硫腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及其在盐胁迫条件下的不同表达

硫腺苷甲硫氨酸作为甲基供体在转甲基反应中起到重要作用.为了解硫腺苷甲硫氨酸在盐地碱蓬(Suaedasalsa (L.)Pall)耐盐中的作用,我们对可能编码硫腺苷甲硫氨酸合成酶的基因(SsSAMS2)进行了分析.该基因在经400 mmol/L NaCl处理的盐地碱蓬地上部分的λ-Zap cDNA文库中克隆到,其插入片段全长1 531 bp,包含一个395个氨基酸的开放阅读框架,该基因推断的分子量约为43 kD.SsSAMS2与长春花(Catharanthus roseus)的SAMS2在氨基酸水平上的一致性为93%.Southern杂交显示,SsSAMS2在盐地碱蓬基因组中可能是两个拷贝.Northern分析显示硫腺苷甲硫氨酸合成酶基因受NaCl等胁迫的正调控.酶活性检测表明,NaCl胁迫条件下该酶活性增强.     

盐胁迫下过量表达腺苷甲硫氨酸合成酶基因的转基因烟草的生长

以转腺苷甲硫氨酸合成酶基因（SsSAMS2）烟草纯合子ST8-9为实验材料,研究盐胁迫下过量表达SsSAMS2对转基因烟草生长影响的结果表明,200mmol·L-1NaCl处理后的转基因烟草的光合速率和生物量都比野生型烟草高,积累的自由多聚胺比较多,同时精氨酸脱羧酶的转录本也更丰富。显示转基因烟草的耐盐性比野生型烟草高,多聚胺在烟株缓解盐胁中可能是起了重要作用。     

腺苷甲硫氨酸合成酶的提取纯化研究

腺苷蛋氨酸具有转甲基、转硫和转氨丙基等重要生理作用,已成为治疗疾病的重要药物。目的：为腺苷蛋氨酸合酶的基因克隆做准备。方法：研究了腺苷甲硫氨酸合成酶的提取和纯化。腺苷蛋氨酸合酶为胞内酶,其提取需先进行细胞破碎,然后进行盐析和离子交换层析等方法来纯化。酵母的破壁试验考察了研磨、加入有机溶剂和超声波等不同的破碎方法。结果：超声波破碎法最好,得到粗酶液的酶活力为0．934U／ml;经过硫酸铵盐析后,利用离子交换层析法纯化腺苷甲硫氨酸合成酶,作出了腺苷甲硫氨酸合成酶的穿透曲线和洗脱曲线。     

S-腺苷甲硫氨酸合成酶在大肠杆菌中的克隆与表达

目的:克隆与表达大肠杆菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶的基因。方法:应用PCR技术从E.coliBL21(DE3)的总DNA中扩增出1.1kb的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因,将其连接到PGEMT载体上,测序证明正确后再将目的基因插入大肠杆菌高表达载体PET28a中,含有目的基因的重组质粒在大肠杆菌中进行表达与分析。结果:SAM合成酶在E.coliBL21(DE3)中的表达量达到23.6%,酶活达到4.17μmol/h.ml。结论:大肠杆菌表达出了具有生物活性的S-腺苷甲硫氨酸合成酶。     

烟草中一条新的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及表达分析

利用差异显示技术从烟草中分离到一个受乙烯利诱导表达的cDNA片段,结合RACE扩增技术获得该基因的全长序列。该全长cDNA共含1350个碱基,编码区有1170 bp,通过GenBank同源性比较发现它与一条已知的烟草S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS1,EC2．5．1．6)的基因编码区存在90％的同源性,编码的氨基酸顺序96％同源,而在cDNA的5’及3’非编码区同源性很低,且有一些短片段的缺失。设计合适的引物分别对这两个SAMS基因进行RT-PCR分析表明,SAMS1基因受高温诱导表达增强,但不受甲基紫晶诱导的氧化胁迫及盐胁迫影响,而新分离到的这个基因(SAMS2)的表达同时受高温、甲基紫晶及高盐3种胁迫的诱导。     

盐地碱蓬过氧化氢酶基因的克隆及盐胁迫下的表达分析

过氧化氢酶是清除H2O2的重要酶类,从400mmol/LNaCl处理的盐地碱蓬（Suaeda salsa(L.)Pall)地上部分的cDNA文库中克隆了两个编码过氧化氢酶的cDNA(Sscat1和Sscat2)。其中Sscatl(1.7kb)是一个全长cDNA克隆,编码一个492个氨基酸的开放阅读框架。而Sscat2(1.1kb)是一个cDNA片段。据编码Sscatl3′端的287个氨基酸的cDNA序列与Sscat2的cDNA序列进行的BLAST同源性分析表明,Sscat1和Sscat2在核苷酸水平的一致性则为一个单拷贝基因。Northern杂交结果表明在盐胁迫条件下Sscat1和Sscat2的表达存在差异;400mmol/LNaCl处理48h的盐地碱蓬根中的Sscat1和Sscat2mRNA水平比对照显著提高,但是在叶中仅Sscat1受盐诱导表达,不同盐处理时间下的表达分析也证实。在盐地碱蓬叶中仅Sscat1受盐诱导表达。这说明Sscat1和Sscat2在盐地碱蓬中是差异调控的,生理分析表明过氧化氢酶的活性在盐胁迫条件下显著提高。     

盐地碱蓬过氧化氢酶基因的克隆及盐胁迫下的表达分析

过氧化氢酶是清除H2O2的重要酶类.从400 mmol/L NaCl处理的盐地碱蓬(Suaeda salsa(L.)Pall)地上部分的cDNA文库中克隆了两个编码过氧化氢酶的cDNA(Sscat1和Sscat2),其中Sscat1(1.7kb)是一个全长cDNA克隆,编码一个492个氨基酸的开放阅读框架,而Sscat2(1.1kb)是一个cDNA片段.据编码Sscat1 3＇端的287个氨基酸的cDNA序列与Sscat2的cDNA序列进行的BLAST同源性分析表明,Sscat1和Sscat2在核苷酸水平的一致性为71.9%,在氨基酸水平上的一致性为75%.Southem杂交表明,Sscat1在盐地碱蓬基因组中为多拷贝基因,Sscat2则为一个单拷贝基因.Northern杂交结果表明在盐胁迫条件下Sscat1和Sscat2的表达存在差异:400 mmol/L NaCl处理48h的盐地碱蓬根中的Sscat1和Sscat2 mRNA水平比对照显著提高,但是在叶中仅Sscatl受盐诱导表达.不同盐处理时间下的表达分析也证实,在盐地碱蓬叶中仅Sscat1受盐诱导表达.这说明Sscat1和Sscat2在盐地碱蓬中是差异调控的.生理分析表明过氧化氢酶的活性在盐胁迫条件下显著提高.     

S-腺苷甲硫氨酸代谢途径相关基因在小麦水分胁迫中的表达

以小麦品种‘晋麦47’为材料,利用半定量RT-PCR方法,对S-腺苷甲硫氨酸代谢途径中的S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基因、S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(SAMDC)基因和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(-γECS)基因在正常供水、PEG-6000模拟水分胁迫和复水过程中小麦叶片的表达模式进行了分析。结果表明,3个基因在正常生长情况下有一定量的表达,SAMS和SAMDC基因在水分胁迫早期(PEG-6000胁迫6、12、244、8 h)上调表达,水分胁迫后期(PEG-6000胁迫75 h)表达量下降;复水后3~6 h上调表达,复水9 h后表达量下调至对照水平。-γECS基因在水分胁迫阶段呈上调表达,复水后表达量下调至对照水平。可见,小麦SAMS、SAMDC和-γECS基因的表达都受水分胁迫诱导,同时,SAMS与SAMDC基因还参与水分胁迫后的复水调节,说明S-腺苷甲硫氨酸代谢途径在小麦抗旱节水中具有重要作用。     

盐地碱蓬(Suaeda salsa)APX 基因的克隆及盐胁迫下的表达

从盐地碱蓬 (Suaedasalsa)中克隆了抗坏血酸过氧化物酶 (ascorbateperoxidase ,APX)的全长cDNA(SsAPX) ,基因注册号为AY0 34 893。SsAPX全长 1.1kb ,推导的氨基酸序列长为 2 5 0个氨基酸残基。BLAST同源性分析表明 ,该cDNA与已报告的菠菜(Spinaciaoleracea)细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因同源性最高 ,在核苷酸水平上一致性为 87% ,在氨基酸水平上一致性为 89%。Southern杂交表明APX基因在盐地碱蓬基因组中只有 1个拷贝。盐 (NaCl 40 0mmol/L)处理不同时间后的Northern杂交分析表明盐地碱蓬中SsAPX基因在盐胁迫下表达量增加 ,而且在盐胁迫下抗坏血酸过氧化物酶的活性也显著地增加 ,说明该基因受盐诱导。推测抗坏血酸过氧化物酶可能在保护盐地碱蓬免受氧化损伤的过程中起到一定作用     

过表达S-腺苷甲硫氨酸合成酶及优化碳源高产洛蒙真菌素

洛蒙真菌素是由洛蒙德链霉菌S015合成的天然吩嗪类化合物,该化合物具有广谱抑菌活性及抗肿瘤活性,但因其在野生菌株中的产量较低而限制了应用.为了提高洛蒙真菌素产量,探究相关基因功能及S015菌株发酵条件,本研究首先建立系统进化树分析内源S-腺苷甲硫氨酸合成酶MetK,其次在野生型S015中过表达metK基因,最后通过动态发酵实验进行碳源优化.研究结果表明,过表达metK基因的菌株洛蒙真菌素产量达到(27.4±2.8)mg/L,是野生株的2.3倍;通过发酵优化,以20 g/L的木糖为碳源时洛蒙真菌素产量最高,为(130.6±8.0)mg/L,是优化前的4.8倍.本研究成功采用上游基因工程改造结合下游发酵优化的生物工程手段,有效地提高了菌株S015中洛蒙真菌素的产量.     

盐地碱蓬(Suaeda salsa)中SsINPS基因的分子克隆及表达特性分析

肌醇 1 磷酸 (I 1 P)合成酶 (EC5 .5 .1 .4,INPS)是肌醇生物合成中的关键酶 ,催化葡萄糖 6 磷酸 (G 6 P)到I 1 P的反应。从该实验室已构建的NaCl40 0mmol/L处理的盐地碱蓬 (Suaedasal sa)cDNA文库中克隆了肌醇 1 磷酸合成酶的全长cDNA (S .salsamyo inositol 1 phosphatesynthase,SsINPS) ,基因注册号为AF43 3 879。SsINPS全长约 1 986bp ,含有开放式阅读框架 1 5 3 0bp ,3′和 5′的非翻译区分别为 1 3 9bp和 3 1 7bp ;推导的氨基酸序列全长 5 1 0个氨基酸残基 ,分子量约为 5 6 .7kD ,pI值为 5 .3 5。BLAST同源性分析表明 ,该cDNA与已报告的冰叶日中花 (Mesembryanthemumcrys tallinum)的INPS基因同源性最高 ,其中 ,核苷酸水平的同源性为 91 % ,氨基酸水平上的同源性为84%。以SsINPS全长cDNA为探针进行的South ern杂交结果表明 ,SsINPS基因在盐地碱蓬基因组中只有一个拷贝 ;Northern结果表明 ,在盐处理(40 0mmol/L的NaCl)下 ,SsINPS在叶中的表达量有显著的增加。从而说明SsINPS在盐胁迫下是上升调节的     

盐地碱蓬GST基因的克隆、序列分析及其表达特征

从盐地碱蓬 (Suaedasalsa)幼苗的cDNA文库中克隆到一个 0 .9kb的全长cDNA ,同源性分析表明该全长cDNA与已报告的大豆 (Glycinemax)GST基因相应序列的同源性达 5 5 % ,可能编码由 2 35个氨基酸组成的谷胱甘肽转移酶 (glutathioneS transferase ,GST)。Southern杂交结果证明GST基因在碱蓬基因组中可能有至少两个以上的拷贝 ;Northern杂交结果表明 ,4 0 0mmol/L的NaCl处理 4 8h ,幼叶中GSTmRNA的表达量是对照的 2～ 3倍 ,说明碱蓬中GST基因受盐诱导     

盐胁迫下盐地碱蓬叶片液泡膜H+-ATPase H 亚基的克隆与表达分析

利用EST随机挑取克隆测序的方法从盐地碱蓬叶片cDNA文库中分离得到了盐地碱蓬V-H -ATPase H亚基cDNA序列,并进行了H、c亚基基因表达及V-H -ATPase活性分析.结果表明,H亚基基因全长1 969 bp,包括100 bp的5′-非编码区和471 bp的3′-非编码区.开放阅读框为1 398 bp,编码465个氨基酸残基,分子量约52.8 kD.N orthern杂交分析表明盐胁迫明显诱导了H亚基表达,而且盐胁迫下H、c亚基及V-H -ATPase活性存在协同作用.这些结果表明盐胁迫下H和c亚基基因上调及V-H -ATPase活性的增加为N a 区隔化到液泡中提供了质子驱动力.     

盐地碱蓬叶片液泡膜H^＋—ATPase B亚基的克隆及盐胁迫下表达分析

植物液泡膜H^ -ATPase在建立跨液泡膜质子梯度、促进液泡Na^ 区域化、提高植物耐盐性方面发挥着重要作用。本实验从盐生植物盐地碱蓬(Suaeda salsa L.)cDNA文库分离到碱蓬叶片液泡膜H^ -ATPase B亚基cDNA克隆。测序表明该基因长达1974bp,开放阅读框有1470bp编码489个氨基酸,含有一个保守的ATP结合位点,其蛋白分子量约为54．29kD。Northern及Western印迹表明盐地碱蓬液泡膜H^ -ATPase B亚基表达明显受NaCl胁迫诱导,并且在NaCl胁迫下,B亚基在转录及翻译水平上与液泡膜H^ -ATPase c亚基存在协同作用。盐胁迫下,盐地碱蓬液泡H^ -ATPase B亚基与c亚基的协同表达增加了液泡H^ -ATPase的数量,从而提高了液泡H^ -ATPase活性,为碱蓬叶片液泡Na^ 区域化提供了动力,最终提高了碱蓬植株的耐盐性。     

碱蓬cDNA表达文库的构建

以盐生植物盐地碱蓬（Suaeda salsa)地上部分为材料,提取植物总RNA,纯化出mRNA,合成cDNA第一链,得到双链cDNA后,连接入植物表达载体,构建cDNA表达文库。该文库重组子约10^6。将该文库转化农杆菌GV3101,可直接用以转化拟南芥。     

NaCl胁迫下外源NO供体硝普钠（SNP）对盐地碱蓬种子萌发的影响

用添加与不添加0．1mm01．L^-1NO供体硝普钠（sNP）的800mmol．L^-1NaCl溶液处理盐地碱蓬种子后,800mmol·L^-1NaCl处理下盐地碱蓬种子的萌发率、含水量和吸水速率显著增加,胚中脯氨酸的含量降低,但对Na^＋、K^＋和可溶性糖含量无显著影响。表明0．1mmol．L^-1SNP缓解800mmol．L^-1NaCl对盐地碱蓬种子萌发抑制的主要原因是盐地碱蓬种子含水量的提高,从而缓解了盐的渗透胁迫。