GST—talinl融合蛋白的原核表达及纯化

应用PCR方法扩增talinl的cDNA,并将其重组入谷胱甘肽转硫酶融合基因表达载体pGEX-4T-1中,获取人源的GST—talinl融合蛋白,为下阶段深入的研究talinl的结构、功能、及其与之相互作用的蛋白打下基础。经酶切、序列鉴定．选择正确重组子,将其质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达,用Glutathione Sepharose 4B柱纯化,western blot鉴定。克隆得到了一个2400bp的talinl的cDNA片断,重组质粒目的DNA测序正确,纯化出分子量约为121、6kD的融合蛋白。用基因工程方法使GST—talinl重组质粒在原核细胞表达并成功纯化出GST—talinl融合蛋白。     

GST-HRB融合蛋白的表达与纯化

构建GST-HRB重组质粒,进行融合蛋白的表达、纯化及鉴定.利用PCR扩增及基因重组技术,以pcDNA-3.1-HRB为模板扩增出HRB全基因序列,并将其插入带有GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签的原核表达载体pGEX-6P-1中,构建GST-HRB融合蛋白表达质粒.然后,将重组质粒GST-HRB转化至大肠杆菌Rosseta进行融合蛋白的表达.利用GST琼脂糖珠进行融合蛋白的纯化,最后应用SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定纯化的融合蛋白.结果表明,成功构建pGEX-6P-1-HRB原核表达载体,表达及纯化了GST-HRB融合蛋白.     

重组原核质粒GST-hTudor-SN-SN（1～4）的构建及表达

目的 将人类Tudor-SN（tudor staphylococcal nuelease）蛋白SN（1～4）基因片段分别定向连入pGEX-4T-1质粒,使Tudor-SN蛋白sN各功能片段与（;＂蛋白在大肠埃希菌BL21细胞内融合表达.方法 以重组质粒pSG5-Tudor-SN-flag为模板,PCR法扩增出目的 基因,利用EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切法将目的 片段连接纠pGEX-4T-1载体卜,再将构建成功的GST-hTudor-SN-SN（1～4）重组质粒转化人大肠埃希菌BL-21内,IPTG诱导表达后再以考马斯亮蓝染色法检测GST融合蛋白的表达.结果 以单/双酶切和基因测序法鉴定构建的重组质粒均无误,考马斯亮监染色法观察到GST融合蛋白的正确表达.结论 重组原核GST.hTudor-SN-SN（1-4）质粒成功构建和表达.     

人抗酶抑制因子-1的克隆与原核表达

目的:克隆人抗酶抑制因子-1(ornithine decarboxylase antizyme inhibitor-1,OAZI-1)cDNA,建立在大肠杆菌中原核表达并纯化人OAZI-1蛋白的实验技术。方法:巢式RT-PCR法从人A549总RNA中扩增人OAZI-1 cDNA并构建pET-28a/OAZI-1原核表达质粒。该质粒转化大肠杆菌原核表达菌BL21(DE3)后IPTG诱导表达。诱导表达出的重组蛋白用Ni-NTA树脂亲和层析纯化。SDS-PAGE和Western法检测重组OAZI-1蛋白的表达和纯化。结果:成功克隆出编码全长人OAZI-1的cDNA序列,并构建出原核表达质粒pET-28a/OAZI-1。DNA测序分析,重组质粒中的OAZI-1 cDNA无突变,与6×His标签框架对接正确。重组质粒转化入大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中后,可用IPTG诱导表达出重组OAZI-1蛋白,该重组蛋白可用Ni-NTA树脂亲和层析纯化。结论:成功建立了人抗酶抑制因子的原核表达和纯化的实验方法,为后续OAZI-1的功能研究奠定了基础。     

风疹病毒(RV)包膜糖蛋白E1特异基因片段的原核表达

目的:表达风疹病毒(RV)E1特异肽段的重组融合蛋白.方法:经过双酶切鉴定和测序鉴定的阳,陛重组质粒载体pGEX-2T/E1-N,转化到感受态大肠杆菌BL21后,用异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导其表达,并对诱导条件进行优化.用谷胱甘肽琼脂糖珠纯化重组融合蛋白,SDS-PAGE鉴定.结果:用IPTG可以诱导E1特异肽段的重组融合蛋白表达,37℃诱导时,最佳诱导剂浓度为1 mmol/L,最佳诱导时间为4h.诱导温度从37℃降至16℃时,重组融合蛋白以可溶性形式表达,用谷胱甘肽琼脂糖珠纯化获得了纯化的重组融合蛋白.结论:利用原核表达系统可以获得纯化的风疹病毒E1特异肽段的重组融合蛋白.     

人乳头瘤病毒58型E6E7融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的:构建pET-42a(+)-HPV58E6E7原核表达质粒,诱导表达人乳头瘤病毒(HPV)58型E6E7融合蛋白。方法:采用PCR方法扩增出HPV58 E6E7融合基因的全长序列,利用DNA重组技术将其定向插入原核表达载体pET-42a(+)中,构建pET-42a(+)-HPV58E6E7原核表达质粒,用限制性内切酶酶切和核酸序列检测对重组质粒进行鉴定;将其转入宿主菌大肠杆菌BL21进行诱导以表达HPV58E6E7融合蛋白,并用谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化回收HPV58E6E7融合蛋白,用SDS-PAGE及Western印迹鉴定表达蛋白的相对分子质量及抗原性。结果:PCR、限制性内切酶酶切和核酸序列检测证实重组质粒中插入的目的基因大小、方向正确;HPV58E6E7融合蛋白得到高效原核表达及纯化,表达蛋白的分子大小正确,抗原性良好。结论:pET-42a(+)-HPV58E6E7原核表达质粒构建成功,HPV58E6E7融合蛋白得到高效表达及有效纯化,为检测HPV58型治疗性疫苗的免疫效果提供了抗原。     

半乳糖凝集素-1的融合克隆及纯化

目的：表达和纯化半乳糖凝集素-1融合蛋白。方法：用PCR方法从乳腺文库中扩增半乳糖凝集素-1编码序列,将其以正确相位与pGEX-KG载体中的GST编码序列融合,将重组质粒转化大肠杆菌DH5α后,用谷胱甘肽-Sepharose 4B纯化融合蛋白,并用Western印迹检测融合蛋白的表达。结果：构建得到半乳糖凝集素-1的融合蛋白表达载体;Western印迹检测表明,GST-半乳糖凝集素-1融合蛋白成功表达,并纯化得到融合蛋白。结论：克隆和表达了半乳糖凝集素-1基因,并得到纯化的融合蛋白。     

无标签重组人硫氧还蛋白的大规模表达、纯化及活性检测

目的:利用基因工程的方法原核表达无标签的重组人硫氧还蛋白(rhTrx)并对其进行大规模表达、纯化和鉴定.方法:从人胚胎肾HEK293细胞中提取总RNA,反转录合成cDNA,经PCR扩增、酶切后连入pET-22b(+)载体构建重组质粒,重组质粒转化大肠杆菌BL21( DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,经两步离子交换层析纯化重组蛋白,采用SDS-PAGE、Western blotting、HPLC、MALDI-TOF-MS及经典的胰岛素二硫键还原法对重组蛋白进行鉴定.结果:构建成功了rhTrx基因表达载体;实现了rhTrx在原核细胞中的可溶性表达;纯化出的蛋白经SDS-PAGE和Western blotting分析证实为rhTrx;HPLC和MALDI-TOF-MS分析表明,纯化出的目的蛋白纯度大于95％;胰岛素二硫键还原法证实纯化出的rhTrx具有生物学活性.结论:成功构建了rhTrx的原核表达体系,建立了rhTrx的纯化和鉴定方法,为其进一步的理论研究和生产开发提供了有效基础数据.     

Memo蛋白的融合表达和纯化

目的:一些临床预后较差的恶性肿瘤一般具有很高的转移性和侵袭性,近来的研究表明,Memo蛋白与恶性肿瘤的这些特性有十分密切的关系。本研究拟克隆、融合表达和纯化Memo蛋白。方法:用PCR方法从乳腺文库中扩增Memo蛋白编码序列,并将其以正确相位与pGST载体中的GST编码序列融合,构建成重组质粒pGST-Memo。将此重组质粒转化大肠杆菌DH5α后,用谷胱甘肽-Sepharose4B纯化融合蛋白,并用Western印迹检测融合蛋白的表达。结果:构建了Memo蛋白的融合表达载体,并在大肠杆菌DH5α中得到表达,经谷胱甘肽-Sepharose4B亲和层析获得了纯化的GST-Memo融合蛋白。Western印迹检测表明,此蛋白可与GST抗体反应。结论:Memo蛋白的克隆、融合表达和纯化,为进一步研究恶性肿瘤的转移性、侵袭性及其相关机理提供了有用的材料。     

山羊Klf4基因克隆、原核表达和His-Klf4融合蛋白纯化北大核心CSCD

旨在克隆山羊Klf4基因,构建重组质粒pET30a-Klf4,通过原核表达技术获得纯化的His-Klf4融合蛋白。从山羊的生殖脊中提取总RNA,用RT-PCR的方法扩增Klf4基因编码区序列,通过TA克隆构建pMD18-T-Klf4重组质粒。酶切鉴定与测序分析后将Klf4的cDNA亚克隆至pET-30a载体,构建重组质粒pET30a-Klf4。酶切鉴定后将其导入大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting检测确认,镍离子金属螯合亲和层析法纯化His-Klf4融合蛋白。结果表明:(1)从山羊生殖脊中克隆了Klf4基因,其开放阅读框由1 434个核苷酸组成,编码478个氨基酸,而且该序列与绵羊的同源性最高,达到98.5%;(2)经过SignalP 4.0在线分析,Klf4的编码蛋白不存在信号肽;(3)经SDS-PAGE和Western blotting分析表明,重组质粒pET30a-Klf4在大肠杆菌中得以表达;在变性条件下纯化,获得了His-Klf4融合蛋白。