10~(-6)mol/L、10~(-5)mol/L补骨脂素组对HaCaT具有无明显的增殖作用(P0.05),但是10~(-7)mol/L、10~(-6)mol/L、10~(-5)mol/L补骨脂素组SOD、GSH、CAT活性升高(P0.01),细胞JNK、IL-8 mRNA表达量均降低(P0.01),细胞JNK、IL-8蛋白表达量均降低(P0.05或P0.01)。结论:补骨脂素能够显著的保护HaCaT细胞的光老化,其机制可能与增强抗氧化酶活性,及抑制JNK信号通路,减少炎症因子的分泌有关。     

刺槐花叶病毒的研究——Ⅰ.病毒的分离纯化及其生物学和生物化学特性

刺槐花叶病毒是一种直径为30毫微米的球状病毒,其生物学特性为热致死温度60℃,稀释终点为10~(-2),体内保毒期为3～5天,体外保毒期为2天。用pH5.2重蒸水作为抽提液,结合聚乙二醇沉淀、超速离心及线性蔗糖梯度离心,可以将病毒分离提纯。病毒含有RNA基因组,RNA含量约为13%,外壳蛋白为一种组分,分子量为30,000。根据刺槐花叶病毒的生物学特性及其外壳蛋白的分子量、氨基酸组成分析可以初步肯定我国的刺槐花叶病毒和国外报道的、以及大小相似的其他植物病毒不同,所以可能是一种未曾报道过的新病毒。     

哺乳动物细胞中不同长度非编码RNA识别靶分子的方式及生物学功能特性

非编码RNA(nc RNA)是指非蛋白质编码的其他所有RNA,大小为20~10 000 nt,广泛存在于各种生物尤其是哺乳动物细胞中。nc RNA在细胞的各种生命活动中发挥重要生物学功能。nc RNA按生物学功能特性可以分为看家nc RNA和调节性nc RNA两类,按大小可以分为小nc RNA(50 nt)、中等长度nc RNA(50~200 nt)和长nc RNA(200 nt)三类。不同长度的nc RNA与靶分子的作用方式有各自特点,从而也决定了各自具有相对独特的生物学作用。以哺乳动物细胞中常见的不同长度非编码RNA为例,对各类长度nc RNA识别靶分子的方式及生物学作用特点做一综述,以期为全面认识nc RNA的结构及生物学功能多样性提供帮助。     

超滤法及其应用

超滤法是一种根据溶液中分子的大小和形态,在埃(10~(-8)厘米)数量级选择性过滤的技术。这种方法,在一定的压力下(外源N_2压或真空泵压),使溶剂和较小分子的溶质能通过一定孔径的薄膜,大分子的溶质则不能透过,从而可以使高分子物质脱盐、脱水和浓缩;在一定的条件下,还可以起到分离和纯化的作用。从另一角度来看,超滤也可以认为具有溶液相的分子筛作用,根据所用超滤膜的型号不同,可以在分子量500—100,000内进行筛分。     

应用免疫技术纯化特异性mRNA

真核基因表达的调控的研究,是分子生物学最活跃的领域之一。为了深入地对这一问题进行研究,分离特定蛋白质的信使RNA(mRNA)及其基因(DNA)是非常之必需。由于mRNA分子的长度随其所编码的多肽链的长度不同而有很大的差别,因此按其分子量的大小和密度,通过密度梯度超离心的方法,从理论上来说可以得到不同的mRNA。然而到目前为止,用此法只从特定组织或细胞中分离纯化几种蛋白质的mRNA,如分别从网织红血球、蚕丝腺以及早期海胆胚及同步的Hela细胞中分离纯化了血红蛋白、丝蛋白及组蛋白等mRNA,由于这些mRNA多半是这些组织和细胞中mRNA     

低能量激光对造血细胞的增殖作用

激光能刺激造血细胞增殖,促使粒-巨噬细胞集落形成单位(GM—CFUc)增多。从人脐带血中分离制备的有核细胞,加入集落刺激因子(CSF)后,形成的GM—CFUc为18.6±12.6/10~4;如果加入的CSF是经激光照射后的细胞制成的,其GM—CFUc为40.5±20.2/10~4;若先用激光照射脐带血的有核细胞,在培养时加入的是未经激光处理细胞制成的CSF,也有增殖效应,GM—CFUc为36.5±18.5/10~4;如果脐带血有核细胞和制备CSF的细胞都用低能激光照射,就可以见到GM—CFUc明显地增多,其值为57.4±41.2/10~4是未经激光处理者的三倍。表明激光照射脐带血有核细胞及制备CSF的细胞均可使GM—CFUc增殖。     

离心法分离毕赤酵母活细胞和死细胞

本文以毕赤酵母为研究对象,探索出一种分离活酵母细胞的新方法。研究发现,通过改变淋巴细胞分离液和50%聚蔗糖溶液的比例,获得不同密度的酵母细胞分离液,进而通过离心分层的方法可使毕赤酵母活细胞主要存留于离心液的上层。当酵母细胞分离液的密度为1.1467 g/mL (27.5%淋巴细胞分离液+72.5%聚蔗糖溶液),分离液上下层中酵母活细胞的分配比例差别达到最大,分别为94.67%(分离液上层)和5.33%(分离液下层)。毕赤酵母细胞浓度为4.35×108~1.13×109/mL时,活细胞在分离液上下两层的分配比例约为95%和5%。低毕赤酵母细胞存活率有利于离心分离。本方法可用于有效分离培养液中的毕赤酵母活细胞。     

免疫磁珠分离淋巴细胞在流式交叉配型试验中的应用及研究

目的探讨免疫磁珠快速分离法及密度梯度离心(Ficoll)分离法分离外周血单个核细胞(PBMC)在流式细胞交叉配型中的应用比较。方法取10例交叉配型供体外周抗凝血各10 ml,受体非抗凝血5 ml,分别采用密度梯度离心与免疫磁珠阴性选择试剂盒从相同体积的抗凝血中分离PBMC。用血细胞计数比较两种方法分离的WBC、PLT、RBC粒度分布和PBMC中淋巴细胞的纯度;用细胞流式和淋巴细胞表面标记荧光抗体检测两种方法分离得到的PBMC中T、B和NK细胞的数量质量;将免疫磁珠阴性分离和密度梯度离心法分离的供者PBMC与受者血清共孵育,加入羊抗人IgG-FITC,洗涤后加入抗人CD3-PE、抗人CD19-APC单克隆抗体,再用流式细胞仪检测细胞表面荧光强度。采用方差分析和t检验进行统计学分析。结果免疫磁珠阴性分离的PBMC数量是Ficoll分离PBMC的0.42倍,但淋巴细胞的比例[(99.2±0.08)﹪]高于PBMC分离的淋巴细胞比例[(82.5±5.27)﹪(t=9.91,P0.01)],且两种方法分离的PBMC中RBC分别为(0.001±0.001)×10~6/μl和(0.02±0.009)×10~6/μl(t=6.64,P0.001);血小板的数量分别为(1.00±0.05)×10~3/μl和(196.00±4.21)×10~3/μl差异均有统计学意义(t=146.46,P0.01)。流式细胞检测免疫磁珠分离的PBMC中CD3~+T细胞为(81.33±4.60)﹪,CD19~+B细胞为(8.41±0.87)﹪,CD3-CD56~+NK细胞为(9.35±0.67)﹪和CD3~+CD56~+NKT细胞为(2.47±0.07)﹪。而Ficoll分离的PBMC中CD3~+T细胞为(37.36±3.27)﹪,CD19~+B细胞为(5.79±0.94)﹪,CD56~+NK细胞为(6.60±0.91)﹪,且差异均有统计学意义(t=24.64、6.470、7.70、51.31,P均0.01)。T和B淋巴细胞流式交叉配型试验中,设门定量读取T和B淋巴细胞与受者血清中抗体结合情况,密度梯度离心获得的淋巴细胞中混有血小板等,使流式检测结果中会混有假阴性,而免疫磁珠分离法没有出现假阴性结果。证明免疫磁珠分离的PBMC可应用于临床交叉配型试验。结论免疫磁珠阴性选择分离全血PBMC,用时短,纯度高,去除了99﹪的血小板,不混有红细胞、血小板,是一种优于Ficoll分离PBMC的新方法。     

hLCN6单克隆抗体偶联免疫磁珠用于混合细胞中精子的分离与法医学鉴定

hLCN6 (Human lipocalin 6)是附睾特异性分泌蛋白,它能与精子结合,对精子的成熟发挥着重要作用。为了探究应用抗hLCN6单克隆抗体偶联免疫磁珠技术分离混合细胞中精子的可行性,建立混合斑中精子细胞分离的新方法,制备了不同比例的精子-上皮细胞混合悬液及混合斑样本,以生物素标记的hLCN6单克隆抗体孵育样品,再用亲和素包被的免疫磁珠捕获分离精子细胞,提取精子DNA进行PCR-STR (Short tandem repeat)分型,同时以差异裂解法提取精子,比较两者的差异。经ELISA检测,hLCN6单克隆抗体与抗原的亲和力解离常数(Kd)为3.47×10~–9 mol/L。免疫印迹和免疫荧光结果显示,hLCN6在精子中可检测到,主要定位于精子头部的顶体后区域,但不能在上皮细胞中检测到。hLCN6抗体偶联的免疫磁珠复合物能够实现精子细胞的捕获和分离,显微镜观察显示免疫磁珠能够与精子头部特异性结合。对精子个数为10~3/mL的混合悬液,STR分型成功率(正确分型13个以上,RFU200)为90%。当精子数量≥10~4/mL时,分型成功率达10~0%;对精子数分别为10~3/mL、10~4/mL、10~5/mL的混合斑STR分型成功率分别为40%、90%和10~0%。综上,hLCN6抗体偶联免疫磁珠法可以有效分离混合细胞中的精子,分型成功率高于传统的差异裂解法。该方法简单高效,可作为性侵案件中法医混合斑检验的有效补充手段。     

哺乳动物腺苷酸环化酶的表达调控与功能

腺苷酸环化酶(adenylate cyclase,AC)能够直接催化ATP(adenosine triphosphate)生成第二信使c AMP(cyclic AMP),参与调节细胞一系列信号应答反应。在哺乳动物中,AC由10个不同基因分别编码的异构体组成的,其中包括9种整合膜蛋白(AC1~9)和1种可溶性蛋白(AC10),它们之间在不同器官组织或细胞中的表达与分布特征及其调控机制存在差异,能够发挥多种多样的生理功能,并对健康与疾病发生具有显著影响。该文就腺苷酸环化酶的研究进展作一综述。     

球毛壳菌CIB-160次生代谢产物的分离鉴定及其免疫活性

采用硅胶柱层析、HPLC、Sephadex LH-20凝胶柱层析等分离方法对球毛壳菌CIB-160的次生代谢产物进行纯化,得到10个化合物。通过NMR、HR-MS和旋光数据分析以及文献比对,其结构鉴定为chaetoglobosins A(1)、C(2)、E(3)、F(5)、Fex(6)、W(7),penochalasin F(4),5-(methyl-2-butenyl)-indole-2,3-dione(8)、chaetoviridin A(9)和cochliodone A(10)。8和10为首次从野生型球毛壳菌代谢物中分离得到的化合物。体外免疫活性检测显示1~6对小鼠脾细胞的增殖具有抑制作用,IC50值分别为0.21、2.8、2.3、2.2、1.7、2.7μM。同时1~6具有较强的细胞毒性,对静息小鼠脾细胞存活率IC50值分别0.82、7.5、2.3、6.1、4.6、6.7μM。     

核孔复合体

真核生物间期的细胞中,可以观察到由二层核膜围绕的细胞核。核膜不是一个完全封闭的膜体系,而是由内外二层核膜局部融合形成许多小孔,称为核孔,核孔及其周围的复杂结构统称核孔复合体(Nuclear pore complex,以下简称NPC),有时人们也把核孔作为NPC的同意词。NPC担负着细胞核与细胞质之间繁忙的运输大分子或颗粒物质的任务,而小分子和离子的通透主要是由核膜调节的。在快速生长的细胞中,每分钟要把约10~4个核糖体大小亚基从细胞核的核仁运到细胞质中以满足蛋白质合成的需要。在S期的细胞中     

肾小球系膜细胞株的建立及影响其生长的因素

利用肾小球细胞外生长能力的差异,从SD大鼠肾小球中成功分离肾小球系膜细胞(MC)后,探索了培养MC的适宜条件;观察了胰岛素、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、内皮素(ET-1)和肿瘤坏死因子(TNFα)对MC增殖的影响。结果表明,四种因子均可显著促进MC增殖(P<0.01),其中bFGF作用最强。当胰岛素和bFGF、TNFα或低浓度ET-1(≤10~(-8)mol/L)共同作用于MC时,其促MC增殖显示正协同作用(P<0.01,P<0.05);与高浓度ET-1(≥10~(-7)mol/L)共同作用于MC时,呈负协同作用(P>0.05)。     

临床级脐带间充质细胞制备及鉴定方法研究

目的在GLP实验室中制备并鉴定临床级脐带间充质细胞(UC-MSC)。方法新鲜获取的脐带去除血管并进行充分清洗,获得的华通胶(Wharton’s jelly)机械分离后分别进行直接贴壁法和不同的酶消化法,比较获取UC-MSC的数量差别;用不同的无血清培养基进行培养比较细胞形态是否良好,得到最佳形态的UC-MSC。体外培养第3代后进行UCMSC质检,包括细胞活性,生长曲线,无菌检测,人类相关病毒、支原体、内毒素检测,染色体核型分析,FACS免疫表型检测及分化能力检测。不同消化方法获取细胞数之间比较采用两样本配对t检验。结果胶原酶Ⅱ消化获得的UC-MSC数(5.3×10~6±0.58个/ml)与胶原酶Ⅰ+0.25﹪胰酶消化法(2.53×10~5±0.03个/ml)及直接贴壁法(2.6×10~5±0.05个/ml)之间差异有统计学意义(P0.05),与胶原酶Ⅰ消化法获取细胞数(5.1×10~6±0.57个/ml)之间差异无统计学意义(P=0.07),但培养视野最干净;Mesen Cult-ACF Medium培养获得的UC-MSC形态最佳;UC-MSC质检细胞活性冻存前达99.8﹪,冻存复苏后达99﹪;无细菌、支原体、乙肝病毒、丙肝病毒、梅毒螺旋体、艾滋病毒、肺炎支原体、EB病毒、巨细胞病毒污染;内毒素检测结果均1 EU;CD73/CD90/CD10~5阳性率达98﹪,CD34/CD45/HLA-DR呈阴性,阳性率2﹪;染色体核型分析无突变或缺失;UC-MSC具有成脂、成骨或成软骨方向分化的能力。结论通过优化分离和培养条件,采用无血清及无动物来源的培养系统,在GLP实验室内可获得临床级UC-MSC。     

人轮状病毒的细胞培养分离

用CV-1细胞从急性腹泻病儿7份粪便标本中直接分离出4株人轮状病毒(HRV),并适应传代14代。感染细胞出现特征性细胞病变,经电镜、ELISA、免疫荧光染色及病毒RNA电泳等试验证实HRV毒株在CV-1细胞中的繁殖及抗原特异性。病毒滴度为10~(6.0)TCID_(60)。分离的4株HRV毒株均为RNA电泳型长型,经CV-1细胞传7～14代后,RNA图型与原粪样相比未见变异。